Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Dunne Film samengestelde Silicon elastomeren voor celkweek en huid toepassingen: productie- en karakterisering

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

Een protocol voor het productieproces van polymere dunne film composiet structuren bezitten verschillende Youngs moduli of diktes wordt gepresenteerd. Films worden geproduceerd voor geavanceerde cel Cultuurwetenschappen of als huid lijm.

Abstract

In dit protocol presenteren wij methoden om dunne elastomeer samengestelde films voor geavanceerde cel cultuur toepassingen en voor de ontwikkeling van de huid lijm. Twee verschillende poly--(dimethyl siloxanes) (PDMS en zachte huid lijm (SSA)), zijn gebruikt voor diepgaand onderzoek van biologische effecten en zelfklevende kenmerken. De samengestelde films bestaan uit een flexibele steun laag en een lijm bovenlaag. Beide lagen zijn vervaardigd door doctor blade toepassing techniek. In het huidige onderzoek is het zelfklevende gedrag van de samengestelde films onderzocht als een functie van de laagdikte of een variatie van de Youngs modulus van de toplaag. De Youngs modulus voor PDMS veranderd door het variëren van de basis om te crosslinker mengverhouding. Bovendien, de dikte van SSA films heeft geweest varieerde van ca. 16 µm tot ca. 320 µm. scannende elektronen microscoop (SEM) en optische microscopie zijn gebruikt voor diktemetingen. De adhesieve eigenschappen van elastomeer films zijn sterk afhankelijk van de laagdikte, de Youngs modulus van de polymeren en de oppervlakte kenmerken. Daarom, normale hechting van deze films op glazen substraten tentoonstellen van gladde en ruwe oppervlakken is onderzocht. Pull-off stress en werk van scheiding zijn afhankelijk van de mengverhouding van silicone-elastomeren.

Bovendien is de dikte van de lijm van de zachte huid geplaatst bovenop een laag ondersteunende steun varieerde om te produceren van patches voor toepassingen van de huid. Cytotoxiciteit, proliferatie en cellulaire hechting van L929 lymfkliertest fibroblasten op PDMS films (mengverhouding 10:1) en SSA films (mengen verhouding 50:50) zijn uitgevoerd. Wij hebben hier is afgebeeld, voor de eerste keer, de side by side vergelijking van dunne samengestelde films vervaardigd van beide polymeren en presenteren van het onderzoek naar de eigenschappen van hun biologische- en lijm.

Introduction

In dit protocol, worden gedetailleerde methoden voor productie van dunne elastomeer films gepresenteerd. De verkrijgbaar doctor blade techniek is gebruikt voor de productie van dunne samengestelde films. De productietechniek heeft verricht voor polyethylenterephtalate (PET)-folie, waardoor de productie van deze films op grote schaal. De nadruk van dit protocol is de beoordeling van de reproduceerbaarheid, precieze productie van de verschillende lagen van de samengestelde films en bepaling van de hechting aan en de biologische eigenschappen van de uiteindelijke samengestelde patch. De silicone-elastomeer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) wordt uitgebreid gebruikt in biomedische technologie, met inbegrip van de productie van de huid lijm, microfluidics toepassingen en aanvullend onderzoek velden1,2,3 ,4. Een subklasse van PDMS, zogenaamde zachte huid lijmen (BVS) hebben onlangs geïntroduceerde, in het bijzonder voor zachte huid verlijmen en -binding.

Siliconen BVS zijn vinyl matiemaatschappij elastomeren, analoog polymeren afwijken door het ontbreken van silica5te versterken. Gelijkaardig aan andere PDMS, SSA Youngs modulus kan worden aangepast in een brede waaier door modulerende cross-linker concentratie of genezen tijd6,-7,8. Deze wijziging in Youngs modulus van silicone-elastomeren aanzienlijk is van invloed op de adhesieve eigenschappen van het materiaal en heeft ook ingrijpende gevolgen op prokaryote en eukaryote cellen gekweekt op de oppervlakte9,10 , 11. op het niveau van de cellulaire biologische werd aangetoond, dat de eukaryote cellen reageren op het signaaltransductie niveau aan een modulatie van de elasticiteit van de matrix de dikte van de oppervlakte9,10,12 ,13,14. Er bestaan dus, een brede interesse in cel cultuur toepassingen van polymeren met afstembare mechanische eigenschappen. Nog belangrijker is, voorziet de intrinsiek lage oppervlakte-energie van siliconen gebaseerd elastomeren niet in optimale omstandigheden voor de cultuur van de cel van eukaryote cellen. Zuurstof plasma behandeling is een veel gebruikte techniek toe PDMS oppervlakte energiezuinige tijdelijk, wat leidt tot een verbetering van zijn sterkte pull-off, daalde oppervlakte adsorptie van moleculen, terwijl parallel bevordering van gehechtheid, verspreiding en proliferatie van eukaryotische cellen15,16,17,18.

