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Medicine

Un modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine chez le poisson zèbre adulte

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
* These authors contributed equally

Summary

On décrit ici une méthode pour générer un modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine dans adult poisson zèbre (Danio rerio). Deux autres moyens d’injection intrapéritonéale sont présentés et conditions afin de réduire les écarts entre les différents groupes expérimentaux sont discutées.

Abstract

Le poisson-zèbre adult génétiquement accessible (Danio rerio) a servi plus en plus comme un modèle de vertébrés pour la compréhension des maladies humaines telles que la cardiomyopathie. En raison de sa commodité et susceptibilité aux manipulations génétiques à haut débit, la génération de modèles de cardiomyopathie acquises, tel que le modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine (DIC) chez le poisson zèbre adulte, ouvre les portes à nouvelles pistes de recherche, y compris les modificateurs de cardiomyopathie par dépistage génétique avant de découvrir. Différent du modèle DIC zebrafish embryonnaire, tant initiale aiguë et plus tard des phases chroniques de cardiomyopathie peuvent être déterminés dans le modèle de poisson-zèbre adulte DIC, permettant l’étude des mécanismes de signalisation dépendant de la scène et stratégies thérapeutiques. Toutefois, les résultats variables peuvent être obtenus avec le modèle actuel, même dans les mains des enquêteurs expérimentés. Pour faciliter la mise en oeuvre future du modèle DIC, nous présentons un protocole détaillé sur la façon de générer ce modèle DIC chez le poisson zèbre adulte et décrire les deux autres moyens d’une injection intrapéritonéale (IP). Nous continuer à discuter des moyens de réduire les variations pour obtenir des résultats fiables et de formuler des suggestions sur la façon d’interpréter correctement les résultats.

Introduction

Doxorubicine (DOX), également appelée adriamycine, a été conçu comme un médicament anti-néoplasique depuis les années 19601,2. Il est maintenant toujours activement utilisé comme un médicament chimiothérapeutique important pour un large éventail de tumeurs. Toutefois, l’application clinique des DOX est harcelée par sa toxicité dose-dépendante, surtout de cardiotoxicité caractérisée par des symptômes variables allant de changements électrocardiographiques asymptomatiques à la péricardite et décompensation cardiomyopathie 1 , 2. a ce jour, au moins trois hypothèses principales ont été soulevées pour expliquer la DIC, y compris activés réactives de l’oxygène (DRO)1,3,4,5, inhibition de la topoisomérase II-β () TOP2β)6,7et modulation du calcium intracellulaire version1,8,9. Accumulation de preuves suggère également une prédisposition génétique comme un facteur de risque essentiel pour DIC10,11,12,13. Identités de gènes associés à ces prédispositions DIC, cependant, demeurent largement inconnus. Dexrazoxane est le seul agent adjuvant approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour traiter la DIC, mais avec la mise en œuvre limitée14,15,16, soulignant la nécessité d’identifier les autres stratégies thérapeutiques. Modèles animaux de DIC on explore donc à ces fins. En raison de leur accessibilité et de simplicité, études mécanistes sur modèles DIC pourraient avoir des répercussions plus larges sur d’autres types de cardiomyopathies : pathogénie commune pouvant être partagé entre les cardiomyopathies d’étiologies différentes, surtout au plus tard les stades pathologiques17,18,19,20.

