Summary
Dorsal root Ganglion (DRG) primære kulturer brukes ofte til å studere fysiologiske funksjoner eller patologi-relaterte hendelser i sensoriske neurons. Her viser vi bruk av lumbale DRG kulturer å oppdage utgivelsen av nevrotransmittere etter neuropeptide FF reseptor type 2 stimulering med en selektiv Agonistiske.
Abstract
Dorsal root Ganglion (DRG) inneholder cellen legemer sensoriske neurons. Denne Nevron er pseudo Unipolare, med to axons som innervate perifere vev, for eksempel hud, muskler og visceral organer, samt spinal dorsal Hornet av det sentrale nervesystemet. Sensoriske neurons overføre somatiske følelsen, inkludert touch, smerte, temperatur og proprioceptive opplevelser. Derfor er DRG primære kulturer mye brukt til å studere cellulære mekanismer for nociception, fysiologiske funksjoner sensoriske neurons og neural utvikling. Kultivert neurons kan brukes i studier som involverer elektrofysiologi, signaltransduksjon, nevrotransmitter-løslate eller kalsium bildebehandling. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissosiert DRG neurons å overvåke biokjemiske endringer i én eller flere celler, overvinne mange av begrensningene knyttet i vivo eksperimenter. Sammenlignet kommersielt er tilgjengelig DRG-hybridoma linjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, komposisjon og egenskaper av primære cellene mye mer lik sensoriske neurons i vev. På grunn av begrenset antall kulturperler DRG primære celler som kan isoleres fra en enkelt dyr, er det imidlertid vanskelig å utføre høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. I gjeldende artikkel er prosedyrer for DRG samling og kultur beskrevet. I tillegg viser vi behandling av kultivert DRG celler med en Agonistiske neuropeptide FF reseptor type 2 (NPFFR2) å indusere utgivelsen av peptid nevrotransmittere (calcitonin gen-relaterte peptid (CRGP) og substans P (SP)).
Introduction
Cellen legemer sensoriske neurons er innenfor DRG. Disse neurons er pseudo Unipolare og innervate både perifere vev og sentralnervesystemet. De eksterne nerveender sensoriske neurons finnes i muskler, hud, visceral organer og bein, blant andre vev. De overføre perifere sensasjon signaler til nerve avslutninger i spinal dorsal Hornet og signaler overføres deretter til hjernen via ulike stigende veier somatiske sensasjon1,2. Somatiske følelsen gjør kroppen til å føle (dvs., touch, smerte og termisk opplevelser) og oppfatte bevegelse og romlig orientering (proprioceptive opplevelser)1,3. Det er fire underklasser av primære afferente axons, inkludert gruppe I (Aα) fibre som svarer til Propriosepsjon av muskler, gruppe II (Aβ) fibre som svarer til mechanoreceptors av huden, og gruppere III (Aδ) og gruppe V (C) fibre som svarer til smerte og temperatur. Bare C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinated til ulike grader.
Nociceptors er primære sensoriske neurons, som er aktivert av skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kjemisk stimulering) som bærer potensialet for skade på vev. Disse neurons består av myelinated Aδ fiber og unmyelinated C fiber1,4. Aδ fiber express receptors for nerve vekst faktor (NGF, trkA reseptor), CGRP og SP. C fiber er klassifisert som enten peptidergic og ikke-peptidergic C fibre. På den annen side, uttrykke ikke-peptidergic C fibrene reseptorer for glial-avledet nevrotropisk faktor (GDNF, RET og GFR reseptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion kanal undertypen (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan karakteriseres av uttrykk for ionekanaler og aktiveres av nevrotropisk faktorer, cytokiner, neuropeptides, ATP eller andre kjemiske forbindelser8. Ved stimulering, kan nevrotransmittere, inkludert CGRP, SP og glutamat bli løslatt fra sensoriske Nevron terminaler i spinal dorsal horn å overføre nociceptive signaler2. DRG er ikke bare består av nevroner, men også inneholde satellitt gliacellene. Satellitt celler omgir sensoriske neurons og gir mekanisk og metabolske støtte9,10. Interessant er det en voksende mengde bevis som indikerer at satellitt gliacellene i DRG kan være involvert i å regulere smerte sensasjon11.
