Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tynd Film sammensat silicium elastomerer for cellekultur og hud applikationer: fremstilling og karakterisering

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

En protokol til fremstillingen af polymert tyndfilm kompositstrukturer besidder enten forskellige unge moduli eller tykkelser er præsenteret. Film er produceret for avancerede celle kultur studier eller som huden klæbemidler.

Abstract

I denne protokol præsenterer vi metoder til at fremstille tynde elastomer sammensat film for avancerede celle kultur applikationer og udvikling af hud klæbemidler. To forskellige poly-(dimethyl siloxanes) (PDMS og blød hud lim (SSA)), har været brugt til i dybden med undersøgelsen af biologiske effekter og klæbende egenskaber. De sammensatte film består af en fleksibel støtte lag og en selvklæbende top belægning. Begge lag er blevet fremstillet af læge klinge ansøgning teknik. I den foreliggende undersøgelse, er den klæbende adfærd af de sammensatte film blevet undersøgt som en funktion af lagtykkelse eller en variation af den unge modulus af det øverste lag. De unge modulus af PDMS er blevet ændret af varierende base til crosslinker blandingsforholdet. Derudover tykkelsen af SSA film har været varierede fra ca. 16 µm til ca. 320 µm. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og optisk mikroskopi har været anvendt til tykkelsesmålinger. De klæbende egenskaber af elastomer film afhænger kraftigt filmtykkelse, de unge modulus af polymerer og overfladekarakteristika. Derfor er normal vedhæftning af disse film på glas substrater udstiller glat og ru overflader blevet undersøgt. Pull-off stress og arbejde af adskillelse er afhængige af blandingsforholdet af silikone elastomerer.

Derudover har været varieret tykkelsen af den bløde hud selvklæbende placeret på toppen af en støttende opbakning lag for at producere patches til hud applikationer. Cytotoksicitet, spredning og cellulære vedhæftning af L929 murine fibroblaster på PDMS film (blanding forholdet 10:1) og SSA film (blanding forholdet 50: 50) er blevet gennemført. Vi har vist her, for første gang, side om side sammenligning af tynde sammensat film produceret af begge polymerer og fremlægge undersøgelsen af deres biologiske- og klæbende egenskaber.

Introduction

I denne protokol præsenteres detaljerede metoder til fremstilling af tynd elastomer film. Bredt tilgængelige læge klinge teknik er blevet brugt til fremstilling af tynd sammensat film. Produktion teknik er udført på polyethylenterephtalate (PET) folier, gør det muligt efterfølgende produktion af disse film i stor skala. Vægten af denne protokol er vurderingen af reproducerbarhed, præcis fremstilling af de forskellige lag af de sammensatte film og bestemmelse af de biologiske og vedhæftning egenskaber af den endelige sammensatte patch. Silikoneelastomer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) er flittigt brugt i biomedicinsk teknologi, herunder produktion af huden klæbemidler, mikrofluidik applikationer og yderligere forskning felter1,2,3 ,4. For nylig, en anden underklasse af PDMS, så kaldes blød hud lim (SSAs) har været indført, navnlig for blid hud limning og de-bonding.

Silikone SSAs er vinyl functionalized elastomerer, forskellig fra den analoge polymerer af manglende styrke silica5. Svarende til andre PDMS, SSA Youngs modulus kan tilpasses i en bred vifte af modulerende tværs linker koncentration eller hærdning tid6,7,8. Denne ændring i Youngs modulus af silikone elastomerer påvirker materialets klæbende egenskaber betydeligt og har også dybtgående konsekvenser på prokaryote og eukaryote celler dyrkes på overfladen9,10 , 11. på celleniveau biologisk, det var vist, at eukaryote celler reagerer på signaltransduktion niveau på en graduering af matrix elasticitet eller tykkelse af overflade9,10,12 ,13,14. Derfor en bred interesse i celle kultur anvendelser af polymerer med afstemmelige mekaniske egenskaber findes. Vigtigere, giver den uløseligt lav overflade energi af silikone baseret elastomerer ikke optimale betingelser for cellekultur af eukaryote celler. Ilt plasma behandling er en udbredt teknik til at øge PDMS overflade lavenergi midlertidigt, fører til en forbedring af pull-off styrken, faldt overfladen adsorption af molekyler, mens i parallel fremme vedhæftet fil, spredning og spredning af eukaryote celler15,16,17,18.

Ud over materialer egenskaberne påvirker den overflade topografi væsentligt cellulære vedhæftning og klæbende samspillet mellem to materialer19,20,21,22. Overfladeruhed har flere virkninger på den kontakt dannelse mellem to overflader: reduktion af kontaktområdet, høj gemt elastisk energi omkring asperities samt indflydelse på knæk formering kan ændre klæbestyrke23, 24. Vedhæftning af selvklæbende film til menneskers hud er en spirende programfelt, f.eks. forbindinger, fiksering af EKG-elektroder eller andre bærbare elektroniske enheder25,26,27, 28. For at måle den klæbende ydeevne af self-lim i forhold til overflade topografi, kan glas substrater med varierende grader af ruhed bruges i normale vedhæftning målinger8,21. Her, er to glas substrater blevet udvalgt til at undersøge de klæbende egenskaber af polymer film. Første, sammensat film med en PDMS opbakning lag i blandingsforholdet af 10 til 1 vægt dele omfattet af PDMS med forskellige blandingsforholdet blev præget. I et andet trin fremstillet en SSA klæbelag med lige vægt mængder af begge komponenter og med varierende filmtykkelse på toppen af en understøttende PDMS film.

Protocol

Forsigtig: Kontakt venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Nogle af de kemikalier, der anvendes i denne protokol er lokalirriterende, akut giftige og/eller kræftfremkaldende. Skal du bruge alle passende sikkerhedspraksis ved håndtering af disse kemikalier. Dette omfatter brug af engineering (kemiske kabinet) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser og lukket tå sko). Dele af følgende procedurer indebærer kultur af en animalsk cellelinie. Derfor, Følg venligst specifikke biosikkerhed forordninger. Kemisk og biologisk affald skal bortskaffes efter de særlige nationale og institutionelle regler og anbefalinger.