Naast de eigenschappen van de materialen, de oppervlakte topografie grote invloed op cellulaire hechting en de zelfklevende interactie tussen twee materialen19,20,21,22. Oppervlakteruwheid heeft verschillende effecten op het contact vorming tussen twee oppervlakken: vermindering van het contactoppervlak, hoge opgeslagen elastische energie omringende oneffenheden evenals invloed op de voortplanting van de barst kan veranderen de adhesieve kracht23, 24. Hechting van zelfklevende films aan de menselijke huid is een opkomende toepassingsveld, bijvoorbeeld wond dressings, fixatie van ECG elektroden of andere draagbare elektronische apparaten25,26,27, 28. Voor het meten van de zelfklevende prestaties van zelf-lijmen met betrekking tot de oppervlakte topografie, kunnen glazen substraten met variërende graden van ruwheid worden gebruikt in normale hechting metingen8,21. Hier zijn twee glazen substraten te onderzoeken de adhesieve eigenschappen van de polymeerlagen geselecteerd. Eerste, samengestelde films met een PDMS steun laag in een mengverhouding van 10 tot en met 1 gewicht delen door PDMS bedekt met verschillende mengverhouding werden gekenmerkt. In een tweede stap was een kleeflaag van SSA bereid met gelijk gewicht hoeveelheden van beide componenten en met variërende laagdikte op de top van een ondersteunende PDMS film.

Protocol

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Sommige van de chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn irriterende stoffen, acuut toxisch en/of kankerverwekkend. Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij de behandeling van deze chemische stoffen. Dit omvat het gebruik van engineering (chemische kabinet) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen). Gedeelten van de volgende procedures betrekking hebben op de cultuur van een dierlijke cellijn. Volg daarom de specifieke bioveiligheid verordeningen. Chemische en biologische afval moet worden verwijderd volgens de specifieke nationale en institutionele regels en aanbevelingen.

1. bereiding van silicium elastomere dunne Film composiet structuren

  1. Bereiding van polymeren
    1. Ter voorbereiding van 1.1 g PDMS in de verhouding 10:1, meng 1.0 g van samengestelde A met 0,1 g van samengestelde B.
    2. Mix en degase de pre polymeren in een mixer snelheid op 2350 rpm onder vacuüm gedurende 3 minuten.
    3. De massa verhouding tussen samengestelde A en samengestelde B omzetten in 45:1 en 70:1. Bereiden ze lijkt op de methode die is beschreven in 1.1.2.
    4. 1 g van de zachte huid lijm (SSA) in een verhouding van 50:50 voor te bereiden. Daarom Meng 0,5 g van samengestelde A en 0,5 g voor samengestelde B zoals beschreven in 1.1.2.
  2. Voorbereiding van poly-(vinyl alcohol) (PVA) bekleed PET-folie
    1. Bereid een 18% (w/w) PVA-oplossing in water door toevoeging van PVA aan gedeïoniseerd water en meng 's nachts met een magneetroerder. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C.
    2. Dunne lagen een effectieve dikte van 15 µm exposeren met de arts blade toepassing machine, met behulp van 100 µm kloof van het blad en een snelheid van ca. 2,0 mm/s voor te bereiden.
    3. Plaats de films in een oven bij 95 ° C gedurende 15 minuten.
  3. Voorbereiding van de steun-laag van PDMS 10:1 mengverhouding door doctor blade techniek
    1. Gebruik een automatisch gestuurde doctor blade toepassing machine voor de bereiding van de dunne lagen.
    2. Reinigen van de PET-folie met 100% isopropanol en plaats deze op het oppervlak van de doctor blade-module.
    3. Plaats het mes van de arts op de top van de folie en de dikte aanpassen met de micro positionering schroeven. Gelden voor de productie van de natte lagen, diktes van 60 µm, 100 µm, 200 µm en 500 µm.
    4. Vul het PDMS 10:1 polymeer bereid in stap 1.1 in het reservoir van het arts-mes met een spuit voor eenmalig gebruik. Begin beweging van het mes met een snelheid van ca. 2,0 mm/s.
    5. Verwijder de PET-film met het oppervlak van de 10:1 uit de machine en plaats deze in een oven gedurende 1 uur bij 95 ° C, gevestigd in een kamer tentoonstellen van vochtigheid tussen 40% en 65%.
    6. Reinig het mes van de arts met isopropanol en papieren handdoekjes.
    7. Herhaal deze procedure voor alle gewenste diktes.
  4. Voorbereiding van de bovenste laag van PDMS in andere mengverhoudingen door doctor blade techniek
    1. Dunne strepen van de zijkanten van de lengte van de onderliggende film met een scalpel of scheermesje dat plaatsing en glijden van de doctor blade op de PET-folie verwijderen.
    2. Stappen protocol 1.3.3 aan 1.3.6. Natte dikte toegepast voor de film is 160 µm.
    3. Herhaal deze procedure voor de productie van twee onafhankelijke films, elk met een andere mengverhouding van de onderdelen van het PDMS (45:1 en 70:1). Opslaan van de films bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C en bij een luchtvochtigheid tussen de 40 en 65%) in vierkante petrischalen om hen te verhinderen besmetting en stof.
  5. Voorbereiding van dunne samengestelde films vertonen verschillende diktes van de SSA 50:50 laag
    1. Bereiden PDMS 10:1 films als een steun-laag, zoals beschreven in stap 1.3.
    2. Stappen protocol 1.4.1 en 1.4.2 voor de productie van deze films. SSA in de mengverhouding van 50:50 gebruiken en vervaardigen van een film met een natte dikte 40 µm.
    3. Herhaal de procedure voor de extra natte diktes van: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. normale hechting metingen met behulp van substraten met verschillende oppervlakteruwheid