Sensoriske neurons er rapportert å være mest ofte brukte primære neuronal celler12 og har vært benyttet for elektrofysiologi, signaltransduksjon og nevrotransmitter utgivelsen studier. De er også vanlig å utforske cellulære mekanismer for neuronal utvikling, inflammatorisk smerte, nevropatisk smerte, hud sensasjon (som klør) og axon utvekst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan kultivert som dissosiert neurons å vurdere biokjemiske endringer i én eller flere celler, slik at forskere å utføre studier som ikke kan utføres i eksperimentell fag. Nylig DRG var vellykket kultivert fra menneskelige orgel givere som kan ha stor nytte translasjonsforskning16. På den annen side, kan sensoriske neurons også bli kultivert som DRG explants. De DRG explants bevare den opprinnelige vev arkitekturen av neurons, inkludert Schwann cellene og satellitt gliacellene, og er spesielt nyttig å studere samspillet mellom cellene neuronal og ikke-neuronal17. DRG primære kulturer kan lett tilberedes innen 2,5 timer. Cellen sammensetning og egenskaper er svært reflekterende av DRG slik bestemt DRG (lumbale eller thorax DRG) kan samles etter eksperimentelle krav. Kulturer av embryonale og neonatal DRG neurons kreve NGF å overleve og indusere axon utvekst, men kulturer av voksen neurons krever ikke tillegg av nevrotropisk faktorer til media12,17. Der er likeledes kommersielt anvendelig DRG-hybridoma linjer som ND7/23 og F11, som ikke krever bruk av forsøksdyr. Men mangel på forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 1 (TRPV1) uttrykk (en viktig markør for små sensoriske nociceptive neurons) og incongruent genet uttrykket profiler begrense deres programmer18. Nylig udødeliggjort DRG neuronal cellen linjer ha blitt avledet fra rotten (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet for bruk i høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. Gene expression profilering for disse linjer har imidlertid likevel skal utføres. Dermed er validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort cellene sensoriske neurons fortsatt pågående.
NPFFR2 er syntetisert i DRG og translocated til sensoriske nerve terminalene i spinal dorsal horn21. I denne artikkelen gir vi en protokoll for dyrking lumbale DRG celler og behandle dem med en Agonistiske av NPFFR2 å indusere utgivelsen av nevrotransmittere, CGRP og SP. Avhengigheten av NPFFR2 er videre testet med NPFFR2 lite forstyrrende RNA (siRNA), som kan være transfected i kulturperler DRG cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her, og som bruker forsøksdyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruke Committee (IACUC) av Chang Gung University (CGU 13-014).
1. samle lumbale DRG fra Experimental rotter
- Bruk 2 til 3 uke gamle Sprague-Dawley (SD) rotter lumbale DRG samling.
Merk: DRG neurons samlet fra rotter over 4 uker gammel vokser ikke godt under kultur betingelsene beskrevet her. - Sterilisere alle kirurgiske instrumenter i en autoklav.
- Bedøve rotte med en 1:1 blanding av tiletamine og zolazepam (20 mg/kg, intraperitoneal injeksjon (IP)) og vente til dyret viser ingen foten-uttak svar i en tå-klype test.
Merk: Forskjellige anestesi strategier kan brukes med hell i denne protokollen. - Ofre rotta ved halshogging med en kommersiell giljotinen.
- Bruk giljotinen isolere kroppen stammen av rotte mellom forlemen og femur. Se figur 1A for et diagram av regionen skal samles inn.
Merk: Caudal cut-linjen skal bare rostral til femur. Vil kreditert lumbale L6 DRG hvis webområdet kutt er for høy i ryggraden. - Skjær langs sternum og Fjern alle organer/vev med disseksjon saks (figur 2A-en).
- Skjær langs siden av bagasjerommet å samle den dorsal delen av rotte og fjerne hud. Se figur 1B for et fotografi av dissekert dorsal bagasjerommet.
- Forberede vev på is før samle DRG. Rengjør pels og blod fra hansker og sperre med 75% etanol før du fortsetter til neste trinn.
- Fjerne musklene dekker lumbalcolumna. Først lager du to kutt langs sidene av ryggraden (venstre og høyre) og en lateral kutt merke rostral omfanget av lumbalcolumna. Deretter fjerner du rygg musklene i ryggen med bein kutte tang (figur 2A-b).
- Fjern den dorsal delen av ryggsøylen med bein kutte tang og utsette ryggmargen.
- Fjerne ryggmargen disseksjon saks (figur 2A-c) og tang (figur 2A-d).
- Identifisere lumbale DRG ved å telle ryggvirvlene fra siste vrborden (thorax Vertebra 13). Se figur 1 c for et diagram av ryggsøylen posisjoner.