1. forberedelse af silikone elastomer tyndfilm kompositstrukturer

  1. Forberedelse af polymerer
    1. For at forberede 1,1 g PDMS i forholdet 10:1, mix 1,0 g sammensatte a med 0,1 g af sammensatte B.
    2. Mix og degase før polymerer i en hastighed mixer på 2350 rpm under vakuum i 3 min.
    3. Ændre masse forholdet mellem sammensatte A og sammensatte B til 45:1 og 70:1. Forberede dem svarer til metoden beskrevet i punkt 1.1.2.
    4. Forberede 1 g af den bløde hud selvklæbende (SSA) i forholdet 50: 50. Derfor blandes 0,5 g sammensatte a og 0,5 g af sammensatte B som beskrevet i punkt 1.1.2.
  2. Forberedelse af poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagt PET folie
    1. Forberede en 18% (w/w) PVA opløsning i vand ved at tilføje PVA deioniseret vand og blandes natten over med en magnetomrører. Gemme denne løsning ved 4 ° C.
    2. Forberede tynde film udstiller en effektiv tykkelse af 15 µm med læge klinge ansøgning maskine ved brug af 100 µm hul på klingen og en hastighed på ca. 2,0 mm/s.
    3. Placer filmene i en ovn ved 95 ° C i 15 min.
  3. Forberedelse af PDMS 10:1 blandingsforholdet af læge klinge teknik opbakning-lag
    1. Bruge en automatisk kontrolleret læge klinge ansøgning maskine til fremstilling af de tynde film.
    2. Ren PET-folie med 100% isopropanol og placere det på overfladen af modulet læge blade.
    3. Placer læge blade på toppen af folien og justere tykkelsen med micro positionering skruer. For fremstilling af de våde lag, gælde tykkelser af 60 µm, 100 µm, 200 µm og 500 µm.
    4. Fylde PDMS 10:1 polymer tilberedt i trin 1.1 i reservoiret af læge blade med en engangs sprøjte. Starte bevægelsen af vingen med en hastighed på ca. 2,0 mm/s.
    5. Fjern PET-folie med anvendt 10:1 belægning fra maskinen og placere den i ovnen i 1 time ved 95 ° C, placeret i et værelse, udstiller fugtighed mellem 40 og 65%.
    6. Ren læge klinge med isopropanol og papir håndklæder.
    7. Gentag denne procedure for alle nødvendige tykkelser.
  4. Forberedelse af det øverste lag af PDMS i forskellige blanding nøgletal ved læge klinge teknik
    1. Fjerne tynde striber af længde sider af den underliggende film med en skalpel eller barberblad at tillade placering og glidende læge vingens på PET-folie.
    2. Følg protokol trin 1.3.3 til 1.3.6. Våd tykkelse ansøgt om filmen er 160 µm.
    3. Gentag denne procedure for produktion af to uafhængige film hver med en anden blandingsforholdet PDMS komponenter (45:1 og 70:1). Gemme film ved stuetemperatur (ca. 22 ° C og en luftfugtighed mellem 40 og 65%) i firkantede petriskåle til at forhindre dem fra forurening og støv.
  5. Forberedelse af tynde sammensat film udstiller forskellige tykkelser af SSA 50/50 lag
    1. Forberede PDMS 10:1 film som en backing-lag, som beskrevet før i trin 1.3.
    2. Følg protokol trin 1.4.1 og 1.4.2 til at producere disse film. Bruge SSA i blandingsforholdet 50: 50 og fremstille en film med en våd tykkelse på 40 µm.
    3. Gentag proceduren for de ekstra våd tykkelser af: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. normal vedhæftning målinger ved hjælp af substrater med forskellige overfladeruhed

  1. Forberedelse og karakterisering af glas substrater med forskellige overfladeruhed
    1. Bruge et glas cylinder med en diameter på 2 mm som et glat underlag.
    2. At fremstille 'ru substrat' punktafgifter med et glas cutter et stykke med dimensionen på ca. 4 x 4 mm fra et matteret glas dias. Brug en slibende diamond hånd pad til at opnå en cirkulær område af ca. 3 mm diameter.
    3. Tillægger en aluminium kegle med UV lim glas og belyse det i UV belysning kammer i 3 min.
    4. Bestemme radiussen af overfladearealet af substratet med et optisk mikroskop. Beregne område ifølge den formel A = πr2.
    5. Bestemme den ruhed parameter Ren og Rz (ifølge: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) med en stylus profilometer.
    6. Anbringer underlaget på prøve fase af profilometer og bringe spidsen (diamant, standard: 2 µm/60 °) i berøring med prøven.
    7. Optage ruhed profil med en hastighed af 0,3 mm/s og en længde på 1 mm.
    8. For at analysere den overflade topografi, måle et område med præcis 1 mm2 med en stylus profilometer, drives af det tilknyttede programmel.
      Bemærk: Profilometer drives af en ekstern computer. Indehaveren er flyttet af 0.001 mm i y-retningen efter en forskydning på 1 mm er nået i x retning. Den registrerede. RS3 filen er importeret i Surfcom kort ekspert Software til at skabe 3D-billeder.
  2. Normal vedhæftning måling af tynde film produceret af PDMS eller SSA
    1. Brug et barberblad til at skære filmene på PET-folie i små stykker med et areal af ca 4,0 cm2 og sted dem på et glas dias med UV lim. Belyse med UV-lys i 3 min.
    2. Montere polymere prøven på prøveholderen.
    3. Ren substrat overfladen forsigtigt med ethanol og tør med nitrogen gas.
    4. Vedhæfte glas substrat, monteret på aluminium kegle, til cellen belastning.
    5. Bruge tabellen vipbar (goniometer) til at justere overfladerne netop ved at justere tilt vinkel på underlaget nærmer sig de polymere film. For at gøre dette, bringe substrat manuelt i kontakt med filmen. Ændre tilt vinkel, indtil en helt parallel justering af begge overflader til hinanden, visualiseret ved kameraer billederne, er opnået.
      Bemærk: Vejecelle er forbundet til tabellen vipbar. Et glas prisme er placeret under prøven som vist i figur 4, tillade visualisering af kontaktområde med to kameraer og muliggør tilpasning af substratet på polymerfilm.
    6. Flytte substrat til polymere film overfladen indtil en preload stress af 13 ± 5 kPa er opnået (figur 4).
    7. Start de brugerdefinerede programmeret softwarepakke skrevet i LabView kontrol kræves måling parametre såsom holde tid og tilgang/retraktion hastighed. Ved hold tid tholde er 1 sekund, tilgangen og udstationering velocity er 30 µm/s og 10 µm/s henholdsvis.
    8. Udføre vedhæftning målinger på tre uafhængige fremstillede prøver og på seks forskellige steder på hver film overflade.
  3. Analyse af data og beregning af mekanisk nøglefaktorer: pull-off stress og arbejde for adskillelse.
    1. Beregne stress Equation 1 ved at dividere den optagede tvinge af området substratet AS.
      Equation 2
    2. Bestemme pull-off-stress, som er beskrevet som den maksimale værdi af den normale stress.
      Equation 3
    3. Få forskydning ΔS ved subtraktion af startposition trækstyrke regimes0 fra prøven position sende hvor de-bonding er afsluttet. Definere start trækstyrke regimet som s0 = 0.
      Equation 4
    4. Korrigere de målte værdier af prøven position af systemets kompatibilitet C efter følgende ligning:
      Equation 5
    5. Integrere stress-forskydning kurven mellem s0 og sslutningen for at beregne arbejde for adskillelse.
      Equation 6
  4. Beregning af vigtigste mekaniske faktorer ved hjælp af matematiske computing software oprindelse.
    1. Importere registrerede .dat-fil fra en enkelt vedhæftning måling i en oprindelse tabel. De parametre, der er registreret er tid, prøven position og kraft. Indsæt disse parametre i kolonnerne A (tid), B (prøve placering) og C (kraft).
    2. For at bestemme den tomme værdi, i gennemsnit omkring 20 måleværdier af kraften, før du kontakter polymerfilm. Navngiv denne gennemsnitsværdi Foffset og indsætte det i kolonne D.
    3. Beregne den baggrundskorrigeres kraft F * efter følgende ligning
      Equation 7
      og indsætte denne ligning, som vist nedenfor, i kolonne E.
      Equation 8
    4. Definere start trækstyrke regimet som nul forskydning, dvs., s0 = 0. Derfor afgøre s0 og trække det fra forskydning i kolonne B og gemme den i kolonne F:
      Equation 9
    5. Derudover korrekt prøve placering af maskinen overholdelse. Denne korrektion er udført i kolonnen G. Indsæt følgende ligning i kolonne G
      Equation 10
    6. Beregne stress i den næste kolonne H. Derfor del kraften af området substrat. Indsæt følgende ligning
      Equation 11
      hvor A er arealet af glas substrater i mm2 (fastlagt i punkt 2.1).
    7. Beregne arbejde adskillelse fra værdierne for stress og forskydning. Derfor, plot forskydning langs x-aksen og stress langs y-aksen. Integrere denne graf fra s0 sende hvor sslutningen er defineret som den forskydning, hvormed trækstyrke stress vender tilbage til nul, dvs fuld løsrivelse fandt sted. For at integrere grafen, skal du vælge Integrer funktion. Sammenlægge de beregnede værdier i kolonner, I og J.