En plus de modèles de rongeurs du DIC, modèles DIC du poisson-zèbre avec des débits plus élevés ont été développés pour faciliter la découverte de nouveaux facteurs génétiques et de thérapeutique. Un modèle DIC embryonnaire a été établi chez les embryons de poisson-zèbre transparent pour le dépistage de composés thérapeutiques21. Étant donné que les cardiomyopathies sont des maladies à déclenchement adulte avec une pathogénie progressive, poisson zèbre adulte cardiomyopathie modèles ont été mis au point22,23,24,25,26. Nous avons généré le premier modèle acquis Cardiomyopathies résultant d’une anémie chronique24, suivi par DIC comme le deuxième modèle de cardiomyopathie acquis dans le poisson-zèbre adulte23. Nous avons constaté que l’injection d’un bolus de DOX dans le poisson-zèbre adulte induit cardiotoxicité qui consiste en une phase aiguë à peu près au sein de post-injection 1semaine (wpi), suivie par une phase chronique de la cardiomyopathie jusqu’après l’injection 6 mois. Tandis que Sim1 de la cible mécaniste de la rapamycine(mtor) améliore la cardiomyopathie à la phase chronique, il exagère la mortalité de poissons à la phase aiguë, soulignant la valeur du modèle adulte DIC à discerner le stade-dépendante mécanismes,23. De plus, nous avons démontré que le modèle adult de la DIC peut servir à souligner une collection de poissons zèbres insertional cardiaque (ZIC) mutants qui sont générés par une approche de mutagenèse insertionnelle axée sur le transposon27. Un pilote écran identifié 3 gènes connus cardiomyopathie ainsi que DnaJ (Hsp40) homologue, sous-famille B et membre 6 b (dnajb6b) comme nouveau DIC susceptibilité gènes28. Par conséquent, la génération du modèle DIC adulte chez le poisson zèbre a conduit à une nouvelle méthodologie qui permet systématiquement l’identification des modificateurs génétiques pour DIC, qui complète l’étude Génome-large association existante (GWAS) et le locus de caractères quantitatifs (QTL ) analyse.

Au cours de la production et la mise en œuvre du modèle DIC adult poisson-zèbre, nous avons remarqué des variations importantes entre les différents chercheurs ou même parmi les différentes injections effectuées par le même chercheur. La nature longitudinale du modèle impose des défis à l’enregistrement des résultats des différents enquêteurs et du processus de dépannage séquentiels. Pour faciliter l’utilisation de cette méthode simple de stress induisant la cardiomyopathie par la communauté scientifique, nous décrire notre protocole en détail, présentes deux types d’injection Intrapéritonéale et discuter des considérations afin de réduire les écarts entre les différents chercheurs.

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Protocol

Toutes les procédures décrites ici ont été réalisés conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. 2011), et elles ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et de la Mayo Clinic Institutional Animal Care.

1. préparation de poisson-zèbre adultes

  1. Mis en place suffisamment couples reproducteurs en traversant des réservoirs d’acquérir au moins deux fois autant que le poisson total nécessaire pour l’injection de DOX. Si comparer les poissons avec différents fonds génétiques, se reproduisent tous les poissons dans la même semaine pour assurer les contrôles appariés selon l’âge.
  2. Recueillir les embryons de poisson le lendemain matin, transférez-les sur boîtes de Petri de 100 mm et gardez-les dans un incubateur à 28,5 ° C. Garder les embryons à une faible densité (< 100 embryons/boîte de Pétri).
  3. Rafraîchir l’eau de l’embryon par jour pour éviter tout déséquilibre du sexe et supprimer manuellement les œufs morts en temps opportun à l’aide d’une pipette de transfert.
  4. Mettre le même nombre d’embryons dans chaque citerne (par exemple, 60 embryons/3 L medium tank initialement) pour assurer des contrôles appariés selon la densité.
  5. Commencer la paramécie s’alimentant à fécondation après 4 jours (dpf).
  6. Inspecter le poisson tous les jours pendant la phase juvénile. Ajuster le nombre de poissons que nécessaire pour assurer des poissons semblables densité.
  7. Quand les poissons atteignent 4 semaines d’âge, transférer jusqu'à 20 poissons dans chaque nouveau char moyen de 3 L pour la poursuite de la croissance. Commencer à nourrir les poissons avec direct artémia éclos.

2. préparation et conservation de la Solution mère de DOX

NOTE : DOX peut être acheté de bio-entreprises différentes. Le composé est généralement acquise sous forme de poudre dans des récipients de bruns foncés.

  1. Bien dissoudre la poudre dans de l’eau déionisée pour assurer qu'aucun amas ne sont visibles, avec une concentration finale de 5 mg/mL comme la solution de DOX. Aliquote 1 mL de stock DOX dans chaque tube de coffre fort-serrure de 1,5 mL. Envelopper les tubes de 1,5 mL avec du papier aluminium en aluminium pour protéger le DOX d’exposition à la lumière.
    Remarque : Exécutez cette étape sous une hotte chimique.
  2. Conserver la solution stock DOX à 4 ° C pour le stockage. Pour le stockage à long terme (> 4 semaines) de solution mère de DOX, exécuter l’option Section 3 décrit ci-dessous.