  1. Bereiding en karakterisatie van glazen substraten met verschillende oppervlakteruwheid
    1. Gebruik een glazen cilinder met een diameter van 2 mm als een 'vlotte substraat'.
    2. Voor de vervaardiging van de 'ruwe basismateriaal' accijnzen met een glassnijder een stuk met de dimensie van ongeveer 4 x 4 mm van de dia van een matglas. Gebruik een schurende diamant hand pad te verkrijgen van een cirkelvormige zone van ongeveer 3 mm diameter.
    3. Het glas hechten aan een aluminium kegel met UV lijm en verlichting van het in de kamer verlichting UV gedurende 3 minuten.
    4. De straal van de oppervlakte van het substraat bepalen met een optische Microscoop. Berekenen van de oppervlakte volgens de formule A = πr2.
    5. Bepalen van de ruwheid parameter Reen en Rz (volgens: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) met een stylus-profilometer.
    6. Brengt het substraat op het podium van de steekproef van de profilometer en breng de tip (diamant, standaard: 2 µm/60 °) in contact met het monster.
    7. Het opnemen van het profiel van de ruwheid met een snelheid van 0,3 mm/s en een lengte van 1 mm.
    8. Meten om te analyseren de oppervlakte topografie, een gebied van precies 1 mm2 met een stylus profilometer, beheerd door de bijbehorende software.
      Opmerking: De profilometer wordt beheerd door een externe computer. De houder wordt verplaatst door 0,001 mm y-richting nadat een waterverplaatsing van 1 mm is bereikt in x richting. De opgenomen. RS3 bestand wordt geïmporteerd in Surfcom kaart Expert Software om 3D beelden te creëren.
  2. Normale hechting meting van dunne lagen vervaardigd van PDMS of SSA
    1. Gebruik een scheermesje te snijden de films op de PET-folie in kleine stukjes met een oppervlakte van ongeveer 4,0 cm2 en plaats die ze op een glas dia met UV lijm. Verlichten met UV-licht gedurende 3 minuten.
    2. Monteer het polymere monster op de monsterhouder.
    3. Reinig het substraat oppervlakte zachtjes met ethanol en droog met stikstofgas.
    4. Bevestig het glas-substraat, gemonteerd op de aluminium kegel, naar de lading-cel.
    5. Gebruik de neigbaar tabel (goniometer) uitlijnen van de oppervlakken juist door de tilt hoek van het substraat nadert de polymere film aan te passen. Om dit te doen, brengen het substraat handmatig in contact met de film. De tilt hoek veranderen totdat een volledig parallel uitlijning van beide oppervlakken aan elkaar, gevisualiseerd door de beelden van camera's, wordt verkregen.
      Opmerking: De cel van de belasting is verbonden met de neigbaar tabel. Een glazen prisma bevindt zich onder het monster zoals aangegeven in Figuur 4, waardoor de visualisatie van de contactpunten met twee camera's en de uitlijning van het substraat op de polymeerfolie in te schakelen.
    6. Verplaats het substraat op het oppervlak van het polymeer film totdat een preload stress van 13 ± 5 kPa is bereikt (Figuur 4).
    7. Start het softwarepakket van de aangepaste geprogrammeerde geschreven in LabView naar besturingselement dat de meting van de vereiste parameters, zoals tijd en aanpak/intrekking snelheid houden. De wacht tijd thoudt 1 seconde, de aanpak en detachement snelheid is 30 µm/s en 10 µm/s respectievelijk.
    8. Het uitvoeren van hechting metingen op drie onafhankelijke vervaardigde monsters en op zes verschillende locaties op elk oppervlak van de film.
  3. Data-analyse en berekening van mechanische sleutelfactoren: pull-off stress en werk van de scheiding.
    1. Berekenen van de stress Equation 1 door het verdelen van de opgenomen dwingen door het substraat gebied eenS.
      Equation 2
    2. Het bepalen van de stress van de pull-off, die wordt beschreven als de maximumwaarde van de normaalspanning.
      Equation 3
    3. De verplaatsing Δs verkrijgen door aftrekken van de beginpositie van de treksterkte regimes0 van het monster positie seinde waar-bonding is voltooid. Definiëren van het begin van de treksterkte regime als s0 = 0.
      Equation 4
    4. Corrigeren van de gemeten waarden van de positie van het monster door de systeem-naleving C volgens de volgende vergelijking:
      Equation 5
    5. De curve van de stress-verplaatsing tussen s0 en seinde integreren om te berekenen van het werk van de scheiding.
      Equation 6
  4. Berekening van mechanische sleutelfactoren met behulp van wiskundige computing software oorsprong.
    1. Het opgenomen .dat bestand importeren uit een enkele hechting meting in een tabel van herkomst. De parameters die worden geregistreerd zijn tijd, monster positie en kracht. Deze moet u parameters invoegen in de kolommen A (keer), B (de positie van de steekproef) en C (kracht).
    2. Om te bepalen van de lege waarde, gemiddeld ongeveer 20 meetwaarden van de force voordat u contact opneemt met de polymeerfolie. Naam van deze gemiddelde waarde Fverschuiving en plak het in kolom D.
    3. Berekenen van de achtergrond gecorrigeerde kracht F * volgens de volgende vergelijking
      Equation 7
      en plaats deze vergelijking, zoals hieronder weergegeven, in kolom E.
      Equation 8
    4. Definiëren van het begin van de treksterkte regime als nul verplaatsing, dat wil zeggen, s0 = 0. Daarom bepalen s0 en het aftrekken van de verplaatsing in kolom B en sla het op in de kolom F:
      Equation 9
    5. Bovendien, corrigeren de positie van het monster door de naleving van de machine. Deze correctie wordt uitgevoerd in de kolom G. Insert de volgende vergelijking in kolom G
      Equation 10
    6. Berekenen van de spanning in de volgende kolom H. Daarom, verdelen de kracht door het substraat-gebied. De volgende vergelijking invoegen
      Equation 11
      waar A de oppervlakte van de glazen substraten in mm2 is (bepaald in punt 2.1).
    7. Het werk van de scheiding van de stress en verplaatsing waarden berekenen. Daarom worden de verplaatsing langs de x-as en de stress langs de y-as uitgezet. Het integreren van deze grafiek van s0 seinde waar seinde wordt gedefinieerd als de verplaatsing waartegen treksterkte stress terug naar nul, dat wil zeggen volledige detachement plaatsvond. Om de grafiek te integreren, door de integratie-functie te kiezen. Toevoegen van de berekende waarden in de kolommen I en J.