- Samle den bilaterale lumbale DRG (L1-L6) med mikro-saks (figur 2A-f) i en 35 mm kultur parabol med 2 mL iskald serum-free medium. Fjern neuronal fiber (som vist i figur 1 c) kobler DRG og overføre den til kultur parabol å forbedre renheten av kulturer.
Merk: Den innsamlede DRG kan holdes i medium på isen i ca 1 time. I mellomtiden kan flere rotter være euthanized for å opprette et større utvalg av DRG.
2. primære kultur av rotte trelast DRG
Merk: Følgende trinn skal utføres i laminær strømning hette.
- Forberede kultur medium inneholder 10% fosterets bovin serum, 100 mM natrium pyruvate og 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12.
- Pels i cellekultur behandlet 24-vel plate med 200 µg/mL poly-L-lysin for 2t og vask med sterilisert vann.
- Pre ruge kultur parabol med 1 mL kultur medium i en 37 ° C CO2 inkubator før bruk i minst 30 min.
- Overføre DRG inneholder 35 mm rett til laminær hette og vask DRG med serum-free medium 3 ganger av pipette.
Merk: Utsiden av parabolen bør rengjøres med 75% etanol før overføring til panseret. 35 mm parabolen kan inneholde DRG fra en rekke rotter (dette avhenger av kravene fra experimental design). - Flytte DRG (fra en enkelt rotte eller kombinert fra flere rotter) til en ny 35 mm kultur parabol, som inneholder 2 mL collagenase type IA (1 mg/mL i serum-free medium) med sterilt pinsett (figur 2A-e).
Merk: Collagenase løsningen skal steriliseres ved passerer det gjennom en 0.22 µm sprøyten. - Fordøye DRG i collagenase løsningen i en 37 ° C CO2 inkubator for 30 min.
- Fjern collagenase løsningen og vask DRG 3 ganger i 2 mL Hanks balansert salt løsning (HBSS).
Merk: Det kan være restavfall fiber eller vev som kommer ut av DRG i løsningen. Fjerne dem ved pipette med vask løsning. - Legg 2 mL pre varmet 0,05% trypsin-EDTA i DRG inneholder 35 mm parabol og fordøye DRG i en 37 ° C CO2 inkubator for 30 min.
- Overføre det 2 mL av DRG inneholder løsning slik 15 mL sentrifuge ved glass pipette.
Merk: DRG kan stick til glass pipette så dette trinnet bør utføres med forsiktighet. DRG tap kan unngås ved å holde den DRG inneholder løsningen i den koniske enden av en glass pipette (ca 0,5 mL) og overføre løsningen til sentrifuge røret sakte men uten pause. - Sentrifuge løsningen på 290 x g i 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og legge en annen 2-mL serum-free medium for å resuspend DRG.
- Gjenta trinn 2.10 2 ganger men endre serum-free mellomlang til forvarmes kultur medium på sist.
- Manuelt triturate DRG omtrent 60 ganger med en flamme-polert Pasteur pipette (lengde 230 mm og tips hodet indre diameter 1 mm). Se finne 2B et fotografi sammenligne hullet av en flamme-polert Pasteur pipette til en ikke-polert pipette.
Merk: Innsiden diameteren på flamme-polert Pasteur pipette er ca 10% mindre enn kontroll pipette og innsiden av konisk slutten skal jevnere. Pass på at du ikke opprette bobler når triturating cellene. - Fjern poly-L-lysin-belagt rett fra CO2 inkubator. Sug opp inkubert kultur mediet parabolen, og frø dissosiert cellene på bestrøket parabolen.
- Seed den DRG celler fra ettall rotten (bilaterale samling fra L1-L6, for 12 totale DRG) i fire brønner av en 24-vel plate; Det er ca 5 x 104 celler i en brønn av en 24-vel plate.
Merk: Denne tetthet er egnet for påvisning av utgitt CGRP eller SP og også egnet for immunostaining. Western blot eller RNA utvinning, seed den DRG celler fra ettall rotten (bilaterale L1-L6) i en brønn av en 6-vel plate. - Erstatt kultur medium dagen med tillegg av 10 µM cytarabine (Ara-C) og 100 ng/mL NGF, og Oppdater medium hver to dager etterpå.
Merk: Den thorax DRG også kan også kultivert av denne protokollen, hvis de har blitt samlet fra torakale ryggraden.
3. hva av NPFFR2 siRNA i DRG celler
- Utføre hva av NPFFR2 siRNA og kontrollere siRNA ifølge produsentens protokollen.
