Summary
Спинной корень ганглиев (DRG) первичных культур часто используются для изучения физиологических функций или события, связанные с патологией в сенсорных нейронов. Здесь мы продемонстрировать использование поясничной DRG культур для обнаружения освобождения нейромедиаторов, после нейропептида FF рецептор типа 2 стимуляции с селективным агонистом.
Abstract
Спинной корень ганглиев (DRG) содержат ячейки органов сенсорных нейронов. Этот тип нейрон псевдо-однополярного, с двумя аксонов, которые иннервируют периферических тканях, такие, как кожи, мышц и внутренних органов, а также спинного мозга Спинной рога центральной нервной системы. Сенсорные нейроны передают соматические ощущения, включая сенсорный, боль, тепловой и проприоцептивная ощущений. Таким образом DRG первичных культур широко используются для изучения клеточных механизмов Ноцицепция, физиологических функций сенсорных нейронов и нейронных развития. Культивированный нейроны могут быть применены в исследованиях с участием электрофизиологии, сигнальной трансдукции, нейромедиатора релиз или кальция изображений. С DRG основных культур ученые могут культура диссоциированных нейронов DRG контролировать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, преодолевая многие из ограничений, связанных с экспериментов в естественных условиях . По сравнению с коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий или увековечен DRG нейрональных клеточных линий, состав и свойства клеток первичного гораздо больше похожи на сенсорных нейронов в ткани. Однако из-за ограниченное количество культивируемых DRG первичных элементов, которые могут быть изолированы от одного животного, трудно выполнить высок объём экраны для ориентации исследования наркотиков. В текущей статье описаны процедуры сбора DRG и культуры. Кроме того мы демонстрируем лечение клетки культивировали DRG с агонистом рецепторов типа нейропептида FF 2 (NPFFR2), с тем чтобы побудить освобождения нейромедиаторов пептида (пептид связанных с геном кальцитонина (CRGP) и вещество P (SP)).
Introduction
Клетки тела сенсорных нейронов, содержатся внутри DRG. Эти нейроны псевдо-однополярного и иннервируют периферических тканей и центральной нервной системы. Периферических нервных окончаний Сенсорные нейроны находятся в мышц, кожи, внутренних органов и костей, среди других тканей. Они передают сигналы периферийного ощущения нерв, который затем окончаний в спинного мозга Спинной рога и сигналы передаются в мозг через различные восходящем пути соматические ощущения1,2. Соматические ощущения позволяет организму чувствовать себя (то есть, сенсорный, боль и тепловых ощущений) и воспринимать движение и пространственной ориентации (проприоцептивной ощущений)1,3. Есть четыре подклассы первичных афферентных аксонов, в том числе, группа I (aα диалога доступных) волокон, которые реагируют на Проприоцепцию скелетных мышц, группа II (значения) волокон, которые реагировать механорецепторов кожи, и группы III (Aδ) и V (C) волокон в группы, которые реагируют на боль и Температура. Только С-волокна являются unmyelinated, в то время как остальные Миелинизированные в разной степени.
Ноцицепторами являются первичных сенсорных нейронов, которые активируются вредных раздражителей (механические, тепловые и химические стимуляции), которые несут потенциал для повреждения тканей. Эти нейроны состоят из Миелинизированные Aδ волокна и волокна1,unmyelinated C4. Aδ волокна Экспресс рецепторов фактора роста нервов (ФРН, Ведьмина рецепторов), CGRP и SP. С-волокна, классифицируются как peptidergic и не peptidergic С-волокна. С другой стороны не peptidergic С-волокна Экспресс рецепторов для глиальной нейротрофического фактора (рецепторов GDNF, RET и Федеративная Республика Германия), isolectin IB4 и АТФ закрытый ионного канала подтип (P2X3)5,6,7. Ноцицепторами можно отличить выражением ионных каналов и активированную нейротрофических факторов, цитокины, Нейропептиды, АТФ или других химических соединений8. После стимуляции нейротрансмиттеров, включая CGRP, SP и глутамат может быть освобожден от сенсорных нейронах терминалов в спинного мозга Спинной рога для передачи сигналов ноцицептивных2. DRG состоят не только из нейронов, но также содержат Спутниковое глиальных клеток. Спутниковое клетки окружают сенсорных нейронов и обеспечивают механические и метаболизм поддержки9,10. Интересно, что существует растущий объем свидетельств, указывающих, что Спутниковое глиальные клетки в DRG могут быть вовлечены в регулировании боли ощущение11.
