Summary
पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) प्राथमिक संस्कृतियों अक्सर शारीरिक कार्यों या विकृति संवेदी न्यूरॉन्स में संबंधित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. यहां, हम काठ का डीआरजी संस्कृतियों के उपयोग के लिए न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज के बाद neuropeptide एफएफ रिसेप्टर टाइप 2 एक चयनात्मक एगोनिस्ट के साथ उत्तेजना का पता लगाने के प्रदर्शन ।
Abstract
पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) संवेदी ंयूरॉंस के सेल निकायों होते हैं । इस प्रकार का ंयूरॉन है छद्म एकध्रुवीय, दो axons के साथ कि अंदर आना परिधीय ऊतकों, जैसे त्वचा, मांसपेशी और आंत अंगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की । संवेदी न्यूरॉन्स स्पर्श, दर्द, थर्मल, और proprioceptive उत्तेजना सहित दैहिक अनुभूति, संचारित । इसलिए, डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों व्यापक रूप से nociception के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, संवेदी न्यूरॉन्स के शारीरिक कार्य, और तंत्रिका विकास. प्रसंस्कृत ंयूरॉंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, संकेत transduction, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, या कैल्शियम इमेजिंग शामिल अध्ययन में लागू किया जा सकता है । डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों के साथ, वैज्ञानिकों असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस संस्कृति को एकल या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं, vivo प्रयोगों में से जुड़ी सीमाओं के कई पर काबू पाने । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों या अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों की तुलना में, संरचना और प्राथमिक कोशिकाओं के गुणों के ऊतकों में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए बहुत अधिक समान हैं. हालांकि, एक ही जानवर से पृथक किया जा सकता है कि संस्कृतिपूर्ण डीआरजी प्राथमिक कोशिकाओं की सीमित संख्या के कारण, यह दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है. वर्तमान लेख में, डीआरजी संग्रह और संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, हम neuropeptide एफएफ रिसेप्टर प्रकार के एक एगोनिस्ट के साथ संस्कृतिपूर्ण डीआरजी कोशिकाओं के उपचार का प्रदर्शन 2 (NPFFR2) पेप्टाइड न्यूरोट्रांसमीटर (कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (CRGP) और पदार्थ पी (एसपी)) की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए.
Introduction
संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकायों डीआरजी के भीतर निहित हैं. इन न्यूरॉन्स छद्म एकध्रुवीय और अंदर आना दोनों परिधीय ऊतकों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र हैं । संवेदी न्यूरॉन्स की परिधीय तंत्रिका अंत मांसपेशियों में पाए जाते हैं, त्वचा, आंत अंगों, और अन्य ऊतकों के बीच हड्डी,. वे रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग में तंत्रिका अंत करने के लिए परिधीय अनुभूति संकेतों संचारित और संकेत तो दैहिक अनुभूति1,2के विभिंन आरोही रास्ते के माध्यम से मस्तिष्क को प्रेषित कर रहे हैं । दैहिक अनुभूति शरीर को महसूस करने के लिए सक्षम बनाता है (यानी, स्पर्श, दर्द, और थर्मल उत्तेजना) और अनुभव आंदोलन और स्थानिक उंमुखीकरण (proprioceptive अनुभूतियां)1,3। प्राथमिक afferent axons के चार उपवर्ग हैं जिनमें समूह I (Aα) तंतु शामिल हैं जो कंकाल की मांसपेशियों के proprioception का जवाब देते हैं, समूह द्वितीय (Aβ) तंतुओं कि त्वचा के mechanoreceptors का जवाब देते हैं, और समूह III (Aδ) और समूह V (ग) तंतुओं कि दर्द का जवाब और तापमान. केवल सी फाइबर unmyelinated होते हैं, जबकि बाकी विभिन्न डिग्री के myelinated होते हैं ।