3. Karakteristik af filmene af Scanning elektronmikroskopi (SEM) og optisk mikroskopi

  1. Optisk mikroskopi
    1. Med et barberblad skæres de polymere film i små stykker (ca. 0,25 cm2) og vedhæfte dem til kanten af et glas dias. Sted glas dias vertikalt orienteret under en opretstående mikroskop og måle tykkelsen af filmen tværsnit.
      Bemærk: Brug en 20 X mål (NA = 0,45, teoretiske opløsning på 800 nm af 1,1 µm) til at måle film tykkelse værdier på ca. ≤ 20 µm. For en film tykkelse i rækken af 20 µm op til 50 µm bruge en 10 X mål (NA = 0,30, teoretiske opløsning på 800 nm af 1,6 µm) og for en film tykkelse ≥ 50 µm bruge en 5 X mål (NA = 0,15, teoretiske opløsning på 800 nm på 3,3 µm).
  2. SEM undersøgelse
    1. Skære PET-folie og tillægger et glas dias et udsnit af ca. 2 cm2 og Placer den lodret til bespændingsmekanisme inde prøve indehaveren ≤ 2 mm under oversiden af indehaveren.
    2. Vælg en acceleration spænding på 10 kV, backscattered elektron detektor (BSD) og vakuum svagt (60 Pa).
    3. Justere fokus, forstørrelse, lysstyrke og kontrast i billederne.
    4. Vælg et billede erhvervelse tid 28 s med en opløsning på 1024 x 2048 pixel.
    5. Fjerne prøveholderen fra SEM.