3. karakterisering van de Films door het scannen van elektronen microscoop (SEM) en optische microscopie

  1. Optische microscopie
    1. Met een scheermesje de polymere film snijd in kleine stukjes (ca. 0,25 cm2) en deze koppelen aan de rand van een glasplaatje. Plaats het glasplaatje verticaal georiënteerd onder een Microscoop rechtop en meten van de dikte van de dwarsdoorsnede van de film.
      Opmerking: Gebruik een 20 X doelstelling (NB = 0,45, theoretische resolutie bij 800 nm 1.1 µm) voor het meten van de film dikte waarden van ca. ≤ 20 µm. Dikte in het bereik van 20 µm tot 50 µm gebruik voor een film een 10 X doelstelling (NB = 0.30, theoretische resolutie bij 800 nm 1.6 µm) en voor een film dikte ≥ 50 µm gebruiken een 5 X doelstelling (NB = 0,15, theoretische resolutie bij 800 nm 3.3 µm).
  2. SEM onderzoek
    1. De PET-folie gesneden en een monster van ca. 2 cm2 hechten aan een glasplaatje en plaats deze verticaal aan de klemmen mechanisme binnen het monster houder ≤ 2 mm onder de bovenrand van de houder.
    2. Selecteer een versnelling spanning van 10 kV, terugverstrooide elektron detector (BSD) en laag vacuüm voorwaarden (60 Pa).
    3. Het aanpassen van de focus, de vergroting, de helderheid en het contrast van de beelden.
    4. Kies een afbeelding Acquisitietijd van 28 s met een resolutie van 1024 x 2048 pixels.
    5. De monsterhouder verwijderen uit de SEM.