Nociceptors प्राथमिक संवेदी ंयूरॉंस, जो हानिकारक उत्तेजनाओं (यांत्रिक, थर्मल, और रासायनिक उत्तेजना) कि ऊतक क्षति के लिए क्षमता ले द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । इन न्यूरॉन्स myelinated Aδ फाइबर और unmyelinated सी फाइबर से बना रहे हैं1,4. Aδ फाइबर तंत्रिका विकास कारक के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त (NGF, trkA रिसेप्टर), CGRP, और सपा. सी फाइबर या तो peptidergic और गैर peptidergic सी फाइबर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । दूसरी ओर, गैर-peptidergic सी फाइबर glial के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त-व्युत्पंन neurotrophic कारक (GDNF, रेत, और GFR रिसेप्टर्स), isolectin IB4, और एटीपी-gated आयन चैनल उपप्रकार (P2X3)5,6,7. Nociceptors आयन चैनलों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है और neurotrophic कारकों, साइटोकिंस, neuropeptides, एटीपी, या अन्य रासायनिक यौगिकों8द्वारा सक्रिय. उत्तेजना पर, न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP सहित, सपा, और ग्लूटामेट संवेदी ंयूरॉन टर्मिनलों से स्पाइनल पृष्ठीय सींग में nociceptive संकेतों2संचारित करने के लिए जारी किया जा सकता है । डीआरजी न केवल ंयूरॉंस की रचना कर रहे हैं, लेकिन यह भी उपग्रह glial कोशिकाओं में शामिल हैं । सैटेलाइट कोशिकाओं संवेदी ंयूरॉंस चारों ओर और यांत्रिक और चयापचय का समर्थन9,10प्रदान करते हैं । दिलचस्प है, वहां सबूत के एक बढ़ती शरीर का संकेत है कि डीआरजी में उपग्रह glial कोशिकाओं दर्द सनसनी11विनियमन में शामिल किया जा सकता है ।
संवेदी ंयूरॉंस सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं को सूचित किया गया है12 और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयोग किया गया है, संकेत transduction, और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज अध्ययन. उंहोंने यह भी सामांयतः के लिए उपयोग किया जाता है सेलुलर तंत्र का पता लगाने के लिए ंयूरॉन विकास, भड़काऊ दर्द, neuropathic दर्द, त्वचा की अनुभूति (खुजली की तरह), और axon वृद्धि12,13,14,15। डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों असंबद्ध ंयूरॉंस के रूप में एक या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए, वैज्ञानिकों को अध्ययन है कि प्रयोगात्मक विषयों में नहीं किया जा सकता प्रदर्शन करने की अनुमति के रूप में किया जा सकता है । हाल ही में, डीआरजी सफलतापूर्वक मानव अंग दाताओं जो काफी शोधों16लाभ हो सकता है से संस्कृति थे । दूसरी ओर, संवेदी न्यूरॉन्स को भी डीआरजी explants के रूप में कल्चरित किया जा सकता है. डीआरजी explants न्यूरॉन्स के मूल ऊतक वास्तुकला की रक्षा, Schwann कोशिकाओं और उपग्रह glial कोशिकाओं सहित, और विशेष रूप से न्यूरॉन्स और गैर-न्यूरॉन कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं17. डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों २.५ ज के भीतर आसानी से तैयार किया जा सकता है । कोशिका रचना और गुण स्रोत डीआरजी के अत्यधिक चिंतनशील होते हैं, और जैसे, विशिष्ट डीआरजी (काष्ठ या वक्ष डीआरजी) प्रयोगात्मक माँगों के अनुसार एकत्र किए जा सकते हैं । भ्रूण और नवजात डीआरजी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों NGF जीवित रहने के लिए और प्रेरित axon वृद्धि की आवश्यकता है, लेकिन वयस्क न्यूरॉन्स की संस्कृतियों मीडिया12,17करने के लिए neurotrophic कारकों के अलावा की आवश्यकता नहीं है. वहां भी कर रहे है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों जैसे ND7/23 और F11, जो प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार V सदस्य 1 की कमी (TRPV1) अभिव्यक्ति (छोटे संवेदी nociceptive न्यूरॉन्स के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर) और incongruent जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अपने आवेदन18सीमा. हाल ही में, अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों चूहे से व्युत्पंन किया गया है (50B11)19 और माउस (मेड 17.11)20, जो उच्च प्रवाह स्क्रीन में उपयोग के लिए दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । हालांकि, इन सेल लाइनों के लिए जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा अभी तक किया जा सकता है । इस प्रकार, सत्यापन संवेदी न्यूरॉन्स के लिए इन अमर कोशिकाओं की तुलना प्रयोगों अभी भी चल रहे हैं.
NPFFR2 डीआरजी में संश्लेषित और रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग21में संवेदी तंत्रिका टर्मिनलों को translocated है । इस लेख में, हम संवर्धन काठ का डीआरजी कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और उन्हें न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP और एसपी की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए NPFFR2 के एक एगोनिस्ट के साथ इलाज. NPFFR2 पर निर्भरता आगे NPFFR2 छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) का उपयोग कर परीक्षण किया है, जो कल्चरल डीआरजी कोशिकाओं में transfected हो सकता है.