4. biologiske undersøgelse

  1. Rutinemæssig celle kultur af L929 celler
    1. Bruge murine fibroblast cellelinie L929 for undersøgelsen. Kultur, cellerne i Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basal medium, suppleret med 10% føtal bovint serum og penicillin und streptomycin ved 37 ° C, 5% CO2 i T75 celle kultur kolber. Passage celler på et sammenløb af ca 70-80%.
    2. For celle passaging, fjerne medium ved aspiration og vask med calcium- og magnesium gratis fosfat buffer (DPBS- / -) til 30 s under en laminar flow kabinet. Bagefter Inkuber celler med 2 mL af Accutase, et enzym løsning med proteolytiske og collagenolytic aktivitet i op til 5 min ved 37 ° C, 5% CO2.
    3. Kontrollere udstationering af celler fra celleoverfladen kultur kolben med en fase-kontrast mikroskop.
    4. Tilføje 8 mL serum-holdige medium i kolben og overførsel af cellesuspension til en 15 mL reaktion tube.
    5. Tag en 10 µL prøve fra cellesuspension og bland med 10 µL af Trypan blå.
    6. Bestemme den cellular antal med en Neubauer kammer og beregne det samlede antal celler.
      Forsigtig: Trypan blå er giftigt, derfor consulting muskel-og Skeletbesvær, efter de obligatoriske procedurer beskrevet i sikkerhedsdatablade, iført passende personlige sikkerhed beskyttelse og håndtering under en kemisk kabinet er påkrævet. Indsamle affald til kemisk affald deposition.
      Bemærk: Trypan blå positive celler er farvet blå, med angivelse af ikke-intakte cellemembraner.
    7. For den næste passage, kultur 5 x 105 celler i en ny steril celle kultur kolbe med 10 mL nyt medium. For forsøgsbetingelser, kultur 3 x 105 celler i de 6 godt plader og 6 x 104 celler i hver brønd af 24 godt plade, indeholdende polymere prøver (protokol trin 4.2).
  2. Forberedelse af sammensat film til celle kultur eksperimenter.
    1. Punktafgifter single stykker af film i de ønskede dimensioner fremstilles i protokollen trin 1.4 og 1.5 fra PET støttende lag med en skalpel og sted med pincet på overfladen af glas dækning underkjoler udstiller en diameter på 12 mm. Placer prøverne i wells af en 2 4 plade godt.
    2. For cytotoksicitet beslutsomhed og celle optælling, ikke fjern filmene af PET-folie. Cut cirkulære områder af ca. 9,4 cm2, montering pænt i de enkelt brønd af et 6 godt plade fra film produceret i 1.4 og 1.5 og placere dem i brønde i en celle kultur plade.
    3. Fordyb polymer prøver i ionbyttet H2O for ≥ 30 min.
      Bemærk: De polymere prøver kan steriliseres ved autoklavering. Derfor, fjerne alle polymer indeholdende prøver fra celle kultur retter og placere dem i et glas petriskål. Sterilisation er udført i en autoklave 2.05 bar i 20 min. ved en temperatur på 121 ° C.
  3. Plasma behandling af polymerer
    1. Placere de film, som er fastgjort på PET folie eller på runde glas dækning underkjoler (fremstillet i 4.2.1) inde reaktionskammeret af plasma-enhed.
    2. Luk låget og evakuere indtil et tryk på 1,6 x 10-2 mbar er nået.
    3. Udføre plasma behandling i 3 min.
    4. Ventilere reaktionskammeret og prøveemner i enten 24 godt eller 6 godt retter for yderligere celle kultur undersøgelser.
    5. Bruge en prøve for vand kontakt vinkel bestemmelse med en goniometer. Derfor flytte sprøjten tæt på polymere overflade, ved hjælp af softwarepakken og placere en dråbe 3 µL vand på overfladen. Beregne statiske vand kontakt vinkel med goniometer software.
  4. Farvning og mikroskopi
    1. Forberede celler, som beskrevet i trin 4.1.7 og kultur for 3 d ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Capture fase kontrast billeder af celler dyrkes i tre dage på uberørt- og plasma behandlet film kort før fiksering.
    3. Forberede PBS suppleret med 0,2% Triton-X-100. Langsomt afpipetteres 200 µL af stamopløsningen i 100 mL PBS (PBS-T).
    4. Forberede en 4% PARAFORMALDEHYD/PBS løsning (PFA/PBS-T).
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt, derfor consulting muskel-og Skeletbesvær, efter de obligatoriske procedurer beskrevet i sikkerhedsdatablade og iført passende personlige sikkerhed beskyttelse og håndtering under en kemisk kabinet er påkrævet.
    5. Forbered en 5% BSA/PBS-T løsning.
    6. Fjern mediet ved aspiration under lamina flow kabinet. Tilføje PBS brønde til fjerne medium rester.
    7. Overføre pladen til en kemisk kabinettet og erstatte PBS med 400 µL af opløsningen PFA/PBS i 25 minutter ved stuetemperatur.
    8. Fjerne PFA/PBS løsning fra enkelt brøndene, omhyggeligt vaskes med PBS fire gange. Vent 3 min. mellem hver vask trin og indsamle løsninger for kemisk affald. Brug pladen direkte, eller opbevares ved 4 ° C.
    9. Tilføj 5% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-T brønde og Inkuber i 60 min på RT for at blokere uspecifik bindingssteder.
    10. Opsug løsningen og erstatte det med en phalloidin, der er konjugeret til Alexa-488 (1: 160 fortynding) / PBS-T løsning suppleres med 0,2% Triton-X-100.
      Forsigtig: Phalloidin-488 er giftigt, derfor consulting muskel-og Skeletbesvær, efter de obligatoriske procedurer beskrevet i sikkerhedsdatablade og iført passende personlige sikkerhed beskyttelse og håndtering under en kemisk kabinet er påkrævet.
    11. Dække plade med alufolie og inkuberes det for 3 h i RT eller natten over ved 4 ° C.
    12. Opsug løsningen og vaskes tre gange med PBS. Vent 3 min. mellem hver vask trin. Indsamle løsningerne for kemisk affald.
    13. Der fremstilles en opløsning af 1 µL af Hoechst farvning 33342 (stock løsning 1 mg/mL). For en 1:1000 fortynding afpipetteres 1 µL af Hoechst farvning 3334 til 1 mL PBS-t og bland godt. Tilsæt 300 µL af opløsningen Hoechst farvning 33342 brønde og inkuberes i 10 min. ved RT i mørke.
      Forsigtig: Hoechst farvning 33342 er et DNA intercalating reagens og derfor potentielt mutagene, derfor rådgivning muskel-og Skeletbesvær, efter de obligatoriske procedurer beskrevet i muskel-og Skeletbesvær og iført passende personlige sikkerhed beskyttelse og håndtering et kemiske kabinet er påkrævet.
    14. Opsug løsningen og vaske prøver fire gange med PBS. Vent 3 min mellem hver vask trin. Indsamle løsning for kemisk affald.
    15. For indlejring, forsigtigt fjerne filmene fra kultur overflade og placere dem på et objektglas glas. Tilføj 20 til 40 µL vand opløselige indlejring medie til film og vedhæfte en ny cirkulære glas dækning slip på toppen ved hjælp af let tryk.
    16. Udføre imaging med et fluorescens mikroskop. Filtre behov for belysning: Alexa-488 har en excitation maksimum på 496 nm og maksimal emission forekommer på 519 nm. Derfor, udledningen farve er grøn. Hoechst farvning 33342 trihydrochlorid trihydrat kompleksbundet med DNA har en excitation maksimale på 355 nm og maksimum DNA komplekse emission forekommer på 465 nm.
  5. Cytotoksicitet beslutsomhed og bestemmelse af celle nummer
    1. Udføre forsøget med celler dyrket i de 6 godt plader forberedt i trin 4.3 og celler forberedt i trin 4.1.7. Kultur cellerne i 3 dage ved 37 ° C og 5% CO2. For den positive kontrol bruge celler, der blev dyrket på en celle kultur behandlet polystyren overflade, der indeholder ingen polymere film. For baggrund bestemmelse (negative tilstand), skal du indhente medium fra et godt uden celler.
      Bemærk: Medium kan også tages fra godt indeholdende celler dyrkes på celle kultur behandlet polystyren overflade.
    2. Ifølge antallet eksperimentelle prøver etiket 15 mL rør.
    3. Tilføje 40 µL af en 0,9% Triton X-100 indeholdende PBS løsning til den positive kontrol og bland kraftigt med en 1000 µL spids. Vent i ca. 3 min.
    4. Uden at fjerne de celler, der er knyttet til overfladen, Aspirér medium fra alle prøver, herunder prøver forberedt i 4.5.3 og overføre mediet til 15 mL rør. Tilføj 3 mL af DPBS- / - enkelt brønde og gemme plader under laminar flow kabinet til bestemmelse af den cellular antal som beskrevet i 4.5.9.
    5. Der centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter og fjerne 1 mL af supernatanten til LDH aktivitet bestemmelse. Gemme 15 mL rør celler, resterende medium under laminar flow kabinet.
    6. Analysen anvendes en sort 96 godt plader med flad bund. Tilføje 50 µL af CytoTox-en reagens til 50 µL af prøven medium og bland godt for 30 s.
    7. Dække plade med alufolie og opbevar i 10 min på RT.
    8. Tilsæt 25 µL af stopopløsning til hver brønd og optage fluorescens-intensiteten med et fluorescens pladelæseren. Ryst plade for 10 s og registrere fluorescens-signal med en excitation boelgelaengden 520 nm og en emission boelgelaengden 560 nm. Undgå luftbobler.
    9. Til bestemmelse af celle nummer aspirat DPBS- / - fra brønde i kultur-pladen fra protokollen træde 4.5.4 og tilføje løsningerne til 15 mL reaktion rør indeholdende analysere indsamlet i protokollen trinnummeret 4.5.5.
    10. Der centrifugeres i 15 mL reaktion røret ved 200 x g i 3 min og Opsug supernatanten. Der tilsættes 0,5 mL Trypsin/EDTA og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C.
    11. Tilsættes 2 mL Trypsin/EDTA på pladen brønde og Inkuber i ca. 10 min. ved 37 ° C Adskil celler fra de polymere film.
    12. Cellesuspension overføres til 15 mL reaktion tube fra trin nummer 4.6.10. Derudover vaske pladerne energisk med serum, der indeholder medium.
    13. Centrifugeres prøver på 200 x g i 3 min, Aspirér supernatanten og tilføje serum indeholdende medium til røret.
    14. Bestemme den cellular antal som beskrevet i trin 4.1.5 og 4.1.6.