4. biologisch onderzoek

  1. Routine cel cultuur van L929 cellen
    1. Gebruik de lymfkliertest fibroblast cellijn L929 voor onderzoek. Cultuur van de cellen in de basale middellange Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640, aangevuld met 10% foetale runderserum en penicilline und streptomycine bij 37 ° C, 5% CO2 in T75 cel cultuur kolven. Passage van de cellen aan een samenvloeiing van ongeveer 70% tot 80%.
    2. Voor de cel passaging, verwijderen van het medium door aspiratie en wassen met calcium- en magnesium gratis fosfaatbuffer (DPBS- / -) voor 30 s onder een laminaire flow kabinet. Daarna Incubeer de cellen met 2 mL Accutase, een enzym-oplossing met Proteolytische en collagenolytic activiteit gedurende maximaal 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    3. Controleer of detachement van de cellen van het celoppervlak van de cultuur kolf met een fasecontrastmicroscoop.
    4. Voeg 8 mL serum-bevattende medium in de kolf en de overdracht de celsuspensie aan een tube van 15 mL reactie.
    5. Neemt een 10 µL monster van de celsuspensie en meng met 10 µL van Trypan Blue.
    6. Bepalen van de cellulaire nummer met een Neubauer-kamer en het totale aantal cellen berekenen.
      Let op: Trypan Blue is giftig, dus de raadpleging van de MSDS, de verplichte procedures beschreven in de spier-en skeletaandoeningen, dragen van geschikte persoonlijke veiligheid bescherming en behandeling onder een chemische kabinet is vereist. Het verzamelen van afval voor chemische afvalstoffen afzetting.
      Opmerking: Trypan Blue positieve cellen zijn blauw, met vermelding van de niet-intacte cellulaire membranen.
    7. Voor de volgende passage, cultuur 5 x 105 cellen in een nieuwe steriele cel cultuur kolf met 10 mL nieuw medium. Voor experimentele omstandigheden, cultuur 3 x 105 cellen in de 6 goed platen en 6 x 104 cellen in elk putje van de 24 goed plaat, met polymere monsters (protocol stap 4.2).
  2. Voorbereiding van samengestelde films cel cultuur experimenten.
    1. Accijnzen enkele stuks van films van de gewenste afmetingen gefabriceerd in protocol stap 1.4 en 1.5 uit de PET ondersteunende laag met een scalpel en plaats met een pincet op het oppervlak van glas cover slips tentoonstellen van een diameter van 12 mm. Leg de monsters in de putten van een 2 4 plaat goed.
    2. Voor de bepaling van de cytotoxiciteit en cel tellen, Verwijder niet de films uit de PET-folie. Knip cirkelvormige gebieden van ca. 9,4 cm2, past netjes binnen de enkele putjes van een 6 goed plaat, uit de films geproduceerd in 1.4 en 1.5 en plaats ze in de putjes van de plaat van een cel cultuur.
    3. Dompel de polymeer monsters in gedeïoniseerd H2O voor ≥ 30 min.
      Opmerking: De polymere monsters kunnen worden gesteriliseerd in autoclaaf. Daarom verwijderen alle polymeer met monsters van de cel cultuur schotels en plaats ze in een glazen petrischaaltje. Sterilisatie wordt uitgevoerd in een autoclaaf bij 2.05 bar gedurende 20 minuten bij een temperatuur van 121 ° C.
  3. Plasma behandeling van polymeren
    1. De films die zijn aangesloten op plaatsen PET-folie of op ronde glazen cover slips (vervaardigd in 4.2.1) binnen de kamer van de reactie van de plasma-apparaat.
    2. Sluit het deksel en evacueren totdat een druk van 1.6 x 10-2 mbar is bereikt.
    3. Plasma behandeling voor 3 min uitvoeren.
    4. Ventileer de kamer reactie en Leg monsters in 24 goed of 6 goed gerechten voor verdere cel cultuur onderzoeken.
    5. Gebruik één monster voor water contacthoek bepaling met een goniometer. Daarom verplaatsen van de spuit dicht bij de polymere oppervlakte, met behulp van het softwarepakket en breng een druppel van 3 µL water op de top van het oppervlak. Bereken de contacthoek statische water met de goniometer software.
  4. Kleuring en microscopie
    1. Bereiden cellen zoals beschreven in stap 4.1.7 en cultuur voor 3 d bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Fase contrast foto's van cellen gekweekt voor drie dagen op ongerepte vastleggen- en plasma behandeld films kort voor fixatie.
    3. Bereiden van PBS aangevuld met 0,2% Triton-X-100. Pipetteer langzaam 200 µL van de stockoplossing in 100 mL PBS (PBS-T).
    4. Bereid een 4% paraformaldehyde/PBS oplossing (PFA/PBS-T).
      Let op: Paraformaldehyde is giftig, dus de raadpleging van de MSDS, de verplichte procedures beschreven in de spier-en skeletaandoeningen en dragen van geschikte persoonlijke veiligheid bescherming en behandeling onder een chemische kabinet is vereist.
    5. Bereid een 5% BSA/PBS-T-oplossing.
    6. Verwijder het medium door aspiratie onder de kast lamina-stroom. Breng PBS in de putjes middellange residuen te verwijderen.
    7. De plaat overbrengen in een chemische kabinet en vervangen van PBS met 400 µL van de PFA/PBS-oplossing voor 25 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder de PFA/PBS-oplossing uit de enkele putjes, zorgvuldig wassen met PBS viermaal. Wacht 3 min. tussen elke stap van het wassen en het verzamelen van de oplossingen voor chemisch afval. De plaat rechtstreeks gebruiken, of bewaren bij 4 ° C.
    9. Toevoegen van 5% bovien serumalbumine (BSA) / PBS-T aan de putjes en incubeer gedurende 60 minuten op RT aspecifieke bandplaatsen blokkeren.