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Protocol
सभी तरीकों कि प्रयोग प्रयोगात्मक पशुओं संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) चांग गुंग विश्वविद्यालय (CGU 13-014) द्वारा अनुमोदित किए गए थे यहां वर्णित ।
1. प्रयोगात्मक चूहों से काठ का डीआरजी लीजिए
- काठ का डीआरजी संग्रह के लिए 2 से 3 सप्ताह पुराने Sprague-Dawley (एसडी) चूहों का प्रयोग करें ।
नोट: डीआरजी न्यूरॉन्स उंर के 4 सप्ताह से अधिक चूहों से एकत्र की संस्कृति शर्तों के तहत अच्छी तरह से विकसित नहीं है यहां वर्णित है । - एक आटोक्लेव में सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
- tiletamine और zolazepam के 1:1 मिश्रण के साथ चूहे Anesthetize (20 मिलीग्राम/intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी)) और पशु एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण में कोई पैर वापसी प्रतिक्रिया से पता चलता है जब तक इंतजार ।
नोट: विभिन्न संज्ञाहरण रणनीतियों सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक कमर्शियल गिलोटिन के साथ decapitation करके चूहे को कुर्बान कर देते हैं ।
- forelimb और फीमर के बीच चूहे के शरीर के तने को अलग करने के लिए गिलोटिन का प्रयोग करें । एकत्र किए जाने वाले क्षेत्र के आरेख के लिए चित्र 1a देखें.
नोट: caudal कट लाइन सिर्फ फीमर को rostral होना चाहिए । अगर कट इट स्पाइनल कॉलम में बहुत ज्यादा है तो काठ का L6 डीआरजी एक्साइज हो जाएगा । - उरोस्थि के साथ कट और विच्छेदन कैंची (चित्रा 2a-ए) के साथ सभी अंगों को हटाने/
- ट्रंक के पक्ष के साथ कट करने के लिए चूहे के पृष्ठीय भाग इकट्ठा करने और त्वचा को हटा दें । विकृत पृष्ठीय ट्रंक की एक तस्वीर के लिए चित्र 1b देखें ।
- डीआरजी इकट्ठा करने से पहले बर्फ पर ऊतक तैयार करें । फर और दस्ताने से खून साफ है, और उंहें ७५% इथेनॉल के साथ अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले निष्फल ।
- काठ की रीढ़ को कवर मांसपेशियों को हटा दें । सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी कॉलम (बाएं और दाएं) और एक पार्श्व कट के पक्षों के साथ दो कटौती करने के लिए काठ का रीढ़ की rostral हद तक चिह्नित । फिर, हड्डी काटने संदंश (चित्रा 2a-बी) के साथ रीढ़ की पृष्ठीय मांसपेशियों को हटा दें ।
- हड्डी काटने संदंश के साथ कशेरुकाओं के पृष्ठीय भाग निकालें और रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश ।
- रीढ़ की हड्डी को विच्छेदी कैंची (चित्रा 2a-सी) और संदंश (चित्रा 2a-डी) के साथ हटा दें ।
- अंतिम पसली (वक्ष बांस 13) से कशेरुकाओं की गिनती करके काठ की डीआरजी को पहचानें । कशेरुकाओं स्थितियों के आरेख के लिए चित्र 1C देखें ।
- द्विपक्षीय काठ की डीआरजी (L1-L6) को माइक्रो-कैंची (चित्रा 2a-एफ) के साथ एक ३५ मिमी संस्कृति डिश में 2 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा सीरम मुक्त माध्यम से ले लीजिए । न्यूरॉन्स निकालें (के रूप में चित्रा 1Cमें संकेत के रूप में) डीआरजी जोड़ने से, तो संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करने के लिए संस्कृतियों की पवित्रता में सुधार.
नोट: एकत्र डीआरजी के बारे में 1 एच के लिए बर्फ पर मध्यम में रखा जा सकता है । इस बीच, एकाधिक चूहों डीआरजी का एक बड़ा पूल बनाने के लिए euthanized जा सकता है ।
2. चूहा लकड़ी डीआरजी की प्राथमिक संस्कृति
नोट: निंनलिखित कदम एक लामिना प्रवाह हूड में किया जाना चाहिए ।
- संस्कृति मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० mM सोडियम पाइरूवेट, और 1x पेनिसिलिन/streptomycin में 1x DMEM-F12 युक्त तैयार करें ।
- कोट कोशिका-संस्कृति का इलाज 24-खैर प्लेट के साथ २०० µ जी/एमएल पाली-एल-lysine 2 एच के लिए फिर निष्फल पानी से धो लें ।
- पूर्व में 1 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम के साथ संस्कृति डिश एक ३७ डिग्री सेल्सियस में सह2 मशीन के लिए उपयोग करने से पहले ंयूनतम 30 मिनट के लिए ।
- एक लामिना हूड में डीआरजी-युक्त ३५ mm डिश हस्तांतरण, और पिपेट द्वारा सीरम मुक्त माध्यम 3 बार के साथ डीआरजी धो लो ।
नोट: पकवान के बाहर डाकू में स्थानांतरित करने से पहले ७५% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए । ३५ mm डिश चूहों की एक संख्या से डीआरजी शामिल कर सकते है (यह प्रयोगात्मक डिजाइन की मांगों पर निर्भर करेगा) । - डीआरजी (एक चूहे से या एकाधिक चूहों से संयुक्त) एक नया ३५ mm संस्कृति डिश है, जो collagenase प्रकार IA (1 मिलीग्राम/एमएल के सीरम मुक्त माध्यम में) बाँझ चिमटी (चित्रा 2a-ई) के साथ के 2 मिलीलीटर शामिल करने के लिए ले जाएँ ।
नोट: collagenase समाधान यह एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए । - 30 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में collagenase समाधान में डीआरजी पचा ।
- collagenase समाधान निकालें और डीआरजी 3 बार 2 मिलीलीटर हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) में धो लें ।
नोट: अवशिष्ट फाइबर या ऊतकों कि समाधान में बंद डीआरजी आ सकता है । उन्हें धोने के समाधान के साथ पिपेट द्वारा निकालें । - जोड़ें 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म ०.०५% trypsin-EDTA डीआरजी युक्त ३५ mm पकवान में और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में डीआरजी को पचाने में 30 मिनट के लिए सह2 मशीन ।
- ग्लास पिपेट द्वारा एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए डीआरजी युक्त समाधान के 2 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
नोट: डीआरजी ग्लास पिपेट के लिए छड़ी हो सकता है तो इस कदम की देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । डीआरजी हानि डीआरजी-युक्त समाधान एक गिलास पिपेट के पतला अंत में रखने से बचा जा सकता है (के बारे में ०.५ मिलीलीटर) और समाधान में स्थानांतरित करने के केंद्रापसारक ट्यूब धीरे लेकिन बिना रुके । - 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २९० x g पर समाधान केंद्रापसारक । supernatant निकालें और डीआरजी को पुनः निलंबित करने के लिए एक और 2 मिलीलीटर सीरम-मुक्त माध्यम जोड़ें ।
- दोहराएँ चरण २.१० 2 बार लेकिन सीरम मुक्त माध्यम से पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के लिए अंतिम समय पर बदल जाते हैं.
- मैन्युअल triturate डीआरजी लगभग ६० बार एक लौ पॉलिश पाश्चर पिपेट (लंबाई २३० मिमी और टिप सिर भीतरी व्यास 1 मिमी) का उपयोग कर. एक गैर पॉलिश पिपेट के लिए एक लौ पॉलिश पाश्चर पिपेट के छिद्र की तुलना एक तस्वीर के लिए चित्र b देखें ।
नोट: लौ के अंदर व्यास-पॉलिश पाश्चर पिपेट लगभग 10% नियंत्रण पिपेट से छोटा है और पतला अंत के अंदर चिकनी होना चाहिए । कोशिकाओं triturating जब बुलबुले बनाने के लिए नहीं सावधान रहना । - सह2 मशीन से पाली-एल-lysine-लेपित पकवान निकालें । महाप्राण पकवान से मशीनी संस्कृति मध्यम, और बीज लेपित पकवान पर असंबद्ध कोशिकाओं ।
- एक चूहे से डीआरजी कोशिकाओं को बीज (द्विपक्षीय संग्रह से L1-L6, 12 कुल डीआरजी के लिए) एक 24-वेल प्लेट के चार कुओं में; वहां लगभग रहे है 5 x 104 एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं ।
नोट: यह घनत्व जारी CGRP या सपा का पता लगाने के लिए उपयुक्त है और यह भी immunostaining के लिए उपयुक्त है । पश्चिमी दाग या आरएनए निष्कर्षण के लिए, एक चूहे से डीआरजी कोशिकाओं बीज (द्विपक्षीय L1-L6) एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली में । - 10 µ m cytarabine (आरा-सी) और १०० एनजी/एमएल NGF के अलावा के साथ अगले दिन पर संस्कृति माध्यम की जगह है, और इसके बाद हर दो दिन मध्यम ताज़ा ।
नोट: वक्ष डीआरजी भी इस प्रोटोकोल से कल्चरित हो सकते हैं, यदि वे वक्ष रीढ़ की हड्डी से एकत्र हो गए हों ।
3. डीआरजी कोशिकाओं में NPFFR2 सिरना की अभिकर्मक
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार NPFFR2 सिरना और नियंत्रण सिरना के अभिकर्मक को निष्पादित करें ।
नोट: प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए अगर चुना अभिकर्मक एजेंट एक हम इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें) से अलग है । - 3 दिन पर सेल चढ़ाना के बाद, मध्यम ०.५ मिलीलीटर पूर्व गर्म सीरम मुक्त माध्यम बदलने के लिए और 1 एच के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह2 मशीन में डीआरजी गर्मी ।
- सिरना के ५० एनएम जोड़ें (1 µ एल RNase में मुफ्त पानी) १२.५ µ एल सीरम मुक्त माध्यम में ।
- 10 µ एल सीरम मुक्त माध्यम में २.५ µ एल अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें ।
- पिपेट द्वारा कदम ३.३ और ३.४ से समाधान मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इस मिश्रित अभिकर्मक समाधान मशीन ।
- एक डीआरजी-24-well प्लेट युक्त में अभिकर्मक समाधान जोड़ें और मध्यम के साथ कोमल मिलाते हुए समाधान मिश्रण ।
नोट: एकाधिक कुओं transfected होने की जरूरत है, तो एक ही समय में कई अभिकर्मक समाधान लागू किया जाना चाहिए । - 6 एच के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में डीआरजी मशीन
- 24-वेल प्लेट में 10 µ मीटर आरा-सी और १०० एनजी/एमएल NGF के अलावा, ०.५ मिलीलीटर/साथ ही संस्कृति माध्यम के 20% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० mM सोडियम पाइरूवेट, और 1x पेनिसिलिन/streptomycin 1x DMEM-F12 में जोड़ें ।
- एक और ६६ एच के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में डीआरजी मशीन (४८ एच पर मध्यम ताज़ा) ।
4. प्राथमिक डीआरजी कोशिकाओं से न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज
- 6 दिन के बाद कोशिकाओं को चढ़ाया गया (७२ सिरना अभिकर्मक के बाद एच), २०० µ एल सीरम मुक्त माध्यम के लिए संस्कृति माध्यम बदलने के लिए, और 30 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
- जोड़ें 1 µ l उत्तेजना रासायनिक (ओं) और धीरे से pipetting द्वारा मीडिया मिश्रण. निर्दिष्ट समय के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में पकवान मशीन ।
नोट: इस आलेख में, प्रसंस्कृत कोशिकाओं NPFFR2 एगोनिस्ट, dNPA (Asn-प्रो-(N-Me) ाला-Phe-लियू-Phe-Gln-प्रो-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), 1 एच के लिए के साथ उत्तेजित थे । - संस्कृति डिश से संस्कृति माध्यम लीजिए और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५,००० x g पर किसी भी निलंबित दोष को दूर करने के लिए केंद्रापसारक ।
- इस केंद्रापसारक से supernatant लीजिए और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ नमूनों को पतला, के रूप में की जरूरत है । एंजाइम immunoassay (ईआईए) किट के साथ न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर परख.
नोट: यहां, supernatants CGRP के स्तर का विश्लेषण करने से पहले 1:100 पतला थे । एसपी के स्तर का विश्लेषण करने से पहले supernatant को पतला नहीं किया गया ।
5. CGRP और एसपी ईआईए
- CGRP या एसपी ईआईए किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार तुरंत नमूनों का विश्लेषण करें ।
नोट: प्रोटोकॉल का उपयोग किट के आधार पर भिन्न होगा । - CGRP ईआईए वेल्स कुल्ला के साथ 5 बार धो बफर किट के भीतर की आपूर्ति की ।
- जोड़ें १०० µ एल विरोधी CGRP एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) अनुरेखक के साथ १०० µ एल नमूने CGRP ईआईए वेल्स में, और जोड़ें ५० µ l नमूने, ५० µ l विरोधी सपा दर्द अनुरेखक और ५० µ एल विरोधी सपा आनटिसम में सपा के ईआईए वेल्स ।
- प्लास्टिक फिल्म जो किट के भीतर की आपूर्ति की है के साथ CGRP और एसपी वेल्स सील ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कुएं की मशीन ।
- कुओं को CGRP या एसपी वॉश बफर के साथ ५ बार धोएं और कुएँ से सारे अवशिष्ट हल निकाल लें.
- CGRP या एसपी वेल्स जो इसी ईआईए किट के भीतर आपूर्ति की है में २०० µ एल Ellman के रिएजेंट जोड़ें ।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए CGRP कुओं की मशीन, और कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए सपा वेल्स मशीन । दोनों की परख के लिए कुओं को रोशनी से सुरक्षित रखें ।
- तरंग दैर्ध्य ४१४ एनएम पर प्लेटों पढ़ें और इसी ईआईए साधन के अनुसार परिणामों की गणना ।
नोट: हर समय हाथ से कुओं के नीचे छूने से बचें और Ellman के रिएजेंट को जोड़ने से पहले लेंस की सफाई करके अच्छी तरह से नीचे से पानी के दाग साफ करें ।
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Representative Results
चूहा काठ का डीआरजी ंयूरॉंस, एक 24 अच्छी तरह से थाली में, संस्कृति माध्यम में अतिरिक्त आरा-सी के साथ glial कोशिका प्रसार और NGF को बाधित करने के लिए ंयूरॉन विकास का समर्थन हो रहे थे । जीवित डीआरजी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान मनाया गया । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, एक एकल ंयूरॉन के सेल शरीर 1 दिन में एक डिश के नीचे पर जुड़ा हुआ था और अवलोकन के लिए चयनित । Axon वृद्धि 1 दिन से नजर रखी थी-3 । glial कोशिकाओं दोहराया और विस्तारित प्रक्रियाओं संवेदी ंयूरॉन के सेल शरीर के चारों ओर । एक और संस्कृति में, CGRP प्रोटीन ंयूरॉंस के आकार प्रकट करने के लिए दाग था । चित्रा 4में, CGRP प्रोटीन धुंधला संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका द्रव्य और axons में दिखाई देता है । न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के परमाणु morphologies भेद कर रहे हैं जब DAPI के साथ दाग. न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं की तुलना में एक बड़ा और अधिक गोल नाभिक है. तुलना करके, glia के नाभिक आकार में अधिक अंडाकार होते हैं (फिगर 4B).
चयनात्मक NPFFR2 एगोनिस्ट, dNPA, CGRP और सपा की रिहाई को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अलावा, dNPA की निर्भरता-NPFFR2 पर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज उत्तेजित NPFFR2 सिरना के साथ transfecting कोशिकाओं द्वारा परीक्षण किया गया था. NPFFR2 सिरना या नियंत्रण सिरना प्राथमिक डीआरजी कोशिकाओं ७२ ज में एगोनिस्ट उपचार के लिए पहले transfected थे । डीआरजी कोशिकाओं 1 ज के लिए dNPA (5 nmol) के साथ इलाज किया गया और CGRP और सपा के रिलीज के अलग ईआईए किट से मापा गया था । dNPA के साथ डीआरजी के अनुकरण ने मीडिया में CGRP और सपा का स्तर बढ़ाया (चित्र 5 ए, बी) । तथापि, केवल dNPA प्रेरित CGRP रिलीज NPFFR2 सिरना की अभिव्यक्ति द्वारा संस्कृतिपूर्ण डीआरजी कोशिकाओं में बाधा था । चित्र 5 में दिखाए गए परिणामों को पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया था और22अनुमति के साथ यहां उपयोग किए जाते हैं ।
चित्र 1: ऊतक प्रसंस्करण आरेख । काठ के डीआरजी ३ सप्ताह पुराने चूहों से एकत्र किए जाते हैं. (क) स्थितियां जहां गिलोटिन जानवर कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए बिंदीदार लाइनों द्वारा संकेत दिया जाता है । (ख) निकाली गई त्वचा के साथ पृष्ठीय ट्रंक और (ग) काष्ठ डीआरजी के स्थान (L1-L6 से) दर्शाए गए हैं. insert डीआरजी और जोड़ने फाइबर का प्रतिनिधित्व करता है (जो तीर से संकेत मिलता है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: विशेष डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों को अलग करने के लिए आवश्यक उपकरण । (क) डीआरजी के संग्रह में प्रयुक्त शल्य चिकित्सा यंत्र. बाएं से दाएं: (a) विच्छेदन कैंची (बड़ी), (b) अस्थि काटना संदंश, (c) विच्छेदन कैंची (छोटा), (d, e) बिंदु चिमटी, और (च) माइक्रो-कैंची । (ख) एक नियमित पाश्चर पिपेट और एक लौ पॉलिश पाश्चर पिपेट । "एक" नियमित पाश्चर पिपेट के अंदर व्यास का अर्थ है, और "बी" लौ के अंदर व्यास-पॉलिश पाश्चर पिपेट का अर्थ है । b/अ ≒ ०.९. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: डीआरजी कोशिकाओं के रहने की आकृति विज्ञान । जियो डीआरजी कोशिकाओं सूक्ष्म द्वारा निगरानी की गई । कोशिकाओं को दिखाया जाता है (A) बोने के बाद एक दिन, (ख) बोने के दो दिन बाद, और (C) तीन दिन बाद सीडिंग । तीर ंयूरॉन और ऐरोहेड संकेत glia संकेत मिलता है । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: कल्चर्ड डीआरजी कोशिकाओं का Immunostaining । न्यूरॉन्स और diamidino कोशिकाओं के phenylindole के लिए न्यूरॉन्स, और 4 ', 6-DAPI-2-नाभिक (glial) दिखाने के लिए डीआरजी कोशिकाओं को एंटी-CGRP एंटीबॉडी के साथ immunostained किया गया । (क) CGRP प्रोटीन संवेदी ंयूरॉन कोशिका निकायों और axon फाइबर में व्यक्त किया गया था । (ख) न्यूरॉन्स और glia का नाभिक DAPI से सना हुआ था. (ग) से विलय चित्र a और B. Arrow इंगित करता है एक ंयूरॉन और arrowhead एक glial सेल इंगित करता है । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: कल्चर्ड डीआरजी कोशिकाओं से न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई. चयनात्मक NPFFR2 एगोनिस्ट, dNPA, डीआरजी संस्कृतियों से CGRP और सपा की रिहाई को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । NPFFR2 पर न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की निर्भरता NPFFR2 सिरना के साथ transfecting कोशिकाओं द्वारा सत्यापित किया गया था. (A और B) डीआरजी कक्षों को NPFFR2 सिरना या गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण सिरना (७२ h) के साथ transfected किया गया था, dNPA (5 nmol) 1 ज के लिए लागू किया गया था CGRP और सपा की रिहाई के लिए प्रेरित । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त कर रहे है अर्थ (SEM) और टी द्वारा विश्लेषण किया गया Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षणों के साथ प्रसरण (ANOVA) का-तरफ़ा विश्लेषण । * *p < 0.01, * * *p < 0.001; इसी वाहन नियंत्रण (N = 12 प्रति समूह) की तुलना में । पैनलों A और B को Lin et al से संशोधित किया गया है । 22 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
वर्तमान लेख में, हम संग्रह, एंजाइम-पृथक्करण, और चूहा काठ का डीआरजी की संस्कृति का प्रदर्शन । NGF से neurotrophic समर्थन के साथ, डीआरजी न्यूरॉन्स की axons सेल बोने के बाद 3 दिनों के भीतर विस्तारित. विस्तारित axons स्पष्ट रूप से देख रहे थे कोशिकाओं CGRP प्रोटीन है, जो सेल सोमा में संश्लेषित और axon फाइबर के साथ ले जाया जाता है के लिए दाग थे । सैटेलाइट कोशिकाओं की प्रक्रियाओं को भी बढ़ाया, इन विभाजन glial कोशिकाओं को दिन के भीतर ंयूरॉंस के चारों ओर की अनुमति । प्राथमिक डीआरजी इस प्रोटोकॉल द्वारा उगाया कोशिकाओं सेलुलर तंत्र है कि संवेदी ंयूरॉंस विनियमित में जांच के लिए उपयुक्त हैं । यहां, हम neuropeptides, CGRP और सपा की रिहाई, एक चयनात्मक NPFFR2 एगोनिस्ट, dNPA द्वारा कल्चरल डीआरजी न्यूरॉन्स से उत्तेजित । NPFFR2 NPFF के लिए cognate रिसेप्टर है और दर्द की अनुभूति और विनियमन रास्ते में भाग लेने के लिए सूचित किया गया है22,23. CGRP और सपा के रिलीज के NPFFR2 निर्भरता NPFFR2 सिरना के उपयोग से आगे सत्यापित किया गया था ।
डीआरजी संस्कृतियों दोनों संवेदी ंयूरॉंस और उपग्रह glial कोशिकाओं होते हैं । उपग्रह glial कोशिकाओं ंयूरॉंस को चयापचय समर्थन प्रदान करते है और बनाए रखने के ंयूरॉन कार्यों9,10। immunostaining चित्रों में, यह न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आसान है, क्योंकि उनके नाभिक अलग आकार के हैं ( चित्रा 4Bमें दिखाएँ). संस्कृति डिश में उपग्रह कोशिकाओं के अस्तित्व समस्याग्रस्त अगर वहां एक प्रयोगात्मक मांग ंयूरॉंस और glia के विशिष्ट समारोह के बीच अंतर है हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह निर्विवाद है कि उपग्रह कोशिकाओं के विकास में शामिल हैं और11,24दर्द के रखरखाव, और कुछ अध्ययनों में, न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की कार्रवाई डीआरजी संस्कृतियों का उपयोग अंतर करने के लिए मुश्किल होगा.