Representative Results

I de første eksperimenter, er PDMS film med varierende tykkelse og konstant blande forholdet 10:1 fremstillet på PET film (figur 1). Fordi tykkelsen af laget opbakning kan betydeligt påvirke stivheden og håndtering egenskaber af hele sammensat film i de indledende forsøg enkelt film mellem 13 ± 2 µm og 296 ± 13 µm blev fremstillet (figur 1). Det er velkendt, at under hærdning proces svind af polymer film opstår. For de tyndeste film observeret vi en forskel på 78% ± 3,1% mellem våd og hærdede betingelser. For de tykkeste film registreret svind af 40,9% ± 2,6% er blevet (figur 1).

For de programmer, der er præsenteret i denne protokol, skal film fjernes manuelt fra PET-folie. Vi anerkendte, at især tynde film er svære at håndtere med pincet og er ofte ødelagt under denne proces. Derfor undersøgte vi indflydelse af en tynd poly-(vinylalkohol) belægning som en støttende lag. PVA besidder en høj stivhed og let kan fjernes på grund af sin vandopløselighed i downstream applikationer. Den anvendte PVA belægning har en tykkelse på ca. 17 µm og derfor PDMS film belagt oven på dette lag er lidt tyndere i forhold til film uden PVA belægning (data ikke vist). Især fokus på håndtering egenskaber, konkludere vi, at kun den tyndeste film kræver en støttende PVA film for fjernelse af PET-folie.

En effektiv filmtykkelse på omkring 40 µm blev valgt for alle yderligere eksperimenter. For produktion af sammensat film, var PDMS blandingsforholdet varierede fra 10:1 at 45:1 og 70:1 og anvendte oven på den tidligere polymeriseret PDMS film med læge klinge teknik (figur 2A). Med undtagelse af 10:1 ratio, kunne de forskellige film skelnes klart af Optisk mikroskopi med passende præcision. Til mikroskopisk analyse blev filmene skåret med en skalpel og er fastgjort til kanten af et glas dias. De højere blanding nøgletal for det øverste lag syntes visuelt lysere på de mikroskopiske billeder i forhold til 10:1 forholdet mellem opbakning lag (figur 2B). Desuden blev scanning elektronmikroskopi brugt til billede prøver ved en forstørrelse af omkring 860 X (figur 2 c). Et klart observerbare forskellen i lysstyrke mellem de to PDMS film, fremstillet i højere blanding nøgletal blev anerkendt, i modsætning til 10:1-forhold. Skæring procedure efterlader mærker, synlig i SEM billeder (figur 2B). Baseret på disse resultater, var den gennemsnitlige samlede tykkelse af sammensat film 112 µm ± 5,0 µm (figur 2D).

I yderligere eksperimenter er vedhæftning egenskaberne af disse film blevet fastsat med normal kraft vedhæftning målinger ved hjælp af to forskellige glas substrater (figur 3). Det glatte underlag besidder en overfladestruktur med en aritmetisk middelværdi ruhed Ren af 0.013 ± 0.0002 µm og en gennemsnitlig peak-til-dal Rasmussenz på 0,12 ± 0,004 µm (figur 3A). Substrat 2 (GS2, udpeget som ru) udstillet ruhed værdier af 0.338 ± 0.021 (Rasmussenet) µm og 2.055 ± 0.017 µm (Rz) (figur 3B). Med gennemsnitlige er radius er fremstillet i 2.1.4 overfladearealet af 'glat' substratet var 3,2 mm2 mens for 'ru' substratet et areal på 6,07 mm2 blevet beregnet.

Med disse to substrater, er der fastslået den klæbende adfærd af de forskellige film. To parametre er valgt at beskrive de klæbende egenskaber af filmene: pull-off stress σmax og adskillelse Wseparbejde. Under hele processen med bonding og de-bonding prøve position registreres s og den normale kraft F. Resultaterne er repræsenteret i en stress-forskydning kurve (figur 4).

For en korrekt fortolkning af de eksperimentelle resultater er det vigtigt præcist justere substrat til polymere film overfladen. Også, skal maskinen overholdelse af måling enhed anses for at korrigere forskydningen. Under målingen fungerer den anvendte kraft ikke udelukkende på prøve, men også på andre dele af prøvningsanordningen. Derfor er hver af de to substrater presset mod et glas dias med en trykstyrke stress af 13 ± 5 kPa. For at måle overensstemmelsen, tages effektabsorptionskurve i betragtning, dvs. del af kraft-forskydning kurven hvor de to flader kommer i kontakt op til prøven position hvor de nøjagtige preload kraft er nået. Den gensidige hældningen af kurven er lig med den maskine overholdelse C. Den beregnede værdi for C er 0,12 µm/mN.

I det første eksperiment film med forskellige blanding nøgletal af PDMS blev analyseret (figur 5). For sammensatte filmene, blev tykkelse og opbakning lag, fremstillet af PDMS 10:1 blandingsforholdet holdt konstant. Tykkelsen af det øverste lag var også holdes konstant med en værdi på 65 µm. Den højeste pull-off stress på 109 ± 27,6 kPa blev fastsat med glat glas substrat på filmens PDMS 10:1 (figur 5A). En forøgelse af den blandingsforholdet fører til et fald på 76,7 ± 17 kPa for 45:1 blandingsforholdet pull-off stress og 41,4 ± 17 kPa for 70:1 ratio. Med rå glas substrat en pull-off stress på 22 ±, blev 2,2 kPa fastsat for PDMS 10:1 film. I almindelighed, arbejdet i adskillelse var sammenlignelig mellem begge glas underlag, fx., 1.4 ± 0,6 J/m2 på den tyndeste film fremstillet med glat substrat og 1.84 ± 0,7 J/m2 på den tyndeste film fremstillet med den ru substrat ( Figur 5B).

Næste, produktion af tynde film for hud applikationer og cellekultur programmer har været undersøgt (figur 6). SSA 50/50 har været brugt til øverste lag produktion af sammensat film. PDMS i en 1:10 blande forholdet med en tykkelse på ca. 40 µm er blevet brugt som en backing lag. I modsætning til de tidligere eksperimenter afbildet i figur 5, tykkelsen af det øverste lag var varieret, mens den blandingsforholdet blev holdt konstant (figur 6A). SSA er valgt på grund af dets klæbende egenskaber i ansøgninger, der involverer tilknytning til overflader med høj overfladeruhed, især menneskelige hud, ved hjælp af indstillingen producenter af blanding forholdet 50: 505,8. Human epidermis besidder en høj overfladeruhed. Afhængigt af alder og anatomiske rapporteret region betyder overfladeruhed dybde (RZ) mellem 48 µm og 71 µm er blevet29. Sikker og blid hud vedhæftning er vigtig, partikularitet til den følsomme hud af nyfødte eller næppe regenerere huden af ældre. Forskellige våde tykkelser spænder fra 40 µm, 120 µm, 300 µm til 500 µm blev anvendt (figur 6A). Afhængigt af den våde tykkelse varierer den samlede tykkelse af sammensat film mellem 51 µm og 344 µm (fig. 6B). Efter hærdning, composite har været fastgjort til bagsiden af et frivilligt hånd (figur 6 c). Forskellige film tykkelser utvetydigt viser forskellene i deres tilpasning egenskaber til ruhed af huden (figur 6 c). Tynde film (50 µm og 100 µm samlet tykkelse) viser en høj tilpasning til hud rynker i forhold til de tykkere film (220 µm og 340 µm samlet tykkelse). Disse resultater viser, at sammensatte film med et bredt udvalg af tykkelser kan fremstilles netop med anvendt læge klinge teknik.