    10. De oplossing gecombineerd en vervangen door een geconjugeerd met Alexa-488 (1:160 verdunning) phalloidin / PBS-T oplossing aangevuld met 0,2% Triton-X-100.
      Let op: Phalloidin-488 is giftig, dus de raadpleging van de MSDS, de verplichte procedures beschreven in de spier-en skeletaandoeningen en dragen van geschikte persoonlijke veiligheid bescherming en behandeling onder een chemische kabinet is vereist.
    11. De afdekplaat met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 3 uur op RT of overnacht bij 4 ° C.
    12. De oplossing gecombineerd en spoel driemaal met PBS. Wacht 3 min. tussen elke stap wassen. Het verzamelen van de oplossingen voor chemisch afval.
    13. Bereiden van een oplossing van 1 µL van Hoechst kleurstof 33342 (stockoplossing 1 mg/mL). Voor de verdunning van een 1:1000 Pipetteer 1 µL van Hoechst kleurstof 3334 tot 1 mL PBS-T en meng goed. Voeg 300 µL van de kleurstof van de 33342 oplossing van Hoechst de putjes en incubeer gedurende 10 min op RT in het donker.
      Let op: Hoechst kleurstof 33342 is een intercalating DNA-reagens en dus potentieel mutageen, daarom consulting de MSDS, de verplichte procedures beschreven in de spier-en skeletaandoeningen en het dragen van geschikte persoonlijke veiligheid bescherming en behandeling onder een chemische kabinet is vereist.
    14. De oplossing gecombineerd en wassen van de monsters viermaal met PBS. Wacht 3 minuten tussen elke stap wassen. De oplossing voor chemisch afval te verzamelen.
    15. Voor het insluiten, zorgvuldig verwijderen van de films van het oppervlak van de cultuur en plaats ze op een microscoopglaasje van glas. 20 tot 40 µL van water oplosbare insluiten medium aan de film toevoegen en voeg een nieuwe circulaire glas cover slip op de top met lichte druk.
    16. Imaging met een fluorescentie Microscoop uitvoeren. Filters nodig voor verlichting: Alexa-488 heeft een maximum van excitatie op 496 nm en maximum emissie treedt op bij 519 nm. Daarom is de emissie kleur groen. Hoechst kleurstof 33342 trihydrochlorid Trihydraat complexvorm met DNA heeft een excitatie maximaal bij 355 nm en maximum DNA complexe emissie treedt op bij 465 nm.
  5. Bepaling van de cytotoxiciteit en de bepaling van het celaantal
    1. Het experiment met cellen gekweekt in de 6 goed platen bereid in stap 4.3 en cellen bereid in stap 4.1.7 uitvoeren. Cultuur de cellen gedurende 3 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Voor de positieve controle, cellen die zijn geteeld op een cultuur behandeld polystyreen celoppervlak, met geen polymere films te gebruiken. Voor achtergrond bepaling (negatieve voorwaarde), kunt u het medium verkrijgen door een goed zonder cellen.
      Opmerking: Medium kan ook worden genomen uit de goed met cellen gekweekt op het celoppervlak van het polystyreen van cultuur behandeld.
    2. Volgens het aantal experimentele monsters label 15 mL buisjes.
    3. 40 µL van een 0,9% Triton X-100 met PBS-oplossing toevoegen aan de positieve controle en meng krachtig met een 1000 µL tip. Ca. 3 min wachten.
    4. Zonder het verwijderen van de cellen die zijn gekoppeld aan het oppervlak, het medium van alle monsters, met inbegrip van monsters die zijn voorbereid in 4.5.3 gecombineerd en het medium overdragen aan de 15 mL tubes. Voeg 3 mL DPBS- / - de enkele putjes en sla de platen onder de laminaire flow kabinet voor bepaling van de cellulaire nummer zoals beschreven in 4.5.9.
    5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten en 1 mL van het supernatans dat voor de bepaling van LDH activiteit verwijderen. Slaan de 15 mL buisjes met cellen en resterende medium onder de laminaire flow kabinet.
    6. Voor de test worden een zwart 96 goed platen met vlakke bodem gebruikt. 50 µL van CytoTox-ONE reagens toevoegen aan 50 µL van het monster medium en mix goed voor 30 s.
    7. De afdekplaat met aluminiumfolie en op te slaan gedurende 10 minuten op RT.
    8. Voeg 25 µL van de stop-oplossing aan elk putje en opnemen van de intensiteit van de fluorescentie met een fluorescentie-afleesapparaat. Schud de plaat voor 10 s en detecteren de fluorescentie-signaal met een golflengte van de excitatie van 520 nm en een golflengte van de emissie van 560 nm. Vermijd luchtbellen.
    9. Voor bepaling van de cel nummer aspirate de DPBS- / - de putjes van de plaat van de cultuur van protocol stap 4.5.4 en de oplossingen aan de 15 mL reactie buizen met het supernatant verzameld in stap protocolnummer 4.5.5 toevoegen.
    10. Centrifugeer de reactiebuis 15 mL bij 200 x g gedurende 3 min en supernatant gecombineerd. Voeg 0,5 mL trypsine/EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    11. Voeg 2 mL trypsine/EDTA op in de putjes van de plaat en incubeer gedurende ca. 10 minuten bij 37 ° C om los van cellen uit de polymere films te maken.
    12. De celsuspensie wordt overgebracht naar de reactiebuis 15 mL van het nummer van de deelactiviteit 4.6.10. Bovendien was de platen krachtig met serum met medium.
    13. Centrifugeer de monsters bij 200 x g gedurende 3 min, gecombineerd het supernatant en toevoegen van serum met medium op de buis.
    14. De cellulaire nummer zoals beschreven in stappen 4.1.5 en 4.1.6 bepalen.