Merk: Protokollen må tilpasses hvis den valgte transfection reagensen er forskjellig fra den vi brukte (se Tabell for materiale). - Dag 3 etter celle plating, endre mediet til 0,5 mL pre varme serum-free middels og ruge DRG i en 37 ° C CO2 inkubator 1t.
- Legge 50 nM i siRNA (i 1 µL RNase uten vann) i 12.5 µL serum-free medium.
- Legge til 2,5 µL transfection reagens til 10 µL serum-free medium.
- Bland løsningen fra trinn 3.3 og 3.4 av Pipetter og ruge denne blandet transfection løsning for 10 min ved romtemperatur.
- Legg Hva løsningen i en DRG inneholder 24-vel plate og bland løsningen med medium av mild risting.
Merk: Flere transfection løsninger skal distribueres samtidig hvis flere brønner må være transfekterte. - Inkuber DRG i en 37 ° C CO2 inkubator 6 h.
- Legg til 0,5 mL/vel av kultur medium inneholder 20% fosterets bovin serum, 100 mM natrium pyruvate og 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12, med tillegg av 10 µM Ara-C og 100 ng/mL NGF, inn i 24-vel plate.
- Inkuber DRG i en 37 ° C CO2 inkubator for en annen 66 h (oppdateres middels på 48 timer).
4. utgave av nevrotransmittere fra primære DRG celler
- På dag 6 etter celler var belagt (72 h etter siRNA transfection), endre kultur medium til 200 µL serum-free middels og ruge cellene i en 37 ° C CO2 inkubator for 30 min.
- Legg 1 µL stimulering chemical(s) og bland forsiktig media av pipettering. Inkuber parabol på en 37 ° C CO2 inkubator for det angitte tidspunktet.
Merk: I denne artikkelen, kultivert cellene ble stimulert med NPFFR2 Agonistiske, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol) 1t. - Samle kultur medium fra kultur parabol og sentrifuge 5000 x g for 5 min på 4 ° C fjerne urenheter suspendert.
- Samle nedbryting av sentrifugering og fortynne prøvene med fosfat-bufret saltvann (PBS), etter behov. Analysen nivåene av nevrotransmittere med enzym immunanalyse (EIA) kits.
Merk: Her, supernatants var fortynnes 1: 100 før analysere nivået på CGRP. Nedbryting var ikke utvannet før analysere nivået av SP.
5. CGRP og SP EIA
- Analysere prøvene umiddelbart etter CGRP eller SP EIA kit produsentens protokollen.
Merk: Protokollen vil variere avhengig av utstyret brukes. - Skyll CGRP EIA brønnene 5 ganger med vaskebuffer leveres i settet.
- Legg 100 µL prøver 100 µL anti-CGRP acetylcholinesterase (verke) Tracer i CGRP EIA-brønner, og legge til 50 µL prøver, 50 µL anti-SP verke tracer og 50 µL anti-SP antiserum til SP EIA brønnene.
- Sel på CGRP og SP brønner med plastfolie som angis i settene.
- Inkuber brønnene overnatting på 4 ° C.
- Vask brønnene 5 ganger med CGRP eller SP vaske bufferen og Fjern alle gjenværende løsningen fra brønnene.
- Legge til 200 µL Ellman reagensen i CGRP eller SP brønnene som er angitt i den tilsvarende EIA kits.
- Inkuber CGRP brønnene i 30 min ved romtemperatur og ruge SP brønnene i 90 min ved romtemperatur. Beskytte brønnene fra lys for begge analyser.
- Les platene på bølgelengde 414 nm og beregne resultatene ifølge tilsvarende EIA instrumentet.
Merk: Unngå å berøre bunnen av brønnene hånd hele tiden og rengjør flekker fra godt bunnen av linse rengjøring kluter før du legger den Ellman reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotte lumbale DRG neurons, kultivert i en 24-vel plate, ble dyrket i kultur medium med ekstra Ara-C å hemme glial celle spredning og NGF å støtte dannes hemmer nevronal vekst. Morfologi av levende DRG celler ble observert. Som vist i Figur 3, var celle kroppen av en enkelt Nevron festet på bunnen av en rett på dag 1 og valgt for observasjon. Axon vekst var overvåket fra dag 1-3. Gliacellene dupliseres og utvidet prosesser å omgi celle kroppen av sensoriske Nevron. I en annen kultur, var CGRP protein farget for å vise figuren av neurons. I Figur 4vises CGRP protein flekker i cytoplasma og axons av sensoriske neurons. De kjernefysiske morphologies av neurons og gliacellene er atskilt når farget med DAPI. Neurons har en større og mer avrundet kjerne enn gliacellene. Sammenligning er kjerner i glia mer ovale i form (figur 4B).