Vedhæftning eksperimenter blev udført med disse sammensatte film (figur 7). Afhængigt af tykkelsen af SSA top film, har vi observeret et fald af pull-off stress med stigende filmtykkelse. Den højeste pull-off kraft af 133 ± 36,6 kPa blev målt på det glatte underlag (figur 7A). Den laveste pull-off-stress af 18 ± 4 kPa blev opnået med det ru substratet på det tykkeste film. Interessant afslører en sammenligning mellem begge substrater en 2,7 gange forskel på de tyndeste film (figur 7A). Med stigende filmtykkelse, især på de tykkeste film var nogen bemærkelsesværdig forskel observerbare (figur 7A). Med den glatte underlag et værk om adskillelse af 1,8 ± 0,8 J/m2 blev fundet på filmen udstiller en samlet tykkelse på ca. 100 µm, efterfulgt af en film tykkelse afhænger af nedgang (220 µm tykkelse: 1,6 ± 0,6 J/m2 og 330 µm: 1,3 ± 0,4 Jensen2 (Figur 7B)). Arbejdet med adskillelse målt med de ru substrater var generelt lidt lavere i forhold til den glatte substrat (100 µm tykkelse: 1,63 ± 0,6 J/m2; 220 µm tykkelse: 1,1 ± 0,6 J/m2 og 330 µm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (figur 7B )).

Derudover blev detachement mekanisme optaget under målinger (figur 7C). Lille kavitation blev observeret på den tyndeste film, mens udseendet af finger som revner var observerbare på tykkere film (figur 7C).

Målingerne er foretaget senest en måned efter fremstillingen af filmene. Men stabilitet og bevarelsen af de mekaniske egenskaber af de elastisk film kan blive påvirket af miljøfaktorer, herunder temperatur og luftfugtighed. Som beskrevet i protokollen trin 1.4.3, har filmene været gemt ved stuetemperatur og en luftfugtighed på 40-65%. For at forhindre er dem fra forurening og støv, filmene gemt i plast petriskåle i mørke. For at undersøge den langsigtede stabilitet, vedhæftning målinger og tykkelse bestemmelse af SSA er 50/50 film blevet udført ca. fire måneder efter fabrikation. Ingen stor indflydelse på filmtykkelse, pull-off stress og arbejde af adskillelse er blevet opdaget efter opbevaring. For eksempel, var pull-off stress af SSA sammensatte filmene fremstillet med en våd tykkelse 120 µm SSA og en våd tykkelse på 100 µm PDMS 46,6 ± 6 kPa og arbejdet i adskillelse 1627 ± 592 mJ/m2 efter fabrikation. Ca. fire måneder efter fremstilling, blev en pull-off stress 48,8 ± 5,4 kPa og et værk om adskillelse af 1666 ± 723 mJ/m2 fastsat. I tilføjelse, kort tid efter fremstilling, den samlede tykkelse af disse film var 103,3 ± 13,9 µm og efter opbevaring 98,1 ± 9.1 µm.

I yderligere eksperimenter PDMS 10:1 og SSA 50/50 sammensat film med en samlet tykkelse på ca. 105 µm har været brugt som celle kultur substrater (figur 8). Sammensat film produceret i protokollen trin nummer 1 kan nemt fjernes fra PET-folie og skæres i ønskede dimensioner og geometriske former. Desuden, når vedhængende film til en stiv overflade, for eksempel glas, flere film viser forskellige unge moduli kan knyttes side om side og kan placeres inde i et enkelt godt af en celle kultur plade. Film kan være knyttet til polystyren overfladen direkte uden en yderligere coverslip. Film kunne også tilpasset forskellige overflader og geometriske struktur, lige rør eller ringe, gør det muligt for yderligere undersøgelser ikke kan opnås med konventionel celle kultur materialer. I de udførte eksperimenter afbildet i figur 8 sammensat film på PET folie har været placeret direkte i celle kultur plader eller film er blevet fjernet fra PET-folie og placeret på glas dækning underkjoler. For forsøgsbetingelser, er nogle polymerer blevet behandlet med luft plasma til at øge deres frie overflade energi. I almindelighed, PDMS besidder en vand kontakt vinkel på ca. 115° før plasma behandling og bliver stærkt hydrofilt (vand kontakt vinkel < 30°) efterbehandlingssystem8. Plasma behandling gør overfladen biokompatible og muliggør fastgørelse af eukaryote celler. Afhængigt af behandlingstiden og intensitet polymer overfladen er ændret, viser en højere grad af ruhed og også knæk kan vises. Umiddelbart efter behandlingen af er en hydrofobe genrejsningsprocessen observeret. Som beskrevet under protokollen trin 4.3.5 blev en goniometer brugt til at bestemme de statiske vand kontakt vinkler. Derfor, polymerer, der er blevet placeret i ddH2O for 1 time efter plasma luftbehandling blev efterfølgende analyseret. Plasma behandling reduceret vand kontakt vinkel betydeligt (PDMS uberørte: 117.0 ± 2,2 °; SSA uberørte: 127.9 ± 5,6 °; PDMS plasma: 18,0 ± 7,2 °; SSA plasma: 29.3 ± 11,5 °).

For eksempel indlejring en vandig montering er medium anvendt. Hvis prøverne skal fjernes igen på ethvert tidspunkt, kan modellerne placeres i en vand indeholdende petriskål natten over. Til sidst, kan dække underkjoler fjernes for yderligere analyse.

Den vedhæftede og morfologi af L929 celler seedet 3 dage på PDMS og SSA 50/50 sammensat film er blevet besluttet af fase kontrast mikroskopi og efter farvning med fluorescens konjugeret phalloidin-488 og Hoechst farvning 33342 (figur 8). Billede erhvervelse med fase kontrast mikroskopi er stærkt anbefales, især for polymerer ikke behandlet med plasma. På grund af den svage cellulære vedhæftning til disse polymere overflader enkelt celler eller aggregater er let løsriver sig, komplicerer korrekt fortolkning af efterfølgende analysemetoder.