Representative Results

In de eerste experimenten, PDMS films met variërende dikte en constante van 10:1 mengverhouding vervaardigd op PET films (Figuur 1). Omdat de dikte van de laag van de steun kan beduidend beïnvloeden vervaardigd de stijfheid en de behandeling van de eigenschappen van de gehele samengestelde films, in de eerste experimenten enkele films tussen 13 ± 2 µm en 296 ± 13 µm waren (Figuur 1). Het is algemeen bekend, dat tijdens het genezen proces krimp van de polymeerlagen optreedt. Voor de dunste films zien we een verschil van 78% ± 3,1% tussen genezen en natte omstandigheden. Voor de dikste films, krimp van 40,9% ± 2,6% is aangetroffen (Figuur 1).

Voor de applicaties ter sprake komen in dit protocol, films moeten handmatig worden verwijderd van de PET-folie. Wij erkend dat vooral dunne films moeilijk zijn te behandelen met een tang en vaak tijdens dit proces worden vernietigd. Dus onderzochten we de invloed van een dunne poly-(vinylalcohol) als een ondersteunende laag coating. PVA bezit een hoge stijfheid en eenvoudig kan worden verwijderd als gevolg van de oplosbaarheid in water in downstream toepassingen. Het oppervlak van het PVA heeft een dikte van ca. 17 µm en daarom PDMS films op de top van deze laag bedekt zijn iets dunner in vergelijking met films zonder het PVA coating (gegevens niet worden weergegeven). Vooral gericht op de eigenschappen van de handling, concluderen we, dat alleen de dunste film vereist een ondersteunende PVA-film voor verwijdering van de PET-folie.

Een effectieve laagdikte van ongeveer 40 µm werd geselecteerd voor alle verdere experimenten. Voor de productie van samengestelde films, was de mengverhouding voor PDMS varieerde van 10:1, 45:1 en 70:1 en toegepast op de top van de eerder gepolymeriseerde PDMS film met de arts blade techniek (figuur 2A). Met uitzondering van de 10:1-verhouding, zich de verschillende films duidelijk kunnen onderscheiden door optische microscopie met passende precisie. Voor de microscopische analyse werden de films gesneden met een scalpel en gekoppeld aan de rand van een glasplaatje. De hogere mengverhoudingen van de bovenste laag verscheen visueel helderder op de microscopische beelden in vergelijking met de 10:1-verhouding van de steun laag (figuur 2B). Daarnaast werd scanning elektronen microscopie gebruikt om het imago van de monsters bij een vergroting van ongeveer 860 X (figuur 2C). Een duidelijk waarneembaar verschil in helderheid tussen de twee PDMS films, vervaardigd in hogere mengverhoudingen werd erkend, in tegenstelling tot de 10:1 ratio. De procedure snijden laat sporen, zichtbaar in de SEM afbeeldingen (figuur 2B). Op basis van deze resultaten, was de gemiddelde totale dikte van de samengestelde films 112 µm ± 5.0 µm (figuur 2D).

De eigenschappen van de hechting van deze films zijn in verdere experimenten vastgesteld met normaalkracht hechting metingen met behulp van twee verschillende glazen substraten (Figuur 3). Het 'gladde substraat' bezit een textuur met een rekenkundig gemiddelde ruwheid Reen 0.013 ± 0.0002 µm en een gemiddelde piek-tot-vallei Rz van 0,12 ± 0.004 µm (figuur 3A). Substraat 2 (GS2, aangewezen als ruwe) tentoongesteld ruwheid waarden van 0.338 ± 0.021 (Reen) µm en 2.055 ± 0,017 µm (R-z) (figuur 3B). Met de gemiddelde is straal verkregen in de oppervlakte van het 'gladde' substraat 3.2 mm2 terwijl voor de 'ruwe' substraat een oppervlakte van 6.07 mm2 is 2.1.4 berekend.

Met deze twee substraten, is de zelfklevende gedrag van de verschillende films vastgesteld. Twee parameters worden gekozen om te beschrijven de adhesieve eigenschappen van de films: de pull-off spanning σmax en het werk van scheiding Wsep. Tijdens het hele proces van lijmen en -bonding betreffendedepositie van de steekproef worden s en de normale kracht F opgenomen. Het resultaat wordt weergegeven in een stress-verplaatsing-curve (Figuur 4).

Voor de juiste interpretatie van de experimentele resultaten is het van belang voor het nauwkeurig uitlijnen het substraat aan de oppervlakte van polymere film. De overeenstemming van de machine van het apparaat voor meting moet ook worden overwogen om te corrigeren van de verplaatsing. Tijdens de meting treedt de toegepaste kracht niet uitsluitend op het monster, maar ook op andere delen van het beproevingstoestel. Daarom is elk van de twee substraten tegen een glasplaatje met een drukspanning van 13 ± 5 kPa gedrukt. Voor het meten van de naleving, wordt de belastingscurve rekening gehouden, dat wil zeggen, het deel van de kracht-verplaatsing-curve waar de twee oppervlakken komen in aanraking tot de positie van de monster waar de exacte preload kracht is bereikt. De wederzijdse helling van de curve is gelijk aan de machine compliance C. De berekende waarde voor C is 0,12 µm/mN.

Bij het eerste experiment films met verschillende mengverhoudingen voor PDMS werden geanalyseerd (Figuur 5). De dikte en de mengverhouding van de steun laag, vervaardigd van PDMS 10:1, was voor de samengestelde films, constant gehouden. De dikte van de toplaag was ook constant met een waarde van 65 µm gehouden. De hoogste pull-off stress van 109 27.6 kPa werd bepaald met de effen glas-substraat op de PDMS 10:1 film (figuur 5A). Een stijging van de mengverhouding leidt tot een daling van de pull-off-stress bij 76.7 17 kPa voor 45:1 mengverhouding en 41.4 17 kPa voor de verhouding van de 70:1. Met de ruwe glas substraat een pull-off stress van 22 ± werd 2,2 kPa vastgesteld op de PDMS 10:1 film. In het algemeen, het werk van de scheiding was vergelijkbaar tussen beide glazen substraten, bijv., 1.4 ± 0,6 J/m2 op de dunste film met de soepele substraat en 1.84 ± 0,7 J/m2 op de dunste film verkregen verkregen met de ruwe ondergrond ( Figuur 5B).