Чтобы быть наиболее часто используемые первичной нейрональные клетки12 и были использованы для электрофизиологии, сигнала и нейромедиатора релиз исследований сообщалось сенсорных нейронов. Они также часто используются для изучения клеточных механизмов развития нервной системы, воспалительные боли, невропатической боли, ощущение кожи (как зуд) и аксон нарост12,13,14,15. DRG первичных культур может культивировали как диссоциированных нейронов оценивать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, позволяет ученым для проведения исследований, которые не может быть выполнена экспериментальная предметам. Недавно DRG были успешно культивировали человеческий орган доноров, которые могли бы пользу трансляционного исследования16. С другой стороны Сенсорные нейроны могут также выращиваются как DRG эксплантах. DRG эксплантов сохранить оригинальную архитектуру ткани нейронов, включая Шванновские клетки и спутниковое глиальных клеток и особенно полезны для изучения взаимодействия нейронов и не нейрональные клетки17. DRG первичных культур можно легко приготовить в течение 2,5 ч. Клеточный состав и свойства высокой отражающей способностью источника DRG, и таким образом, конкретные DRG (поясничный или грудной DRG) может быть собрана по данным экспериментальных требования. Культурах эмбриональных и неонатальной DRG нейронов требуют NGF выжить и вызвать нарост аксона, но культуры взрослых нейроны не требуют добавления нейротрофических факторов к СМИ12,17. Существует также коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий, таких как ND7/23 и F11, которые не требуют использования экспериментальных животных. Однако, отсутствие Переходный рецепторный потенциал катионного канала член subfamily V 1 (TRPV1) выражение (важный маркер для малых сенсорных нейронов ноцицептивных) и несовместимые ген выражение профили ограничивают их приложения18. Недавно увековечен DRG нейрональных клеток линии были получены от крыс (50B11)19 и20мыши (MED17.11), которые подходят для использование в экраны высокой пропускной способностью для ориентации исследования наркотиков. Однако выражение гена профилируя для этих клеточных линий еще предстоит выполнить. Таким образом еще продолжаются эксперименты проверки, сравнивая эти увековечен клетки для сенсорных нейронов.
NPFFR2 синтезируется в DRG и арестовано сенсорные нервные окончания в Рог спинного мозга Спинной21. В этой статье мы предоставляем протокол для культивирования поясничного DRG клетки и относиться к ним с агониста NPFFR2 побудить освобождения нейромедиаторов, CGRP и SP. Зависимость от NPFFR2 Далее проверяется с использованием NPFFR2 малые интерферирующие РНК (siRNA), который может transfected в клетки культивировали DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, которые используют подопытных животных были утверждены институциональный уход животных и использовать Комитет (IACUC) Чжан Гун университета (Ге 13-014).
1. сбор поясничного DRG от экспериментальных крыс
- Использовать 2-3 недели старый крысах Sprague-Dawley (SD) для поясничного DRG коллекции.
Примечание: DRG нейронов, собранных от крыс более 4 недель не растут хорошо в условиях культуры, описанные здесь. - Стерилизуйте всех хирургических инструментов в автоклаве.
- Анестезировать Крыса с 1:1 смесь tiletamine и zolazepam (20 мг/кг; внутрибрюшинной инъекции (IP)) и подождите, пока животное показывает фут вывода ответа в тесте мыс пинча.
Примечание: Различные анестезии стратегии может успешно использоваться в этом протоколе. - Пожертвуйте крыса, обезглавливание с коммерческой гильотины.
- Используйте гильотины изолировать ствол тело крысы между передних конечностей и бедренной кости. Смотрите Рисунок 1A для диаграммы региона должны быть собраны.
Примечание: Каудальной линии надреза должна быть просто ростральной к бедренной кости. Поясничная DRG L6 будет вырезана Если вырезать сайт слишком высока в позвоночнике. - Разрезать вдоль грудины и удалить все органы/ткани с Рассечение ножницами (рисунок 2A-).
- Разрежьте вдоль на стороне ствола для сбора спинной частью крысы и удалить кожу. Смотрите Рисунок 1B для фотографии расчлененных спинной ствола.
- Подготовка тканей на льду перед сбором DRG. Чистить мех и кровь от перчатки и стерилизовать их с 75% этанола перед переходом к следующему шагу.
- Удаление мышц, охватывающих поясничного отдела позвоночника. Во-первых сделать два надреза вдоль позвоночника (слева и справа) и один боковой разрез в ознаменование ростральной степени поясничного отдела позвоночника. Затем удалите спинной мышц позвоночника с щипцами кости резки (рис. 2A-b).
- Удаление спинная часть позвонков с щипцами кости резки и разоблачить спинного мозга.
- Удаление спинного мозга с Рассечение ножницами (рисунок 2A-c) и щипцы (рисунок 2A-d).
- Идентифицировать поясничного DRG подсчета позвонков из последнего ребра (грудной позвонок 13). Смотрите Рисунок 1 c схема положения позвонков.
- Соберите двусторонних поясничного DRG (L1-L6) с микро ножницы (рисунок 2A-f) в 35-мм культуры блюдо с ледяной среднего 2 мл сыворотки бесплатно. Удаление нейронов волокна (как указано на рисунке 1 c) от подключения DRG, а затем перевести его в культуры блюдо для улучшения чистоты культур.
Примечание: Собранные DRG может храниться в среде на льду около 1 ч. Между тем несколько крыс может быть euthanized для создания большего числа DRG.
2. Первичная культура крыса пиломатериалов DRG
Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в Ламинарный шкаф.
- Подготовка питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным, пируват натрия 100 мм и 1 x пенициллина/стрептомицина 1 x DMEM-F12.
- Слой клеток Культура лечение 24-ну пластины с 200 мкг/мл поли L-лизин 2 h, а затем моют стерилизованные водой.
- Предварительно Инкубируйте культуры блюдо с 1 мл питательной среды в инкубатор 37 ° C CO2 перед использованием для менее 30 мин.
- Перевести блюдо DRG-содержащих 35 мм в ламинарных капюшоном и мыть DRG с сыворотка бесплатно средний 3 раза с пипеткой.
Примечание: За пределами блюдо должны быть очищены с 75% этанола перед передачей в капюшон. 35 мм блюдо может содержать DRG от ряда крыс (это будет зависеть от требований экспериментальный дизайн). - Переместить DRG (от одного крыса или в сочетании с несколько крыс) для новой культуры блюдо 35 мм, которая содержит 2 мл коллагеназы типа IA (1 мг/мл в среде, свободной от сыворотки) стерильным пинцетом (рисунок 2A-e).
Примечание: Коллагеназа решения следует стерилизовать, проходя через фильтр шприц 0,22 мкм. - Дайджест DRG коллагеназы решения в инкубатор 37 ° C CO2 на 30 мин.
- Удаление решения коллагеназы и мыть DRG 3 раза по 2 мл Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS).
Примечание: Могут существовать остаточная волокна или ткани, которые приходят от DRG в раствор. Удалите их, Пипетка с моющим раствором. - Добавьте 2 мл предварительно разогретую 0,05% трипсина ЭДТА в DRG-содержащих блюдо 35 мм и дайджест DRG в инкубатор 37 ° C CO2 на 30 мин.
- Трансфер 2 мл раствора DRG-содержащих 15 мл пластиковых пробирок на стеклянной пипетки.