Celler seedede på de uberørte polymerer vises dårlige udlæg og cellulære sprede adfærd (figur 8A1 og C1) mens en sammenflydende éncellelag blev observeret for celler dyrkes på plasma behandlede overflader (figur 8B1 og D1) . Dannelsen af cellulære aggregater og løsrivelse fra overfladen var mere udtalt på uberørte flader. Visualisering af actin filamenter efter fiksering med 4% PARAFORMALDEHYD afslørede nogle celler migrerer ind i periferien af de cellulære aggregater og udstråling af lamellipodia fremspring på uberørte PDMS og SSA 50/50 sammensat film (figur 8A2 og C2, pile). Ingen større kvalitative forskelle kunne observeres samtidig sammenligne både polymere materialer. Som en sidebemærkning, fremgår det, at et færre antal cellulære aggregater var til stede på SSA 50/50 i forhold til PDMS. Også, de aggregater, der er knyttet til flader på SSA 50/50 syntes mere flad (fig. 8 c 1). Som forventet, forbedret behandling med luft plasma cellulære attachment og spredning på begge overflader betydeligt, fører til dannelsen af bemærkelsesværdige lamellipodia fremspring og en sammenflydende éncellelag (figur 8B2 og 8 d 2).

Frigivelse af LDH efter 3 dages kultur blev brugt som en indikator til at bestemme cytotoksiske virkninger (figur 9A). I almindelighed, LDH niveauer var sammenlignelige for celler dyrkes på begge polymere materialer, med mindre end 5% cytotoksicitet (uberørte PDMS: 2,8 ± 2,0%; uberørte SSA 50/50: 4,5 ± 3,6%; plasma behandlet PDMS: 3,4 ± 1,5%; plasma behandlet SSA 50/50: 3,4 ± 1,6%). Disse resultater er sammenlignelige data præsenteret i vores tidligere offentliggjorte undersøgelse med fokus på undersøgelse af både elastomerer. 8 for at yderligere validere resultaterne af LDH assay, en trypan blå udstødelse test blev udført. Derudover var hele cellen befolkningen besluttet på at vise forskellene i spredning aktivitet (figur 9B). Generelt mindre end 5% Trypan blå positive celler blev talt (uberørte PDMS: 2,4 ± 0,3%; uberørte SSA 50/50: 3,8 ± 2,5%; plasma behandlet PDMS: 0,74 ± 1,3% plasma behandlet SSA 50/50: 0,95 ± 1,6%).

Figure 1
Figur 1: forberedelse af PDMS film på poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagt PET folie: Proces til fremstilling af PDMS film med varierende tykkelse på en PET-folie blev anvendt til at bestemme reproducerbarhed og håndtering ydeevne (A). Tykkelser af PDMS film blev analyseret med optisk mikroskopi efter hærdning ved 95 ° C (B). N = 3 uafhængigt fremstillet film blev analyseret. Fra hver film, tre forskellige steder blev valgt, snit og 3 positioner på hver prøve blev analyseret (k = 27). Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: forberedelse af sammensat film af PDMS forberedt i forskellige blanding nøgletal: Sammensat film udstiller forskellige blanding nøgletal af base (komponent A) til crosslinker (del B) af PDMS blev fremstillet af læge klinge teknik. Det øverste lag bestående af PDMS i forholdet 10:1 (komponent A:B), blev 45:1 og 70:1 anvendt på toppen af en tidligere hærdede PDMS 10:1 film (A). Efter efterfølgende hærdning ved 95 ° C blev tykkelse af de sammensatte film analyseret af Optisk mikroskopi (B) og scanning elektronmikroskopi (C). N = 3 uafhængige eksperimenter blev udført og analyseret med optisk mikroskopi (D). Danne hver uafhængig producerede film, tre forskellige steder blev valgt, snit og 3 positioner på hver prøver blev analyseret (k = 27). Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: bestemmelse af topografiske overfladeruhed af de to substrater til vedhæftning målinger: To glas substrater besidder forskellige overfladeruhed blev præget. Tre-dimensionelle profilometric analyse af overfladen blev udført på den 'glat' substrat GS (A1) og 'rå' substrat GR (B1). Tilsvarende enkelt linje kurver er afbildet i A2 og B2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: princippet om normale vedhæftning målinger: En brugerdefineret bygge setup blev brugt til at karakterisere vedhæftning egenskaber af polymer prøver. Opsætningen af måling er afbildet i (A) og detaljer er vist i (B). Til analysen af målingen, var stress bestemmes ud fra en stress tid kurve (C). Arbejde af adskillelse var bestemt af en integration af stress-forskydning kurven mellem sende og s0 (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: bestemmelse af friktionskoefficienten egenskaber af sammensat film med forskellige blanding nøgletal af PDMS: Pull-off stress (A) og arbejde for adskillelse (B) af sammensat film produceret af PDMS i den blanding nøgletal 10:1, 45:1 og 70:1 blev målt. Til analysen, en 'glat' glas substrat (GS) udstiller en Ra = 0.013 µm og en 'rå' glas substrat (GR) med Ren = 0.338 µm blev brugt. N = 3 uafhængigt fremstillet film blev analyseret. Fra hver film, to stykker blev valgt og tre forskellige positioner på hver prøve blev analyseret (k = 18). Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: forberedelse af sammensat film SSA med varierende tykkelse: SSA 50/50 blev anvendt på toppen af en tidligere hærdede PDMS 10:1 film (A). Forskellige våde tykkelser af dette lag, der spænder fra 40 til 500 µm blev anvendt og tykkelse efter hærdning undersøgt med optisk mikroskopi (B). Fastgørelse af filmene på bagsiden af en frivillige hånd vises, film med en samlet tykkelse på ca. 100 µm (film #2) overensstemmelse godt til ruhed af huden (C). Tykkelsen af de enkelte lag og den samlede tykkelse af sammensat film er vist i fig. 6B. For analyse n = 3 uafhængigt producerede prøver blev målt med optisk mikroskopi. Fra hver film, tre forskellige steder blev valgt, snit og 3 positioner på hver prøve blev analyseret (k = 27). Fejllinjer udgør standardafvigelse. Skalalinjen i 6C skildrer ca. 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: bestemmelse af friktionskoefficienten egenskaber af sammensat film af den bløde hud lim: Tynde sammensat film SSA som toplag og PDMS 10:1 som backing lag blev fremstillet. Tykkelsen af det øverste lag blev varieret mellem 50 og 330 µm. Pull-off stress (A) og arbejde for adskillelse (B) af sammensat film målt med to forskellige glas substrater blev analyseret ('glat' glas substrat (GS) udstiller et Ren = 0.013 µm og en 'rå' glas substrat (GR) med Ren = 0.338 µm). Eksemplariske billeder af detachment mekanismer er visualiseret i C. Til data analyse n = 3 uafhængigt producerede eksperimenter blev analyseret. Fra hver film, to stykker blev valgt og tre forskellige positioner på hver prøve blev analyseret (k = 18). Fejllinjer udgør standardafvigelse. Skala barer i 7C skildrer 0.5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: cellulære morfologi af L929 fibroblaster kulturperler på tynde film: L929 murine fibroblaster var kulturperler i 3 dage på de tynde film fremstillet af PDMS (A1, A2, B1, B2) eller SSA (C1, C2, D1, D2). At øge hydrofiliciteten af overflader air plasma behandling blev udført (B1, B2, D1, D2). Skala barer i D1 og D2 skildrer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: bestemmelse af cytotoksicitet og cellulære spredning: Til bestemmelse af cytotoksiske virkninger og cellulære spredning, var L929 celler seedede i tre dage på PDMS 10:1 og SSA 50/50 sammensat film. Frigivelse af laktat dehydrogenase (LDH) blev bestemt ved en LDH aktivitet assay og viste mindre end 5% cytotoksicitet (A). Cellen Total antal efter dyrkning periode blev vurderet efter manuel optælling af enkelt celler med en Neubauer kammer (B). N = 3 uafhængigt udførte eksperimenter blev analyseret. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Design af kompositstrukturer giver den enkel justering af materialeegenskaber, som Young's modulus eller tykkelsen af prøverne. De unge modulus af PDMS kan ændres effektivt i en bred vifte af enten at ændre blandingsforholdet mellem de to komponenter eller fremstilling af blandinger ved hjælp af en anden silikoneelastomer30,31. De beskrevne metoder er ikke begrænset til PDMS bruges i den aktuelle undersøgelse, men især den klæbende ydeevne afhænger stærkt af den specifikke type anvendes. Et kritisk trin i denne protokol er under fremstillingen af de sammensatte film (figur 1). Det var vist, at tykkelsen af filmene påvirker betydeligt vedhæftning adfærd af film på forskellige underlag, herunder hud (figur 5 og figur 6). Ud over filmtykkelse påvirker tid og temperatur under hærdning proces materialeegenskaber32. Parametre som tykkelsen af de polymere lag skal derfor nøje tilpasses og verificeret.