3. contrôle de la qualité de DOX utilisant des embryons de poisson-zèbre (facultatifs)

NOTE : DOX est deux et lumière-sensibles à l’humidité, donc il peut perdre son efficacité des médicaments pour la modélisation de DIC après un stockage prolongé. Pour DOX acheté auprès de différentes compagnies, ou même différents lots de la même entreprise, il est utile étalonner son efficacité des médicaments utilisant des embryons de poisson zèbre type sauvage (WT) avant d’effectuer les essais sur les poissons adultes. Cette méthode est dérivée d’un poisson zèbre déclarés embryonnaires DIC modèle21.

  1. Recueillir des embryons de poisson-zèbre WT depuis au moins 2 paires de poissons. Dechorionate embryons à 24 h après la fécondation (hpf) manuellement à l’aide d’une seringue avec une aiguille micro. Vous pouvez également traiter l’embryon avec la protéinase K à une concentration finale de 10 µg/mL pendant 10-15 min dans une étuve à 30 ° C. Rafraîchir l’eau de l’embryon après dechorionation. Retirer les embryons morts et maintenir au moins 36 embryons de chaque lot.
  2. Diluer la solution mère de DOX dans de l’eau fraîche embryon à une concentration finale de 100 µM. Le volume de solution est de 100 µL de chaque 3 embryons. Mélanger la solution diluée de DOX par vortex. La solution diluée finale devrait être une lumière, la couleur rouge.
  3. Ajouter 100 µL/puits de la solution diluée de DOX d’une plaque 96 puits propre transparente.
  4. Prendre 3 embryons de déchorionés avec une pipette en plastique et garder les embryons près de l’extrémité de l’embout de la pipette. Mettre l’embout de la pipette dans chaque puits avec solution DOX. Laisser l’extrémité de la pointe touche la solution et laisser les embryons de se baigner dans le puits.
    Remarque : Éviter les poussant les embryons, qui permettra d’ajouter plus d’eau dans le puits et de diluer la solution DOX.
  5. Actualiser la solution DOX à 48 hpf. En ce moment, observer les puits sous une loupe avec un grossissement de 10 X pour identifier les embryons morts (arrêt cardiaque) ou les embryons avec œdème. Compter et supprimer n’importe quel des embryons morts en temps opportun, sinon les embryons restants exposés à la solution avec des embryons morts peuvent mourir rapidement ainsi.
  6. Vérifier les embryons à 72 hpf et les compter. Le traitement de DOX est considéré comme « efficacité du bon médicament » si > 25 % mort (cessation des battements cardiaques) peut être observée dans les deux lots d’embryons.

4. préparation avant injection

Remarque : Poisson de 8 semaines à 6 mois d’âge est utilisés pour l’injection de DOX. Le poids corporel (BWs) d’un poisson sauvage indien caryotype (WIK) ayant subi une maturation pour être injecté peut varier de 0,2 à 0,5 g.

  1. Rapidement le poisson pendant 24 h avant l’injection.
  2. Anesthésier les poissons avec de l’eau embryon contenant tricaïne 0,16 mg/mL. Utiliser un filtre en papier propre pour sécher l’eau des deux côtés du corps. Mesurer le BW de chaque poisson sur une échelle. Regrouper les poissons au sein de 10 % d’écart en BW pour injection ultérieure.
    NOTE : Afin de minimiser la charge de travail à cette étape, poisson au sein de la différence de 10 % de BW est considérés comme la même taille ; par conséquent, préparer une solution de travail DOX selon leur moyenne BW.
  3. Plan visant à injecter chaque poisson adulte 5 µl de solution. Calculer la concentration de travail DOX selon le nombre de poissons et de BWs.
    Remarque : Afin d’étudier la cardiotoxicité chronique jusqu'à 6 mois, utilisez DOX à une dose de 20 mg/kg. Pour étudier la cardiotoxicité aiguë de DOX, la dose DOX peut être augmentée jusqu'à 50 mg/kg poids vif.
  4. Diluer le stock DOX dans 1 x solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour des concentrations de travail correspondantes. Vortex pour mélanger la solution. Tournez brièvement en bas pour recueillir la solution.

5. DOX Injection chez les poissons adultes

  1. Place un propre 100 mm boîte de Pétri avec une éponge à l’intérieur, sous un microscope à dissection, puis ajuster le focus. Couper l’éponge pour faire une cavité d’environ 4 cm de long pour contenir un poisson. Faire une cavité plus longue pour un plus gros poissons.
  2. Préparez une aiguille de 34 G avec une micro-seringue de 10 µL. Rincer l’aiguille avec 1 tampon de x HBSS pour enlever les bulles et les blocs de la seringue et le tube.
  3. Anesthésier les poissons adultes dans l’eau d’embryon contenant tricaïne 0,16 mg/mL pendant 2 min.
    Remarque : Anesthetization prolongée pendant 5 min, suivie d’injection DOX peut facilement provoquer de poisson mort.
  4. Faire tremper l’éponge dans l’eau avec tricaïne embryon et transférer le poisson sur l’éponge pour injection.
  5. Effectuer un injection IP DOX par une des deux méthodes décrites ci-dessous.
    1. Classique IP injection29
      1. Positionner le poisson avec le ventre vers le haut dans les cavités de l’éponge. Insérer l’aiguille, avec un 45° d’angle au corps de poisson sur la ligne médiane entre les nageoires pelviennes et pénétrer environ 1-2 mm. relâcher rapidement toute la solution DOX lentement. Patientez 5 s avant de tirer l’aiguille. Vérifier la livraison DOX par une couleur rouge visible dans le ventre du poisson.
    2. Injection de IP alternative
      1. Placer le poisson latéralement sur l’éponge avec l’extrémité antérieure vers la droite. Doucement stabiliser le poisson à l’aide d’une pince à extrémité arrondie avec la main gauche et tenez la seringue à injection avec la main droite.
      2. Placez l’aiguille sous la ligne latérale au-dessus de la nageoire pelvienne, le biseau vers le haut. En pointant vers la position de 07:00 à un angle de 45 °, insérer l’aiguille 3-4 mm dans la cavité de poissons située entre le bassin et les nageoires anales et puis lentement, appuyer sur le poussoir. Vérifier la livraison DOX par une couleur rouge visible dans le ventre du poisson.
  6. Transférer rapidement les poissons injectés à un passage propre réservoir rempli d’eau douce pour permettre le poisson récupérer. Rincer l’aiguille une fois avec 1 x HBSS tampon entre les injections.

6. après l’injection poisson gestion

  1. Après l’injection, retourner le poisson au système avec circulation en cours d’exécution. Si possible, maintenir les poissons DOX traités séparément du système principal à éviter la contamination croisée entre les différents réservoirs qui partagent la circulation.
  2. Rapidement le poisson injecté pendant un autre 24 h pour la récupération. Observer les poissons tous les jours pendant la première semaine. Retirez les poissons morts en temps opportun pour éviter l’infection aux autres poissons.
    NOTE : Décès de poissons au cours des 24 premières heures sont probables dues à des lésions physiques causées par l’injection.
  3. De plus maintenir les poissons stressés DOX pour observations longitudinales. Retirez les poissons morts à temps pour éviter les infections aux autres poissons dans le réservoir.
    NOTE : Nombres de poissons sont documentées pour générer une courbe de survie.
  4. Utiliser différentes épreuves expérimentales au phénotype les poissons DOX, telles que l’échocardiographie30, fonction cardiaque journaliste lignée transgénique23, natation défi26et la quantification des autres remodelage pathologique 23de marqueurs.

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Representative Results

Ici, deux méthodes pour effectuer l’injection Intrapéritonéale de modèle DIC chez le poisson zèbre adulte sont présentés. Lorsque vous utilisez le classique, établie IP injection méthode29, il a été noté que la solution injectée de DOX (couleur rouge) pouvait parfois suinter de l’endroit où l’aiguille pénètre. L’injection Intrapéritonéale alternative utilise un emplacement différent pour la pénétration de l’aiguille qui est éloigné du péritoine de 3-4 mm où le DOX est libéré (Figure 1 a), qui empêche les fuites (Figure 1 b, 1C). Mise en œuvre réussie de DOX dans le péritoine pour les deux méthodes se manifeste par une distribution rapide de la couleur rouge dans le ventre du poisson, qui est visible sur le côté opposé du locus injection.

Injection de DOX dosé à 50 mg/kg à l’aide de la méthode alternative de la propriété intellectuelle conduit à une toxicité sévère, où la majorité des poissons meurt dans la semaine (Figure 2). En revanche, l’injection de DOX dosé à 20 mg/kg en utilisant les autres causes de méthode IP presque aucun mort de poissons durant les 2 premières semaines et mort ~ 10 % de poissons à 4 wpi (Figure 3 a). Injection de DOX dosé à 20 mg/kg à l’aide de la méthode classique de la propriété intellectuelle présente environ 30 % poisson mort à 4 wpi (Figure 3). Poisson injecté avec les deux méthodes présentent une mort semblable de ~ 20 % de poissons de wpi 4 à 10 wpi (Figure 3 b, D).

Nous avons mobilisé les casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) poissons afin d’évaluer la progression du dysfonctionnement cardiaque dans le DIC modèle (Figure 4 a)23. Le corps transparent permet la documentation d’un cœur rouge systolique (Figure 4 b) et diastolique (Figure 4) étapes sous un microscope fluorescent. Après l’injection de 20 mg/kg DOX à l’aide de la méthode alternative de la propriété intellectuelle, baisse de la fonction ventriculaire peut être détectée à partir de 4 wpi (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : routes Injection. (1 a) schémas de l’injection classique de la propriété intellectuelle (b) et IP alternative injection (a) méthodes. Le cercle rouge indique la commune DOX libérant le site pour les méthodes de deux injection. Cercles verts indiquent les sites de pénétration de l’aiguille. Les distances sont estimées selon un poisson WIK adult pesant environ 0,3 g. (1 b, 1C) représentative des résultats indiquant une livraison réussie de DOX à l’aide de deux méthodes d’injection intrapéritonéale. Rougeur à l’intérieur du ventre du poisson adulte peut noter immédiatement après l’injection. Injecté de poissons ont été vérifiés à nouveau après la récupération de 5 min dans une eau douce. HBSS : 1 x Hank équilibré de solution saline. Le poisson-zèbre WT WIK étaient employés. Barre d’échelle : 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : courbes de survie représentatif du poisson-zèbre adulte après un stress DOX avec injection de 50 mg/kg DOX. Sont 3 séries d’injections DOX dans différents lots de poissons adultes WT à 3-6 mois d’âge. Au total, n = 24 poissons étaient employés dans le 1 groupe de contrôle de x HBSS et n = 8 poissons étaient employées dans chaque lot injecté avec DOX. Aucune différence chez les poissons des survies ont été notées entre les méthodes de deux injection. Le poisson-zèbre WT WIK étaient employés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : courbes de survie représentatif du poisson-zèbre adulte après un stress DOX avec injection de DOX 20 mg/kg et la comparaison entre deux méthodes d’injection intrapéritonéale. (3 a), poisson de survie au sein de 0 à 4 semaines après livraison DOX par injection intrapéritonéale classique. % Du poisson nombre à 0 a été considérée comme 100 % de la semaine. (3 b) survie des poissons après que 4 semaines après livraison DOX par injection intrapéritonéale classique. % Du poisson nombre à 4 était considéré comme 100 % de la semaine. (3C), poisson survie au sein de 0 à 4 semaines après livraison DOX par injection intrapéritonéale alternatif. % Du poisson nombre à 0 a été considérée comme 100 % de la semaine. (3D) survie après 4 semaines suivant l’accouchement DOX par injection intrapéritonéale alternative du poisson. % Du poisson nombre à 4 était considéré comme 100 % de la semaine. Données présentées dans (3 a) et (3 b) sont 9 différents lots d’injection DOX provenant d’un poisson injecté 223 total 3 à 6 mois d’âge. Données présentées dans (3C) et (3D) sont 14 différents lots d’injection DOX provenant d’un poisson injecté 335 total 2 à 6 mois d’âge. Le nombre de poissons vivants est enregistré chaque semaine. Barres d’erreur représentent écart en pourcentage de survie parmi les lots différents à chaque semaine. Le poisson-zèbre WT WIK étaient employés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Évaluation de représentative de la fonction cardiaque suite à un stress DOX à l’aide de casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) poissons. (4 a), une photographie d’un adulte casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) poissons. Echelle = 1 cm. (4 b) image représentative d’un ventricule rouge au stade systolique fin d’un casper mûri ; TG(cmlc2:nusDsRed) poissons. Ligne pointillée représente diamètre systolique (ESD). Image (4C), représentant d’un ventricule rouge au stade diastolique fin d’un casper mûri ; TG(cmlc2:nusDsRed) poissons. Images en (4 b) et (4C) ont été extraites de films de battements d’un cœur capturés avec un microscope à dissection fluorescent grossissement de 6,3. Ligne pointillée représente le diamètre extrémité diastolique (EDD). Echelle = 1 mm. (4D) représentant la fonction cardiaque mesurée à l’aide de casper ; TG(cmlc2:nuDsRed) poisson-zèbre adulte après injection de DOX 20 mg/kg. EDD et ESD ont été mesurés comme indiqué dans (4 b) et (4C) ventriculaires et pour chaque poisson, raccourcissement de la fraction est calculée par la formule (EDD − ESD) / EDD. Considérablement diminué la fraction ventriculaire raccourcissement a été détectée à 4 semaines et par la suite. L’autre méthode intrapéritonéale a été utilisée. Valeurs sont présentées comme la moyenne ± écart-type. n ≥ 3 dans chaque groupe. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison des deux groupes. p < 0,05. Ces chiffres ont été modifiés de Ding et al. 23 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour modéliser un DIC progressive, la dose de 20 mg/kg DOX a été déterminée expérimentalement que la dose la plus élevée qui ne cause pas la mort de poissons importants pendant 1 wpi, mais encore de résultats dans la mort de poissons et la diminution de la fonction cardiaque après 4 wpi (Figure 3 et Figure 4). Cette dose est comparable à ceux qui sont fréquemment utilisés dans les modèles de DIC rongeurs (15-25 mg/kg) et à la dose cumulative de limite chez les humains (550 mg/m2, ce qui équivaut à 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. des doses plus élevées de DOX, comme 50 mg/kg, voir la mort de poissons importants pendant 1 wpi, donc ils peuvent être utilisés pour étudier seulement Aigues réactions toxiques cardiaques à DOX23,28.

Au cours de la mise en œuvre de ce modèle DIC, nous avons remarqué qu’il était difficile pour les nouveaux chercheurs à reproduire les mêmes résultats au départ. Même pour les chercheurs expérimentés, sur 20 % de variation de la mortalité dans la phase chronique encore trouvera parmi différentes injections (Figure 3), indiquant les variables confusionnelles biologiques indéterminés dans le modèle actuel. Malgré un moins de modèle parfait, nous restons convaincus que ce modèle DIC actuel est suffisant pour en faire la découverte sonore en raison de la preuve suivante. Tout d’abord, après plusieurs pratiques, les résultats du modèle DIC peuvent être plus tard enregistrés chez la plupart, si pas tous, chercheurs. Deuxièmement, basé sur ce modèle DIC, nous avons identifié 4 modificateurs génétiques significatives. Les preuves existantes tirées de littérature appuyé 3 d'entre eux comme la cardiomyopathie gènes34,35,36,37. Le 4ème un est membre du subfamily DnaJ B 6 (DNAJB6), qui s’est avéré pour être un nouveau gène de cardiomyopathie, appuyé par une étude génétique humaine28. Ainsi, nous concluons que résultats basés sur les groupes intra-expérimentaux à l’aide de témoins du même âge rigoureusement sont toujours hautement répétables, quoique le modèle DIC dans sa forme actuelle n’est pas fiable pour comparaison inter expérimentale.

Les facteurs de confusion qui contribuent à l’incohérence observée dans notre modèle actuel de la DIC probablement incluent ce qui suit : (1) vieillissement et la différence entre les sexes ont été considérés comme essentiels facteurs de risque de maladies cardiovasculaires, y compris les DIC38, 39,40. Alors que les deux cofondateurs hypothétiques restent à être testés spécifiquement dans notre modèle, nous avons remarqué que les poissons âgés ont tendance à être plus sensibles à la toxicité DOX (données non présentées). L’inter-lots les variations observées en utilisant les deux méthodes d’IP (Figure 3) sont aussi sans doute contribuées à ces deux cofondateurs. (2) différente des modèles animaux plus grands, la taille d’un poisson-zèbre adulte est petit. Ainsi, local dommages causés par l’injection de DOX peuvent être plus sévère et plus variable. (3) la mort des poissons injectée peut-être résulter de toxicité DOX dans d’autres organes (par exemple, toxicité rénale), en plus de cœur. Alors que les expériences plus soigneusement conçues sont nécessaires pour s’adresser à chacun des facteurs confondants susmentionnés, des travaux antérieurs suggèrent que les mises en garde suivantes aideront à réduire les variations phénotypiques : tout d’abord, il est essentiel de garantir l’efficacité de DOX. Poudre DOX doit toujours être conservée dans un endroit sec et sombre, et des solutions doivent être manipulées avec soin pour réduire l’exposition à la lumière. Il est recommandé que les solutions de travail DOX être fraîchement préparées chaque fois avant l’injection de poissons. Nous n’utilisez généralement pas des solutions mères DOX après 4 semaines de stockage. Lorsqu’il y a un doute, exécuter l’option Section 3 dans le présent protocole en utilisant le modèle rapide de DIC embryonnaire pour calibrer l’efficacité de la drogue de chaque lot DOX. Deuxièmement, la synchronisation de poissons adultes est essentielle. La même souche de poisson doit être déclenché à la même densité, pour s’assurer de taille similaire. Nous sélectionnons ensuite les poissons avec BWs similaires pour le calcul de la dose. Il est recommandé de maintenir au moins deux fois plus de poissons au total pour ce processus de présélection. Tous les poissons sont à jeun pendant 24 h avant que le processus de présélection. En troisième lieu, il est recommandé de toujours utiliser le poisson du même âge et au sexe le poisson avant l’injection de DOX à cause de leur taux de croissance différents et potentiellement différentes réponses cardiaques à DOX.

Nous avons remarqué que la majorité des conclusions incompatibles pouvait être attribuée à un groupe témoin douteux. Nous recommandons donc, enquêteurs de nouveau sur le modèle DIC aux injections de DOX pratique avant la réalisation d’expériences réelles. Quand 20 mg/kg DOX est injecté à l’aide de la méthode d’injection IP alternative, une technique d’injection bon peut être indiquée par un presque zéro mort de poissons au cours de la 1 wpi DOX et un taux de mortalité relativement constante à l’injection de 2 à 3 mois post-DOX. La preuve ultime pour la modélisation réussie est la réduction de l’indice cardiaque fonctionnel, qui ont pu être quantifié par échocardiographie25,30, à l’aide d’un casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) lignée transgénique, ou en utilisant un nouveau ex vivo-base de test de la fonction cardiaque (données non présentées).

En plus de l’apport de la propriété intellectuelle, autres itinéraires de livraison de médicaments tels que l’injection rétro-orbitaire41, oral42et l’incubation de l’eau d’alimentation est aussi fréquemment utilisé chez le poisson zèbre adulte. On n’adopte pas l’approche de l’injection rétro-orbitaire, malgré sa drogue direct libérant dans le système de circulation, en raison de l’absence d’une méthode pour valider les medicaments réussie, comme les rougeurs de DOX peuvent être facilement masquées par un éventuel saignement. Nous avons essayé un protocole de livraison orale par incorporation DOX avec gluten absorbable42, qui a été mélangé avec repas pour nourrir les poissons adultes. Malheureusement, avec jusqu'à la dose cumulée de 150 mg/kg, utilisé dans une période d’alimentation de 4 semaines, on n’a pas observé une cardiotoxicité sévère, suggérant l’inefficacité de l’administration orale de DOX. Par ailleurs, une technique de gavage oral pourrait être davantage explorés43. En outre, le protocole d’incubation de tremper le poisson dans une solution contenant DOX est également un itinéraire de livraison potentiel qui pourrait être testé à l’avenir.

Nous reconnaissons qu’une des principales limites du modèle actuel de DIC est la méthode d’injection de bolus unique, qui pourrait entraîner une toxicité élevée et local dommages aux organes internes. Cette approche a été conçue pour réduire les charges de travail et pour augmenter le débit, ainsi que le dépistage génétique peut être effectué à un débit élevé en poissons adultes28. À l’avenir, des modèles avec des injections multiples de DOX à de faibles doses doivent être poursuivis, qui récapitulera mieux la DIC observée chez les patients cancéreux traités par chimiothérapie.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (14SDG18160021 à YD), l’américain NIH R01 accorde HL 81753 et HL 107304 à XX et la Fondation Mayo à XX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Médecine numéro 136 doxorubicine cardiomyopathie phase aiguë en phase chronique poisson zèbre injection intrapéritonéale modèle de maladie
Un modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine chez le poisson zèbre adulte
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Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

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