Примечание: DRG может прилипает к стеклянной пипетки, поэтому этот шаг должен выполняться с осторожностью. DRG потерь можно избежать, сохраняя DRG-содержащих раствор в конической части стеклянной пипетки (около 0,5 мл) и передачи решения в пластиковых пробирок медленно, но без паузы. - Центрифуга решение на 290 x g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и добавьте еще 2 мл сыворотки свободный средних Ресуспензируйте DRG.
- Повторите шаг 2.10 2 раза но изменение сыворотки свободный средне подогретым питательной среды на последний раз.
- Вручную нарезанных DRG, приблизительно 60 раз с помощью пипетки Пастера пламени полированные (внутренний диаметр длина 230 мм и кончик головки 1 мм). Смотрите Рисунок 2B фотография сравнивая отверстия пламени полированные пипетка Пастера для пипетки-полированные.
Примечание: Внутренний диаметр пламени полированные пипетка Пастера примерно на 10% меньше, чем управление дозаторов и внутри конический конец должен быть плавным. Будьте осторожны, чтобы не создавать пузыри, когда истирание клетки. - Удаление поли L-лизин покрытием блюдо из инкубатора CO2 . Аспирационная инкубирован питательной среды от блюдо и семян диссоциированных клетки на покрытые блюдо.
- Семя DRG клетки от одного крыса (двусторонние коллекции от L1-L6, для 12 всего DRG) в четыре скважины 24-ну плиты; Есть примерно 5 х 104 клетки в одной скважиной 24-ну плиты.
Примечание: Эта плотность подходит для обнаружения выпустила CGRP или SP и подходит также для иммуноокрашивания. Для западной помарки или извлечение RNA семян DRG клетки от одного крыса (двусторонние L1-L6) в одну скважину 6-ну плиты. - Заменить питательной среды на следующий день с добавлением 10 мкм цитарабин (Ara-C) и 100 нг/мл ФРН и обновить средство каждые два дня.
Примечание: Грудной DRG также может также быть культивировали этот протокол, если они были собраны от грудного отдела позвоночника.
3. transfection NPFFR2 интерферирующей РНК в клетках DRG
- Выполните transfection NPFFR2 siRNA и контролировать siRNA, по словам производителя протокол.
Примечание: Протокол будет нужно быть адаптированы, если выбранный трансфекции реагент отличается от того, мы использовали (см. Таблицу материалов). - На 3 день после покрытие ячейки измените среднего предварительно теплой средний 0,5 мл сыворотки бесплатно и инкубировать DRG в инкубатор 37 ° C CO2 на 1 ч.
- Добавьте 50 Нм интерферирующей РНК (в 1 мкл РНКазы свободной воды) в 12,5 мкл сыворотки бесплатно среднего.
- Добавьте 2.5 мкл Реагента трансфекции в 10 мкл сыворотки свободной среде.
- Mix решение от шаги 3.3 и 3.4, Пипетка и инкубировать этого смешанного трансфекции решение для 10 мин при комнатной температуре.
- Трансфекция решение добавить в одну плиту DRG-содержащих 24-Ну и mix решение с средний мягкий встряхивания.
Примечание: Несколько трансфекции решения должны быть развернуты в то же время если несколько скважин нужно transfected. - Инкубируйте DRG в CO2 инкубатора 37 ° C на 6 ч.
- Добавить 0,5 мл/хорошо из питательной среды, содержащей плода бычьим сывороточным 20%, пируват натрия 100 мм и 1 x пенициллина/стрептомицина 1 x DMEM-F12, с добавлением 10 мкм Ara-C и 100 нг/мл ФРН, в пластину 24-хорошо.
- Инкубируйте DRG в 37 ° C CO2 инкубатора для другой 66 h (обновить средство на 48 ч).
4. релиз нейромедиаторов из клеток первичного DRG
- На 6 день после того, как клетки были покрытием (72 ч после трансфекции siRNA), изменить питательной среды на 200 мкл сыворотки бесплатно средний и инкубации клеток в инкубатор 37 ° C CO2 на 30 мин.