Det selektive NPFFR2 Agonistiske, dNPA, ble brukt til å stimulere utgivelsen av CGRP og SP. Videre ble avhengigheten av dNPA-stimulert nevrotransmitter-løslate NPFFR2 testet av transfecting celler med NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA eller kontroll siRNA var transfekterte i de primære DRG cellene 72 h før Agonistiske behandling. DRG celler ble behandlet med dNPA (5 nmol) 1t og utgivelsen av CGRP og SP ble målt ved egen EIA kits. Simulering av DRG med dNPA økt nivå av CGRP og SP i media (figur 5A, B). Imidlertid ble bare dNPA-indusert CGRP utgivelsen hemmet av uttrykk for NPFFR2 siRNA i kulturperler DRG celler. Resultatene som vises i figur 5 ble endret fra en tidligere publikasjon og brukes her med tillatelse22.
Figur 1: vev behandling diagrammer. Lumbale DRG er samlet inn fra 3 uke gamle rotter. (A) posisjonene der giljotinen bør brukes til å skjære dyret angis som stiplede linjer. (B) dorsal bagasjerommet med hud fjernes og (C) plassering av lumbale DRG (fra L1-L6) vises. Sett inn representerer DRG og koble fiber (som angis av pilene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: spesiell utstyret som trengs for å isolere DRG primære kulturer. (A) Kirurgiske instrumenter brukes i samlingen av DRG. Fra venstre til høyre: (en) disseksjon saks (store), (b) bein kutte tang, (c) disseksjon saks (liten), (d, e) peker pinsett, og (f) mikro-saks. (B) en vanlig Pasteur pipette og en flamme-polert Pasteur pipette. "en" betyr innsiden diameteren på vanlig Pasteur pipette, og "b" betegner innsiden diameter flamme-polert Pasteur pipette. b / a ≒ 0,9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: morfologi av levende DRG celler. Lever DRG celler ble overvåket av mikroskopi. Cellene vises (A) en dag etter såing, (B) to dager etter seeding, og (C) tre dager etter seeding. Pilene angir Nevron og pilspisser angir glia. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunostaining kulturperler DRG celleområde. DRG celler var immunostained med anti-CGRP mot Vis neurons, og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kjerner i neurons og gliacellene. (A) CGRP protein ble uttrykt i Sensorisk Nevron cellen legemer og axon fibre. (B) atomkjerner av neurons og glia var farget med DAPI. (C) sammenslått bilde fra A og B. pilen viser en Nevron og pilspiss indikerer en glial celle. Skala bar = 30 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: utgivelsen av nevrotransmittere fra kulturperler DRG celler. Det selektive NPFFR2 Agonistiske, dNPA, ble brukt til å stimulere utgivelsen av CGRP og SP fra DRG kulturer. Avhengigheten av nevrotransmitter-løslate NPFFR2 ble bekreftet av transfecting celler med NPFFR2 siRNA. (A og B) etter DRG celler var transfekterte med NPFFR2 siRNA eller ikke målretting kontroll siRNA (72 h), dNPA (5 nmol) ble brukt 1t å indusere utgivelsen av CGRP og SP. uttrykkes som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM) og ble analysert av t ve-veis variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni legge hoc tester. p < 0,01, ***p < 0,001; sammenlignet med tilsvarende kjøretøy kontroller (N = 12 per gruppe). Paneler A og B har blitt endret fra Lin et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkel, vi viser innsamling, enzym-dissosiasjon og kultur av rotte lumbale DRG. Med nevrotropisk støtte fra NGF utvidet axons DRG neurons innen 3 dager etter celle seeding. Utvidet axons var tydelig observerbare etter celler var farget for CGRP protein, som er syntetisert i cellen soma og fraktet langs axon fibrene. Prosessene av satellitt cellene også utvidet, slik at disse dele gliacellene å omgi neurons innen dager. Primære DRG cellene vokst med denne protokollen er egnet for etterforskning cellulære mekanismer som regulerer sensoriske neurons. Her stimulere vi utgivelsen av neuropeptides, CGRP og SP, fra kulturperler DRG neurons av en selektiv NPFFR2 Agonistiske, dNPA. NPFFR2 er beslektet reseptoren for NPFF og har blitt rapportert å delta i smerte sensasjon og regulering trasé22,23. NPFFR2-avhengigheten av CGRP og SP ble ytterligere bekreftet ved bruk av NPFFR2 siRNA.
DRG kulturer inneholde både sensoriske neurons og satellitt gliacellene. Satellitt gliacellene gir metabolske støtte til neurons og opprettholde nevronale funksjoner9,10. I immunostai-bildene, er det enkelt å identifisere nevroner og gliacellene, siden deres kjerner er formet annerledes (Vis i figur 4B). Eksistensen av satellitt celler i kultur parabol kan bli problematisk hvis det er en eksperimentell behov å skille mellom bestemte funksjon av nevroner og glia. For eksempel er det unektelig at satellitt celler er involvert i utvikling og vedlikehold av smerte11,24, og i noen studier, handlinger av neurons og gliacellene ville være vanskelig å skille bruker DRG kulturer.
I denne protokollen er det noen viktige trinn som krever ekstra forsiktig. Først, siden DRG samles utenfor laminær panseret, ekstra forsiktighet bør tas under vev samlingen prosessen å unngå celle forurensning. Det bør ikke være nødvendig å opprette et sterilt mellomrom, en menneskelig kirurgisk rommet, men instrument sterilisering og feilfri drift plass er viktig. Tips for å unngå forurensning inkluderer holde steriliserte instrumenter på sterilisering posen når den ikke er i bruk og unngå berøring av unødvendige elementer. Også kan forurensende organismer bæres på fur det kan feste til rotte kroppen bagasjerommet eller hansker. Som sådan, bør pels og blodflekker på hansker fjernes ved rengjøring med 75% etanol. Det er også nyttig for operatøren å bære en kirurgiske maske for å hindre overføring av organismer fra pusten eller spytt. Videre bør 35 mm parabolen holdes lukket hele tiden og åpnet når plassere dissekert DRG inne. Det er viktig å erstatte 35 mm parabolen med en ny rett før enzym fordøyelsen. Under enzym fordøyelsen, går ikke utover den inkubasjon tiden, siden over fordøyelsen kan skade neurons. Pass på å forvarme av trypsin-EDTA 37 ° c for å oppnå riktig fordøyelse effektivitet. Effektivitet reduseres dramatisk i lavere temperaturer, og det vil være vanskelig å oppnå en enkeltcelle suspensjon når triturating DRG av flamme-polert Pasteur pipette. Flammen polering pipette vil glatt munnstykket og hindre skarpe glass kanten skadet neurons. Imidlertid overoppheting pipette med en flamme gjør innsiden diameter for liten, og vev eller cellen-inneholder blir vanskelig å passere. Dette reduserte diameter kan også forårsake mange bobler skjemaet under føden scenen, noe som reduserer collectable antall DRG nevroner. Endelig DRG kulturer skal håndteres forsiktig til enhver tid, spesielt når du endrer middels eller utføre behandling.
DRG neurons er rapportert å være mest brukte primære kulturperler neuronal celler12. De kan brukes til en rekke forskjellige studier, alt fra elektrofysiologi eller celle biologi å utforske funksjonene fysiologiske eller patologisk sensoriske neurons. Stor begrensning av DRG primære kulturer er at de ikke er velegnet for høy gjennomstrømming screening. Antall celler som kan innhentes fra DRG av rotte enkelt er begrenset, og neurons kan ikke duplisere i kultur. Fordi begrenset celle, har flere DRG-hybridoma linjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer blitt utviklet for å erstatte den primære kulturer18,19,20. Men protein uttrykket profiler av DRG cellelinjer kanskje ikke det samme som den opprinnelige DRG, og dermed hver modellsystem må kontrolleres nøye. Bortsett fra isolere cellene i laboratoriet, har rotte embryonale eller neonatal DRG neurons gjort kommersielt tilgjengelig. Derfor kan kjøper fra kommersielle kilder være et levedyktig alternativ til nylagde DRG kulturer.
DRG primære kulturer har blitt brukt i mange år som et verdifullt eksperimentelle verktøy som er mest vedtatt i smerte-relaterte studier. Denne modellen er usannsynlig å bli erstattet i nær fremtid. Med god kvalitet DRG neurons, kan forskere få stabile og reproduserbar resultater som nytte mange områder av nevrovitenskap studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. M. Calkins for engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, sunn aldring Research Center (EMRPD1G0171) og departementet for vitenskap og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