Analyse af de klæbende egenskaber af de tynde film blev udført med normal kraft vedhæftning målinger ved hjælp af to glas substrater med forskellige overfladeruhed op til Ra = 0.338 µm (figur 3). I almindelighed, påvirkninger ruhed betydeligt vedhæftning af overflader, især af elastiske materialer33,34. Ruhed af glas kan varieres let ved slibning med sandpapir i forskellig asperity størrelser, derfor giver mulighed for fremstilling af substrater udstiller højere ruhed værdier21. Derudover kan andre materialer, kan for eksempel epoxyharpiks bruges til fremstilling af substrater15,35. Dette kan være en vigtig ændring strategi præsenteres protokollen. For eksempel, hvis substrater udstiller forskellige overflade frie energier er nødvendige eller specifikke er topografi påkrævet. Her, blev pull-off stress og arbejde for adskillelse af de tynde film produceret af PDMS og SSA analyseret med en skræddersyet setup (makroskopisk vedhæftning måling enhed (MAD, figur 4)). 36 optisk tilpasningen af substrat og indenter er et afgørende skridt til analyse af måleresultaterne. Justering af tilt vinkel skal derfor udføres med goniometer, så præcist som muligt. Dette kan opnås med tilstrækkelig præcision ved manuelt at bringe substrat i kontakt med film overfladen, indtil en horisontal kontakt er opnået.

I den nuværende protokol blev hold tid holdt konstant på ét sekund (figur 5 og figur 7). Især til undersøgelse af den klæbende præstation af en elastisk folie til en ru substrat overflade giver en udvidelse af hold tid yderligere oplysninger. For eksempel, har en stigning i pull-off stress med stigende hold tid været rapporteret8. Ud over målinger foretaget i den nuværende protokol, andre metoder, kunne for eksempel skræl tests udføres, giver mulighed for en mere omfattende undersøgelse af adhæsion ydeevne37.

De klæbende egenskaber af sammensat film udstiller forskellige film tykkelser af blød hud limen blev fastlagt (figur 7). Vores resultater er i overensstemmelse med offentliggjorte data, viser, at en nedgang af filmen tykkelse fører til en stigning på pull-off stress som indespærring, dvs, forholdet mellem substrat diameter og film tykkelse, øger38,39 . Baseret på disse resultater og de data, der er afbildet i figur 7, må vi konkludere at sammensatte film med en samlet tykkelse på ca. 100 µm (tykkelse af SSA lag af ca. 60 µm påføres en PDMS film med en tykkelse på ca. 40 µm) udviser gunstige vedhæftning Pedersen egenskaber for på ru overflader.

Næste, eksperimenter relateret til biologiske karakterisering er blevet udført på uberørte sammensat film og plasma behandlet sammensat film (figur 8). Plasma behandling af silicium elastomerer er en ofte anvendt, alsidige teknik til at øge de hydrofile egenskaber af overflader og fremme cellulære vedhæftet fil og cellulære spredning40,41. Silikone er kendt for deres lav toksicitet og høj biostability men kan indeholde resterende monomerer eller katalysatorer, som kan påvirke fysiologiske processer, fører også til cytotoksicitet42,43. I den gennemførte forsøg vi har observeret mindre end 5% cytotoksicitet ved hjælp af LDH udgivelse som en indikator og en Trypan blå udstødelse assay. I præsenteret protokollen, hele cellulære befolkning, herunder cellulære aggregater løsrevet form overfladen er blevet analyseret for spredning analyse (figur 9B). En ændring af protokollen kunne producere mere differentieret resultater. For hver prøve, kunne supernatanten indeholdende fritliggende cellulære aggregater overføres til en separat reaktion tube og ikke kombineret med cellerne enzymatisk fjernet fra polymer overflade. Dette ville give den nøjagtige vurdering af celler knyttet til overfladen og i sidste ende afslører en nærmere bestemmelse af polymerer indflydelse på processen, cellulære vedhæftning. Ud over de andre metoder, der præsenteres her, kan celler høstes til undersøgelsen med immunblot metoder, giver en detaljeret kvantitativ vurdering af protein udtryk.

I Resumé, har vi etableret produktionsvilkår for tynde elastomere sammensatte filmproduktion til applikationer i avancerede celle kultur forskning. Derudover besidder disse tynde film høj tilpasningsevne huden ruhed, gør det muligt for avancerede design af huden klæbemidler.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Martin Danner er anerkendt for sin bistand til forberedelse af prøver og etablering af celle kultur procedurer. Forfatterne vil gerne takke Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Tyskland), især Robert Radsziwill for løbende support og diskussioner. Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) ERC tilskudsaftalen n. 340929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050 (2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116 (2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499 (2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017 (2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437 (2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101 (2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805 (2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204 (2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132 (2009).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 137 poly(di-methylsiloxane) tynd film sammensat elastomerer hud klæbemidler vedhæftning cellekultur
Tynd Film sammensat silicium elastomerer for cellekultur og hud applikationer: fremstilling og karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L.,… More

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter