Summary
後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2 刺激を入力後、神経伝達物質の放出を検出するための腰部後根神経節文化の使用を示します。
Abstract
後根神経節 (DRG) では、感覚ニューロンの細胞体が含まれています。ニューロンのこのタイプは、皮膚、筋肉、内臓、中枢神経系の脊髄後角などの末梢組織を支配する 2 つの軸索と、擬似単極です。感覚ニューロンは、体性感覚、タッチ、痛み、熱、および自己感応の感覚を送信します。したがって、DRG 初代培養は、侵害受容の分子機構、感覚ニューロンと神経系の発達の生理機能を研究に活躍しています。培養神経細胞は、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質のリリース、またはカルシウム イメージングを含む研究で適用できます。DRG 初代培養、科学者が単一の生化学の変化を監視する解離の DRG ニューロンの文化や生体内で実験に関連付けられている複数のセルは、多くの制約を克服します。市販に比べて利用 DRG ハイブリドーマ細胞不死化後根神経節神経細胞、組成や一次電池の特性より組織の感覚ニューロンに似ています。ただし、1 つの動物から分離できる培養後根神経節細胞の数が限られたため薬物標的の探索のハイスループット画面を実行することは困難です。現在の記事では、DRG のコレクションおよび文化のための手順を示します。さらに、FF の神経ペプチド受容体 2 型のアゴニストと後根神経節細胞 (カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CRGP) と P 物質 (SP)) ペプチド神経伝達物質の放出を誘発する (NPFFR2) の治療を紹介します。
Introduction
感覚ニューロンの細胞体は後根神経節内に含まれます。これらのニューロンは擬似単極、末梢組織と中枢神経系を支配します。感覚ニューロンの末梢神経終末は、筋肉、皮膚、内臓器官や骨、他の組織.の間であります。体性感覚1,の2つの昇順経路を介して脳に転送される脊髄後角、および信号の終末神経の末梢の感覚信号します。体性感覚を可能に (すなわちタッチ、痛み、および熱感覚) を感じ、知覚運動と空間的な向き (固有受容感覚)1,の3体。4 がある骨格筋、皮膚の受容に応答グループ II (a β) 繊維の感覚に対応し、グループ III (Aδ) (核内局在) 繊維と痛みに応答グループ V (C) 繊維を含むプライマリの求心性軸索のサブクラス群と温度。C 線維のみ、残りが異なる度に有髄髄、おりません。
侵害受容器は、組織の損傷の可能性を運ぶ侵害刺激 (機械的、熱的、化学的刺激) によって活性化される第一次感覚ニューロンです。これらのニューロンは、Aδ 有髄線維と無髄の C 線維1,4で構成されます。Aδ 繊維エクスプレスの SP、CGRP、神経成長因子 (NGF 受容体 trkA) 受容体C 線維は、ペプチドおよび非ペプチド作動性の C 線維に分類されます。その一方で、非ペプチド作動性 C 線維はグリア由来神経栄養因子 (GDNF、RET、GFR 受容体)、isolectin、IB4 と ATP 依存性イオン チャネルのサブタイプ (P2X3)5,6、7のための受容器を表現します。侵害受容器のイオン チャネルの発現によって区別、神経栄養因子による活性化サイトカイン、神経ペプチド、ATP、または他の化学化合物8することができます。刺激、CGRP、SP、グルタミン酸などの神経伝達物質は、侵害受容性信号2を送信する脊髄後角における感覚ニューロンの端末からリリースされるかもしれない。DRG はだけニューロンから成るとはありませんが、また衛星グリア細胞を含みます。衛星細胞感覚ニューロンを囲む、機械的および代謝サポート9,10。興味深いことに、痛み感覚11の調節に DRG 衛星グリア細胞が侵されることを示す証拠の成長するボディがあります。
感覚ニューロンは最も頻繁に第一次神経細胞12を使用、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質放出の研究に利用されているが報告されています。神経の開発、炎症性疼痛、神経因性疼痛、(かゆみ) のような皮膚感覚軸索伸長12,13,14,15の細胞メカニズムを探るにもよく使用されます。DRG 初代培養は、実験科目では実行できない研究を実行する単一または複数のセルの生化学的変化を評価するために解離ニューロンとして培養することができます。最近、後根神経節が大きくトランスレーショナルリサーチ16に恩恵を受ける可能性があります人間の臓器提供者から養殖に成功しました。その一方で、後根神経節外植片として感覚ニューロンは培養も。DRG 植ニューロン、シュワン細胞と衛星グリア細胞を含む元の組織構造を維持、神経および非神経細胞17間の相互作用の研究に特に有用です。DRG 初代培養は、2.5 h の内で簡単に用意できます。細胞の組成と性質は後根神経節、ソースの反射率の高い、実験の要求に応じて特定後根神経節 (腰部や胸部の DRG) を収集できるよう。胎児・新生児の DRG ニューロンの文化必要軸索伸長を誘発して生き残るために NGF が大人ニューロンの文化メディア12,17に神経栄養因子の添加を必要としません。ND7/23 と F11、実験動物の使用を必要としないなどの市販の DRG ハイブリドーマ細胞株もあります。ただし、一時的な受容器の潜在的な陽イオンの欠如チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) 式 (小さな侵害受容ニューロンの重要なマーカー) と不適合遺伝子発現プロファイルの制限、アプリケーション18。最近では、行は、ラット (50B11)19から派生されている不死の後根神経節神経細胞およびマウス (MED17.11)20に適しているはターゲティング研究の高スループット画面で使用します。しかし、これらの細胞株の遺伝子発現はまだ実行します。したがって、感覚ニューロンへこれらの不死化細胞の比較検証実験はまだ進行中です。
NPFFR2 は、後根神経節で合成、脊髄後角21の感覚神経終末に移行します。この記事で私たちは腰部後根神経節細胞を培養し、CGRP と SP の神経伝達物質の放出を誘発する NPFFR2 のアゴニストとそれらを扱うのためのプロトコルを提供します。NPFFR2 への依存は、NPFFR2 小さい干渉 RNA (siRNA) 培養後根神経節細胞にトランスフェクション可能性がありますを使用してさらにテストされます。
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Protocol
実験動物を使用するすべてのメソッドに記載は、動物介護制度や長庚大学 (CGU 13-014) の使用委員会 (IACUC) によって承認されました。
1. 実験的ラットの腰部後根神経節を収集します。
- 腰椎の DRG コレクションの 3 週齢 Sprague-dawley (SD) ラットに 2 を使用します。
注: 以上 4 週齢ラットから収集した DRG ニューロンは、記載の培養条件下でよく成長はありません。 - オートクレーブですべての手術器具を滅菌します。
- チレタミンとチレタミン (20 mg/kg; 腹腔内注入 (IP)) の 1:1 混合物のラットを麻酔し、動物は、つま先ピンチ テストで足撤退応答を示さないまで待ちます。
注: 異なる麻酔戦略は、このプロトコルでは正常に使用できます。 - 商業ギロチンで斬首でラットを犠牲に。
- ギロチンを使用すると、前肢と大腿骨の間ラットの体幹を分離します。収集する地域の図は、図 1 aを参照してください。
注: 尾側切断線は大腿骨に吻側だけはずです。脊柱のカットのサイトが大きすぎる場合、腰椎の L6 DRG が摘出されます。 - 胸骨に沿ってカットし、解剖はさみ (図 2 a-) ですべての臓器・組織を削除します。
- ラットの背の部分を収集し、皮膚を削除するトランクの側面に沿ってカットします。切り裂かれた背のトランクの写真の図 1 bを参照してください。
- DRG を収集する前に氷の上のティッシュを準備します。毛皮と手袋から血をきれいにし、次のステップに進む前にエタノール 75% とそれらを殺菌します。
- 腰椎を覆う筋肉を削除します。まず、(左と右) 脊柱の両側に沿って 2 つのカットと腰椎の吻側の範囲をマークする 1 つの水平カットを作る。骨切削鉗子 (図 2 ab) で、脊柱の背側の筋肉を削除します。
- 骨切削鉗子で脊椎骨の背の部分を削除し、脊髄を公開します。
- 解剖はさみ (図 2 a-c) と鉗子 (図 2 a-d) 脊髄を削除します。
- (胸部の椎骨 13) の最後の肋骨から椎体をカウントすることにより腰椎の DRG を識別します。椎骨の位置の図は、図 1を参照してください。
- 2 mL 冷たい無血清培地で 35 mm 培養皿にマイクロ剪刀 (図 2 a-f) と両側腰部後根神経節 (L1 L6) を収集します。DRG を接続する (図 1に示されている)、神経繊維を削除し、文化の純度を改善するために培養皿にそれを転送します。
注: 約 1 時間氷上中で収集した DRG を保存できます。一方、DRG の大きいプールを作成する複数のラットを安楽死することができます。
2. 木材ラット後根神経節の培養
注: 次の手順は、層流フードで実行する必要があります。
- 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1、ピルビン酸ナトリウム 100 mM, 10% 牛胎児血清を含む培養液を準備 DMEM F12 x。
- 細胞培養のコートは、200 μ g/mL ポリ-L-リジンの 2 h の 24 ウェル プレート、滅菌水で洗浄に扱われます。
- 前、少なくとも 30 分間使用する前に 37 ° C CO2インキュベーターで 1 mL 培養液で培養皿を孵化させなさい。
- 層流フードに DRG を含む 35 mm ディッシュを転送し、ピペットで 3 回無血清培地に DRG を洗います。
注: 皿の外側は、ボンネットに転送する前に 75% エタノールで掃除する必要があります。35 mm ディッシュは、ラット (実験的なデザインの要求に応じて変わります) の数から DRG を含めることができます。 - DRG を移動 (単一のラットからまたは複数のラットから結合) 滅菌ピンセット (図 2 a-e) でコラゲナーゼ タイプ IA の 2 mL (1 mg/mL 無血清培地) を含む新しい 35 mm ディッシュに。
注: コラゲナーゼの解決は、0.22 μ m シリンジ フィルターを通してそれを渡すことによって殺菌する必要があります。 - 30 分の 37 ° C CO2インキュベーターでコラゲナーゼの解決の後根神経節を消化します。
- コラゲナーゼの解決を取り外して洗浄 2 mL ハンクの DRG 3 回平衡塩類溶液 (HBSS)。
注: 可能性があります残留繊維や組織液に DRG オフに来る。ピペット洗浄ソリューションを使用してそれらを削除します。 - 2 mL で加温 35 mm ディッシュの後根神経節を含むダイジェスト 30 分の 37 ° C CO2インキュベーターの DRG に 0.05% トリプシン-EDTA を追加します。
- ガラス ピペットで DRG 含有溶液 2 mL を 15 mL 遠心管に転送します。
注: DRG に固執するかもしれないガラス ピペット注意してこの手順を実行する必要がありますので。ガラス ピペット (約 0.5 mL) のテーパー端に DRG を含むソリューションを維持し、遠心管にソリューションをゆっくりと転送が一時停止せず、DRG の損失を避けることができます。 - 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 290 x gでソリューション上澄みを除去し、追加別 2 mL 無血清培地に DRG を再懸濁します。
- 最後に、変更が 2 回手順 2.10 予め温めておいた培に無血清培地を繰り返します。
- 手動で約 60 回使用炎研磨パスツール ピペット DRG カップを刻んだ (長さ 230 mm とヒント頭の内側直径 1 mm)。非研磨のピペットに炎研磨パスツール ピペットのオリフィスを比較写真図 2 bを参照してください。
注: 内部炎研磨パスツール ピペットの直径は約 10% 制御ピペットより小さい、テーパー部分の内側を滑らかにする必要があります。セルを triturating するときに泡を作成しないように注意してください。 - CO2インキュベーターからポリ L リジン コーティング皿を削除します。料理から培養培を吸引でコーティングされた皿に解離細胞をシードします。
- 24 ウェル プレートの 4 つの井戸に 1 匹のラット (12 合計 DRG の L1-L6 から二国間コレクション) から後根神経節細胞を播く24 ウェル プレートのウェル 1 個に約 5 x 10 の4セルがあります。
注: この密度、リリースされた CGRP や SP の検出に適してと免疫染色にも適しています。西部のしみまたは RNA の抽出、6 ウェル プレートのウェル 1 個に 1 匹のラット (二国間 L1 L6) から後根神経節細胞を播きます。 - 10 μ M シタラビン (ARA-C) を追加して次の日に培養液と 100 ng/mL、NGF を交換し、その後にすべての 2 日間媒体を更新します。
注: 胸部の DRG もできますまた培養するこのプロトコルによって胸椎から収集されている場合。
3。 後根神経節細胞における NPFFR2 sirna トランスフェクション
- NPFFR2 sirna トランスフェクションを実行し、製造元のプロトコルによると siRNA を制御します。
注: プロトコルが選択したトランスフェクション試薬が我々 が使用するものと異なる場合に適応する必要があります (表の資料を参照してください)。 - セルめっき後 3 日目 0.5 mL 中古暖かい無血清培地に媒体を変更し、1 h の 37 ° C CO2インキュベーターに DRG を孵化させなさい。
- 追加 50 12.5 μ L 無血清培地に (1 μ L RNase フリー水) の siRNA の nM。
- 2.5 μ L のトランスフェクション試薬を 10 μ L 無血清培地に追加します。
- 室温で 10 分間の手順 3.3 と 3.4 で、ピペットし、この混合トランスフェクションをインキュベート ソリューションからソリューションをミックスします。
- 1 つの後根神経節を含む 24 ウェル プレートにトランスフェクション ソリューションを追加し、穏やかな揺れで媒体と混合します。
注: 複数の井戸を導入する必要がある場合、複数のトランスフェクション ソリューションを同時に展開してください。 - 6 時間 37 ° C CO2インキュベーターに DRG を孵化させなさい。
- 0.5 mL を追加/20% 牛胎児血清、100 mM ピルビン酸ナトリウム、および 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1 を含む培養液の 10 μ M Ara C と 100 ng/mL の NGF、24 ウェル プレートに添加 DMEM-f12 キー、x。
- DRG 別 66 h (更新 48 h で媒体) の 37 ° C CO2インキュベーターで孵化させなさい。
4 主な後根神経節細胞から神経伝達物質の放出
- 6 日目 200 μ L 無血清培地の培養液に変更するセル (siRNA トランスフェクション後 72 h) をメッキした後と 30 分の 37 ° C CO2インキュベーターで細胞をインキュベートします。
- 1 μ L 刺激 chemical(s) を追加し、軽くピペッティングしてメディアをミックスします。37 ° C CO2インキュベーターで皿を指定の時間にインキュベートします。
注: この記事で培養細胞が刺激された NPFFR2 アゴニスト、dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe NH2, 5 nmol) で 1 時間。 - 培養皿中断された不純物を取除くための 4 ° C で 5 分間 5,000 × gで遠心分離から培養培地を収集します。
- 遠心分離から上澄みを収集し、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とサンプルを希釈します。酵素免疫測定法 (EIA) キットと神経伝達物質のレベルを測定します。
注: ここでは、培養上清が薄くされた 1: 100 CGRP のレベルを分析する前に。上清はない SP のレベルを分析する前に希釈しました。
5. CGRP と SP EIA
- CGRP や SP EIA キット製造元のプロトコルに従ってすぐにサンプルを分析します。
注: プロトコルは、使用キットによって異なります。 - キット内の洗浄バッファーで 5 回 CGRP EIA 井戸をすすぎます。
- CGRP EIA ウェルに 100 μ L 抗 CGRP アセチルコリンエステラーゼ (AChE) トレーサーを 100 μ L のサンプルを追加し、50 μ L のサンプル、50 μ L 抗 SP 痛みトレーサー SP EIA 井戸に 50 μ L 抗 SP 抗血清を追加します。
- キット内で提供されているプラスチック フィルムと CGRP と SP の井戸を封印します。
- 4 ° C で一晩ウェルズを孵化させなさい
- CGRP で 5 回洗浄または SP 洗浄バッファー、井戸からすべての残液を取り外します。
- 対応する EIA キット内で提供されている CGRP や SP の井戸に 200 μ L ・ イールマン試薬を追加します。
- CGRP 井戸、室温で 30 分間インキュベートし、室温で 90 分 SP 井戸を孵化させなさい。両方の試金のための光から井戸を保護します。
- 波長 414 nm 帯板を読み、対応する EIA の楽器によると結果を計算します。
注: すべての時間手で井戸の底に触れたり、レンズ クリーニング ワイプ、Ellman 試薬を追加する前に、井戸の底から水の汚れをきれい。
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Representative Results
24 ウェル プレートで培養ラット腰椎 DRG ニューロンは、グリア細胞の増殖を抑制する追加 Ara C と NGF 神経成長をサポートするための培養培地で栽培されました。生活の形態後根神経節細胞が観察されました。図 3に示すように、単一ニューロンの細胞体は日 1 皿の下部に取り付け、観測用に選択されました。軸索の伸長は 1-3 日目から監視されました。グリア細胞は複製され、感覚ニューロンの細胞体を囲むプロセスを拡張します。別の文化で神経細胞の形状を明らかにする CGRP タンパク質が染まりました。図 4、CGRP タンパク質染色細胞質および感覚ニューロンの軸索に表示されます。ニューロンとグリア細胞の核形態、DAPI 染色とは異なります。ニューロン グリア細胞よりも大きくより丸みを帯びた核があります。比較では、グリア細胞の核がより多くの楕円形 (図 4 b) でです。
選択的 NPFFR2 アゴニスト、dNPA、CGRP と SP のリリースを刺激するために使用されました。さらに、NPFFR2 dNPA 刺激伝達物質の放出の依存性は、株細胞 NPFFR2 siRNA によってテストされました。NPFFR2 siRNA またはコントロール siRNA は、プライマリ後根神経節細胞アゴニスト治療前に 72 h に導入させた。後根神経節細胞は、1 h の dNPA (5 nmol) で治療され、CGRP と SP のリリースは、別の EIA キットで測定しました。DRG のシミュレーションを dNPA とメディア (図 5 a, B) の CGRP と SP のレベルの増加。ただし、dNPA 誘起の CGRP リリースだけが培養後根神経節細胞における NPFFR2 siRNA 発現によって抑制されました。図 5に示す結果は、前の文書から変更された、許可22ここで使用されます。
図 1: 組織処理図。3 週齢ラットの腰部後根神経節が収集されます。(A) 動物を削減するギロチンを使用必要がある位置は点線で示されます。(B) 皮膚と背のトランクが削除され、(C) (L1 L6) から腰部後根神経節の位置を示します。挿入は、DRG と接続ファイバーは (これは、矢印で示されます) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DRG 初代培養を隔離するために必要な特別な装置.(A) 手術器具の DRG のコレクションで使用されています。左から右へ: (、) 解剖はさみの (大)、(b) 骨鉗子、(c) 解剖はさみ (小)、(d、 e) を切削ポイント ピンセット、および (f) マイクロ剪刀。(B) A 正規パスツール ピペットと炎研磨パスツール ピペット。「を」示す内部正規パスツール ピペット、と"b"の直径示す内部炎研磨パスツール ピペットの直径。b/≒ 0.9。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 生活の形態後根神経節細胞。ライブ後根神経節細胞は、顕微鏡によって監視されました。細胞は (A) に示すように播種、(B), 播種後 2 日間、(C) 播種後 3 日後の 1 日。矢印を示すニューロンとグリア細胞を示す矢印。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: DRG の細胞の免疫染色。後根神経節細胞はニューロンと 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ニューロンとグリア細胞の核を示す反 CGRP 抗体 immunostained.感覚ニューロンの細胞体と軸索線維 CGRP (A) タンパク質を発現していた。(B) 核ニューロンとグリアは、DAPI でよごれていた。(C) マージされた画像から B. 矢印のニューロンとグリア細胞を示す矢印。スケール バー = 30 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 培養後根神経節細胞からの神経伝達物質の放出します。選択的 NPFFR2 アゴニスト、dNPA、DRG の文化から CGRP と SP のリリースを刺激するために使用されました。NPFFR2 依存性の神経伝達物質のリリースは、NPFFR2 siRNA 細胞株によって確認されました。(AとB) 後後根神経節細胞は NPFFR2 siRNA または非ターゲット コントロール siRNA (72 h) を導入させた、CGRP の放出を誘発する 1 h dNPA (5 nmol) したとの SP データ (SEM) の平均の平均 ± 標準誤差として表現し、t を行ったwo-分散分析 (ANOVA) ボンフェローニのホックを投稿でをテストします。p < 0.01 * * *p < 0.001;対応する車両のコントロールと比較して (N = グループあたり 12)。A と B のパネルは、林らから変更されています。22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿ではラット腰椎のコレクション、酵素分解、文化紹介 DRG。NGF 神経栄養サポート、DRG ニューロンの軸索は細胞播種後 3 日以内延長。拡張の軸索細胞で細胞細胞体で合成され、軸索線維に沿って運ばれる CGRP タンパク質染色後明確に観測される.日以内のニューロンを囲むこれらの分割のグリア細胞をできるように、拡張も衛星細胞のプロセス。このプロトコルにより成長したプライマリの後根神経節細胞はニューロンを調節する細胞メカニズムへの調査に適しています。ここでは、神経ペプチド、CGRP と SP、NPFFR2 の選択的アゴニスト、dNPA による培養 DRG ニューロンからのリリースを刺激します。NPFFR2 は、NPFF の同種の受容体であり痛み感覚と規制経路22,23に参加する報告されています。CGRP と SP リリースの NPFFR2 依存性はさらに NPFFR2 siRNA を用いて検証しました。
DRG の文化には、感覚ニューロンと衛星細胞の両方が含まれています。衛星のグリア細胞はニューロンに代謝サポートを提供し、神経機能9,10を維持します。免疫染色の写真で、核の形が違うので、ニューロンとグリア細胞を識別するために簡単だ (図 4 bに示す)。培養皿の衛星細胞の存在は、グリアとニューロンの特定の機能を区別する実験的需要がある場合は問題になるかもしれない。たとえば、衛星細胞の開発と痛み1124,,の維持に関与しているし、いくつかの研究では、ニューロンとグリア細胞の行動は DRG カルチャを使用して区別するためには難しいだろうことは否定はしません。
このプロトコルでは特別な注意を必要とするいくつかの重要なステップがあります。まず、層流フードの外、DRG を収集しているのでセルの汚染を避けるために、組織のコレクション プロセス中に余分な注意をすべき。人間の手術室のような無菌空間を作成する必要はないはず、機器の滅菌とクリーンの動作空間が不可欠です。汚染を避けるためのヒントには、使用しないときは滅菌袋に滅菌機器を維持し、不要なアイテムの触れることの回避が含まれます。また、ラット体幹や手袋にこだわることがあります毛皮には、生物を汚染を持ち込むことが。など、毛皮と手袋に血痕を 75% エタノールで洗浄によって除去されるべき。また、息や唾から生物の転送を防ぐためにサージカル マスクを着用することをお勧めします。さらに、35 mm ディッシュはすべての時に撒布し、後根神経節内に解剖を配置するときにのみ開きます。酵素消化する前に新しい料理を 35 mm ディッシュを交換することが重要です。酵素消化中に及ばないインキュベーション時間オーバーの消化は、ニューロンを傷つける恐れがありますので。事前の適切な消化効率を達成するために 37 ° C にトリプシン-EDTA を暖かくことを確認します。温度が低い、効率が劇的に減るし、単一細胞懸濁液をパスツール ピペットの炎研磨によって DRG を triturating 達成するために困難になります。炎のピペットを研磨、オリフィスを滑らかにし鋭いガラスのエッジがニューロンを傷つけるを防ぐ。ただし、炎によるピペットの過熱になる内側直径の小さすぎると組織や細胞を含むソリューションが通過しにくくなります。この小径は、コレクタブル DRG ニューロン数を大幅に削減、製粉段階でフォームに多くの気泡をまた引き起こすかもしれません。DRG 文化を処理する必要があります最後に、優しくすべての回で、中規模または実行する薬物治療を変更する場合は特に。
DRG ニューロンは、頻繁に使用する初代培養神経細胞12ことが報告されます。彼らは、様々 な電気生理学や細胞生物学から感覚ニューロンの生理学的または病理学的機能の探索に至るまで、さまざまな研究に利用できます。DRG 初代培養の主要な制限は、彼らが高スループット スクリーニングに適していないことです。単一のラットの DRG から収集されるセルの数が限られていると、ニューロンは文化を複製することができません。一部のセルの数が多いためいくつか DRG ハイブリドーマ細胞株あるいは不死後根神経節神経細胞を初代培養18,19,20を開発したが。ただし、後根神経節細胞の蛋白質発現プロファイルは元の後根神経節と同じにできない場合があり、したがって、各モデル システムを慎重に検証する必要があります。別に研究室で細胞を分離する、ラット胎児または新生児 DRG ニューロンなされた市販。したがって、商業源からの購入は、作りたての DRG 文化に代わる可能性があります。
DRG 初代培養は、大抵痛み関連の研究に用いられた貴重な実験ツールとして長年にわたり使用されています。このモデル系は近い将来交換する可能性が高いです。良質 DRG ニューロンの科学者は神経科学研究の多くの分野の利益安定性と再現性のある結果を取得できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
英語の編集を博士 M. コーキンズを感謝いたします。この作品は、長庚記念病院 (CMRPD1F0482)、長庚大学、健康加齢研究センター (EMRPD1G0171) と省の科学と技術 (105-2320-B-182-012-MY2) によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
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