इस प्रोटोकॉल में, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता होती है । सबसे पहले, के बाद से डीआरजी लामिना हूड के बाहर एकत्र कर रहे हैं, अतिरिक्त देखभाल कोशिका संदूषण से बचने के लिए ऊतक संग्रह प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए । एक बाँझ अंतरिक्ष बनाने के लिए कोई जरूरत नहीं होना चाहिए, एक मानव शल्य चिकित्सा कक्ष में की तरह, लेकिन साधन नसबंदी और एक स्वच्छ ऑपरेटिंग अंतरिक्ष आवश्यक हैं. संदूषण से बचने के लिए युक्तियां उपयोग में न आने पर नसबंदी थैली पर निष्फल यंत्र रखने और किसी भी अनावश्यक वस्तुओं को छूने से परहेज करने में शामिल हैं. इसके अलावा, दूषित जीवों फर है कि चूहे शरीर ट्रंक या दस्ताने से चिपके हो सकता है पर ले जाया जा सकता है । जैसे, फर और दस्ताने पर bloodstains ७५% इथेनॉल के साथ सफाई से हटा दिया जाना चाहिए । सांस या लार से जीवों के स्थानांतरण को रोकने के लिए शल्य मास्क पहनना संचालक के लिए भी मददगार होता है । इसके अलावा, ३५-mm पकवान हर समय बंद रखा जाना चाहिए और केवल खोला जब रखने के अंदर विदारक डीआरजी । यह एंजाइम पाचन से पहले एक नई डिश के साथ ३५ mm डिश की जगह महत्वपूर्ण है । एंजाइम पाचन के दौरान, गर्मी समय का विस्तार नहीं है, के बाद से अधिक पाचन ंयूरॉंस को नुकसान हो सकता है । trypsin-EDTA करने के लिए ३७ ° c के लिए पूर्व गर्म करने के लिए सुनिश्चित करें ताकि उचित पाचन दक्षता प्राप्त करने के लिए । दक्षता कम तापमान में नाटकीय रूप से कम हो जाएगा, और यह लौ पॉलिश पाश्चर पिपेट द्वारा डीआरजी triturating जब एक एकल सेल निलंबन हासिल करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । लौ चमकाने पिपेट छिद्र चिकनी और न्यूरॉन्स घायल होने से तेज कांच के किनारे को रोकने जाएगा । हालांकि, एक लौ के साथ पिपेट overheating अंदर व्यास बहुत छोटा कर देगा, और ऊतक-या कोशिका युक्त समाधान के माध्यम से पारित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । यह कम व्यास भी कई बुलबुले trituration चरण के दौरान फार्म करने के लिए, बहुत डीआरजी ंयूरॉंस की संग्रहणीय संख्या को कम करने के कारण हो सकता है । अंत में, डीआरजी संस्कृतियों हर समय धीरे से नियंत्रित किया जाना चाहिए, खासकर जब मध्यम या दवा उपचार प्रदर्शन बदल रहा है ।
डीआरजी ंयूरॉंस की रिपोर्ट कर रहे है सबसे अक्सर इस्तेमाल प्राथमिक प्रसंस्कृत ंयूरॉन कोशिकाओं12। वे विभिंन अध्ययनों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जा सकता है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या सेल जीव विज्ञान से लेकर संवेदी न्यूरॉन्स के शारीरिक या रोग कार्यों की खोज करने के लिए । डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों की प्रमुख सीमा है कि वे उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं । कोशिकाओं की संख्या है कि एक एकल चूहे के डीआरजी से एकत्र किया जा सकता है सीमित हैं, और न्यूरॉन्स संस्कृति में नकल करने में असमर्थ हैं. सीमित सेल संख्या के कारण, कई डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों या अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों प्राथमिक संस्कृतियों18,19,20की जगह के लिए विकसित किया गया है. हालांकि, डीआरजी सेल लाइनों के प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल मूल डीआरजी के रूप में ही नहीं हो सकता है और, इस प्रकार, प्रत्येक मॉडल प्रणाली को ध्यान से सत्यापित करने की जरूरत है । लैब में कोशिकाओं को अलग करने के अलावा, चूहे भ्रूण या नवजात डीआरजी न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कराया गया है. इसलिए, वाणिज्यिक स्रोतों से खरीद हौसले से तैयार डीआरजी संस्कृतियों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है ।
डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों के एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण है कि ज्यादातर दर्द से संबंधित अध्ययन में अपनाया है के रूप में कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस मॉडल सिस्टम को निकट भविष्य में बदला जाने की संभावना नहीं है । अच्छी गुणवत्ता डीआरजी ंयूरॉंस के साथ, वैज्ञानिकों स्थिर और reproducible परिणाम है कि तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के कई क्षेत्रों को लाभ प्राप्त कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अंग्रेजी संपादन के लिए डॉ एम Calkins धंयवाद । इस काम चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPD1F0482), चांग गुंग विश्वविद्यालय, स्वस्थ एजिंग अनुसंधान केंद्र (EMRPD1G0171) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2320-B-182-012-MY2) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
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