- Добавить 1 мкл стимуляции видоискателя и осторожно перемешать СМИ, закупорить. Инкубируйте блюдо в инкубатор 37 ° C CO2 в назначенное время.
Примечание: В этой статье, культивируемых клеток были стимулируется с NPFFR2 агонист, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-пе-NH2, 5 нмоль), за 1 ч. - Сбор культуры среднего от культуры блюдо и центрифуги на 5000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для удаления любых взвешенных примесей.
- Собирать супернатант центрифугирования и развести образцы с фосфат амортизированное saline (PBS), при необходимости. Анализ уровней нейротрансмиттеров с фермента наборы иммуноферментного анализа (ОВОС).
Примечание: Здесь, supernatants были прежде чем анализировать уровень CGRP разбавленных 1: 100. Супернатант был не разбавляют до анализа уровня SP.
5. CGRP и ОВОС СП
- Анализируйте образцы сразу согласно протоколу CGRP или SP ОВОС комплект производителя.
Примечание: Протокол будет варьироваться в зависимости от используемых комплект. - Промойте скважин CGRP EIA 5 раз мыть буфера, поставляемые в комплекте.
- Добавить 100 µL пробы с 100 мкл анти CGRP ацетилхолинэстеразы (АВО) трассировщика в скважины CGRP ОВОС и добавьте 50 мкл образцов, 50 мкл анти SP боль трассирующими и 50 мкл анти SP антисыворотка в SP EIA скважины.
- Уплотнение CGRP и SP скважин с пластиковой пленкой, которая поставляется в наборы.
- Инкубировать скважин на ночь при 4 ° C.
- Промыть лунки 5 раз с CGRP или SP мыть буфера и удалить все остаточные решение из скважин.
- Добавление Эллман 200 мкл реагента в CGRP или SP скважины, которые поставляется в рамках соответствующие наборы ОВОС.
- Инкубировать CGRP скважин на 30 минут при комнатной температуре и инкубировать SP скважин 90 мин при комнатной температуре. Защищайте от света для обоих анализов скважин.
- Читайте пластины на длине волны 414 Нм и вычисления результатов согласно соответствующего документа ОВОС.
Примечание: Не прикасайтесь к нижней части скважин вручную все время и очистить пятна воды снизу хорошо объектив, очищающие салфетки перед добавлением Эллман реагента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Крыса поясничного DRG нейронов, культивируемых в пластине 24-а, были выращены в питательной среды с дополнительные Ara-C, чтобы препятствовать пролиферация глиальных клеток и ФРН в поддержку нейрональных роста. Морфология жизни DRG клеток наблюдалось. Как показано на рисунке 3, клеток тело нейрона одного была прикреплена на нижней части блюдо в день 1 и отобранных для наблюдения. Аксон рост был контролировать от 1-3 день. Глиальные клетки дублируется и расширить процессы вокруг клеток тело нейрона сенсорные. В другой культуре CGRP белка был окрашенных раскрыть форму нейронов. На рисунке 4CGRP Протеин пятная появляется в цитоплазме и сенсорных нейронов. Ядерные морфологии нейронов и глиальных клеток отличаются, когда витражи с DAPI. Нейроны имеют более крупные и более округлые ядро чем глиальные клетки. Для сравнения ядра глии являются более овальной формы (рис. 4В).
Селективный агонист NPFFR2, dNPA, был использован для стимулирования выпуска CGRP и SP. Кроме того зависимость dNPA стимулирует нейромедиатора релиз NPFFR2 был проверен transfecting клеток с NPFFR2 siRNA. NPFFR2 малых интерферирующих РНК или управления siRNA были transfected в первичной клетки DRG 72 h до агонистов лечения. DRG клетки были относиться с dNPA (5 нмоль) за 1 ч и освобождение CGRP и SP измерялась отдельные наборы ОВОС. Моделирование DRG с dNPA повысили уровень CGRP и SP в средствах массовой информации (Рисунок 5A, B). Однако только dNPA индуцированной CGRP релиз был тормозится выражение NPFFR2 интерферирующей РНК в клетки культивировали DRG. Результаты, показанные на рисунке 5 были изменены из предыдущей публикации и здесь используются с разрешения22.
Рисунок 1: ткани обработки диаграмм. Поясничный DRG собраны из 3 недели старых крыс. (A) позиции, где гильотины должны использоваться для резки животное обозначаются пунктирными линиями. (B) спинной ствол с кожи удаляются и (C) показаны места поясничного DRG (от L1-L6). Вставка представляет DRG и соединительных волокон (которые указаны стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: специальное оборудование, необходимое для изоляции первичных культур DRG. (A) хирургические инструменты, используемые в коллекции DRG. Слева направо: () Рассечение ножницами (большой), (b) кости резки щипцы, (c) Рассечение ножницами (маленький), (d, e) пункт (f) микро ножницы и щипчики. (B) регулярные пипетка Пастера и пламя полированные пипетка Пастера. «» обозначает внутри диаметр регулярных пипетка Пастера, а «б» обозначает внутри Диаметр пламени полированные пипетка Пастера. b / a ≒ 0,9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: морфология живых клеток DRG. Живые клетки DRG осуществлялся путем микроскопии. Ячейки отображаются (A) один день после посева, (B) через два дня после посева и (C) через три дня после посева. Стрелки указывают нейрон и стрелки указывают глии. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: иммуноокрашивания культивируемых клеток DRG. DRG клетки были immunostained с антителами anti-CGRP Показать нейронов и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для ядер нейронов и глиальных клеток. (A) CGRP белка была выражена в сенсорных нейронах клеток органов и аксон волокон. (B) ядер нейронов и глии окрашивали DAPI. (C) Merged фотография от A и B. стрелка указывает нейрона и стрелка указывает глиальных клеток. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: освобождения нейромедиаторов из культивируемых клеток DRG. Селективный агонист NPFFR2, dNPA, был использован для стимулирования выпуска CGRP и SP от DRG культур. Зависимость нейромедиатора релиз на NPFFR2 была подтверждена transfecting клеток с NPFFR2 siRNA. (A и B) после DRG клетки были transfected с NPFFR2 siRNA или ненацеливания управления малых интерферирующих РНК (72 ч.), dNPA (5 нмоль) был применен для 1 h побудить выпуска CGRP и SP. Данные выражаются как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) и были проанализированы t WO путь анализ дисперсии (ANOVA) с Бонферрони пост Специального тесты. p < 0.01, ***p < 0,001; по сравнению с соответствующего транспортного средства управления (N = 12 в группе). Панели, A и B были изменены из Линь и др. 22 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящей статье, мы демонстрируем коллекции, фермент диссоциации и культуры крыса поясничный DRG. При поддержке нейротрофических ФРН аксоны нейронов DRG расширена в течение 3 дней после посева клеток. Расширенный аксоны были явно наблюдаемой после того, как клетки окрашивали CGRP белок, который синтезируется в ячейку сома и транспортировать вдоль аксона волокон. Процессы клеток Спутниковое также расширена, позволяя эти деления глиальных клеток окружить нейронов в течение дней. Основной ячейки DRG вырос настоящим Протоколом подходят для расследования клеточных механизмов, которые регулируют сенсорных нейронов. Здесь мы стимулируем выпуска Нейропептиды, CGRP и SP, от искусственного DRG нейронов, селективный агонист NPFFR2, dNPA. NPFFR2-это узнаваемый рецептора NPFF и сообщила участвовать в боль ощущения и регулирование пути22,23. NPFFR2-зависимость CGRP и SP релиз был проверен с помощью NPFFR2 siRNA.
DRG культур содержат сенсорных нейронов и глиальных клеток Спутниковое. Глиальные клетки Спутниковое метаболических поддержку нейронов и поддерживать функции нейронов9,10. В иммуноокрашивания фотографии, это легко определить нейронов и глиальных клеток, так как их ядер формируются по-разному (Показать в рисунке 4В). Существование спутниковой клеток в культуре блюдо может стать проблематичным, если есть экспериментальный спрос различать конкретные функции нейронов и глии. Например невозможно отрицать, что Спутниковое клетки участвуют в развитии и поддержании боли11,24, и в некоторых исследованиях, действия нейронов и глиальных клеток будет трудно отличить, используя DRG культур.
В этом протоколе есть несколько важных шагов, которые требуется осторожность. Во-первых поскольку DRG собираются за пределами ламинарных капюшоном, особую осторожность следует в процессе сбора ткани во избежание заражения клеток. Должно быть не нужно создавать стерильного пространства, как в комнате человека хирургические, но необходимы стерилизации инструментов и чистого рабочего пространства. Советы, чтобы избежать загрязнения включают ведение стерилизованные инструменты на мешке стерилизации, когда не в пользе и избегая Касаясь ненужные элементы. Кроме того загрязняя организмы могут перевозиться на меху, который может придерживаться крыса тела ствола или перчатки. Таким образом меха и пятна на перчатки должны быть удалены путем очистки с 75% этанола. Это также полезно для оператора носить хирургические маски для предотвращения передачи организмов из дыхание или слюны. Кроме того 35-мм блюдо следует держать закрытыми во все времена и открыт только при размещении расчлененный DRG внутри. Важно заменить блюдо 35 мм с новое блюдо перед Пищеварение энзима. Во время пищеварения энзима не продлить время инкубации, так как чрезмерная пищеварение может повредить нейронов. Убедитесь в том, что предварительно теплой трипсина ЭДТА до 37 ° C для достижения эффективности соответствующих пищеварение. Эффективность будет значительно уменьшена в более низких температур, и это будет трудно достичь одну ячейку подвеска, когда истирание DRG, пламя полированные пипетка Пастера. Пламя, полировка пипеткой гладкие отверстия и предотвратить резкое стеклянный край от ранив нейронов. Однако, перегрева пипетку с пламя будет сделать внутри диаметра слишком мал и ткани или клетки, содержащие решения будет становиться трудно пройти. Это уменьшение диаметра, также могут вызывать много пузырьков форме на этапе Тритурация, значительно снижает коллекционные количество нейронов DRG. Наконец, DRG культур следует подходить осторожно во все времена, особенно при изменении среднего или выполнение медикаментозного лечения.
Нейроны DRG сообщается наиболее часто используемые основной культурный нейрональные клетки12. Они могут быть использованы для целого ряда различных исследований, начиная от электрофизиологии или ячейки биологии для изучения физиологических и патологических функций сенсорных нейронов. Основным ограничением DRG первичных культур является, что они не подходят для высокопроизводительного скрининга. Количество ячеек, которые могут быть собраны из DRG одной крысы являются ограниченными, и нейроны способны дублировать в культуре. Из-за ограниченной мобильный номер чтобы заменить основной культуры18,,1920были разработаны несколько DRG-гибридомной клеточных линий или увековечен DRG нейрональных клеточных линий. Однако профили выражение протеина DRG клеточных линий не может быть таким же, как оригинальный DRG, и, таким образом, каждая модель системы должна быть тщательно проверена. Помимо изоляции клетки в лаборатории, были сделаны коммерчески доступных крыса эмбриона или неонатальной DRG нейронов. Таким образом покупка из коммерческих источников может быть жизнеспособной альтернативой свежеприготовленные DRG культур.
DRG первичных культур были использованы на протяжении многих лет как ценный экспериментальный инструмент, который принимается главным образом в исследованиях, связанных с боль. Эта модель система вряд ли в ближайшем будущем заменить. С хорошим качеством DRG нейронов ученые могут получить стабильные и воспроизводимые результаты, которые пользу многих областях исследования нейронауки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р м. Калкинс для английского редактирования. Эта работа была поддержана Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPD1F0482), Чжан Гун университета, здоровые старения научно-исследовательский центр (EMRPD1G0171) и Министерство науки и технологии (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