Vervolgens onderzocht de productie van dunne lagen voor huid toepassingen en toepassingen zijn geweest van de cultuur van de cel (Figuur 6). SSA 50:50 is gebruikt voor de productie van de bovenste laag van de samengestelde films. PDMS in een 1:10 met een dikte van circa 40 µm mengverhouding is gebruikt als een laag van de steun. In tegenstelling tot de eerdere experimenten afgebeeld in Figuur 5, de dikte van de toplaag was gevarieerd, terwijl de mengverhouding was constant gehouden (figuur 6A). SSA werd uitgekozen vanwege de adhesieve eigenschappen in toepassingen waarbij gehechtheid aan oppervlakken met hoge oppervlakteruwheid, vooral menselijke huid, met behulp van de aanbeveling van de fabrikanten van het mengen van de verhouding 50:505,8. Menselijke epidermis bezit een hoge oppervlakteruwheid. Afhankelijk van leeftijd en anatomische gemeld regio die een diepte (R-Z) van de gemiddelde oppervlakteruwheid tussen 48 µm en 71 µm geweest29. Veilige en zachte huid hechting is belangrijk, bijzonderheid voor de gevoelige huid van pasgeborenen of nauwelijks herstel van de huid van ouderen. Verschillende natte diktes variërend van 40 µm, 120 µm, 300 µm tot 500 µm werden toegepast (figuur 6A). Afhankelijk van de natte dikte varieert de totale dikte van de samengestelde films tussen 51 µm en 344 µm (figuur 6B). Na uitharding de samengestelde zijn gekoppeld aan de achterkant van de vrijwilliger hand (Figuur 6 c). De verschillende films diktes duidelijk verschillen in de eigenschappen van hun aanpassing aan de ruwheid van de huid (Figuur 6 c). Dunne lagen (50 µm en de totale dikte van 100 µm) weergegeven met een hoge mate van aanpassing op de huid-rimpels in vergelijking met de dikkere films (220 µm en de totale dikte van 340 µm). Deze resultaten wijzen erop dat de samengestelde films met een breed scala aan diktes juist met de toegepaste doctor blade techniek kunnen worden geproduceerd.

Hechting experimenten werden uitgevoerd met deze samengestelde films (Figuur 7). Afhankelijk van de dikte van de SSA top film, hebben we een daling van de stress pull-off waargenomen met toenemende laagdikte. De hoogste pull-off kracht van 133 kPa 36,6 werd gemeten op de gladde ondergrond (figuur 7A). De laagste pull-off-stress van 18 kPa 4 werd verkregen met een ruwe substraat op de dikste film. Interessant is dat blijkt een vergelijking tussen beide substraten een 2.7 vouw verschil op de dunste films (figuur 7A). Met steeds grotere laagdikte, vooral op de dikste films was geen opmerkelijk verschil waarneembaar (figuur 7A). Met de gladde ondergrond een werk van scheiding van 1.8 ± 0.8 J/m2 is aangetroffen op de film vertonen een totale dikte van ca. 100 µm, gevolgd door een film dikte afhankelijke daling (220 µm-dikte: 1.6 ± 0,6 J/m2 en 330 µm: 1,3 ± 0,4 J/m2 (Figuur 7B)). Het werk van de scheiding met de ruwe ondergronden gemeten werd in het algemeen iets lager vergeleken met de gladde ondergrond (dikte van 100 µm: 1,63 ± 0,6 J/m2; 220 µm dikte: 1,1 ± 0,6 J/m2 en 330 µm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (figuur 7B )).

Bovendien, werd het mechanisme van het detachement opgenomen tijdens de metingen (Figuur 7 c). Weinig cavitatie werd waargenomen op de dunste film, terwijl de verschijning van de vinger als inbreker waarneembaar op de dikkere films (Figuur 7 c was).

Metingen zijn uitgevoerd binnen één maand na de vervaardiging van de films. Stabiliteit en het behoud van de mechanische eigenschappen van de elastische films kunnen echter worden beïnvloed door omgevingsfactoren, zoals temperatuur en vochtigheid. Zoals beschreven in het protocol stap 1.4.3, zijn de films opgeslagen bij kamertemperatuur en een vochtigheid van 40-65%. Om te voorkomen dat zijn ze van besmetting en stof, de films opgeslagen in plastic petrischaaltjes in het donker. Om te onderzoeken de stabiliteit op lange termijn, de hechting metingen en de bepaling van de dikte van BVS zijn 50:50 films uitgevoerd ca. vier maanden na fabricage. Geen grote invloed op de laagdikte, pull-off stress en werk van scheiding is geconstateerd na opslag. Bijvoorbeeld, was pull-off stress van de SSA samengestelde films gemaakt met een natte dikte 120 µm SSA en een natte dikte van 100 µm PDMS 46.6 ± 6 kPa en het werk van scheiding 1627 ± 592 mJ/m2 na fabricage. Ca. vier maanden na productie, werd een pull-off stress van 48.8 ± 5,4 kPa en een werk van scheiding van 1666 ± 723 mJ/m2 bepaald. Daarnaast hebben kort na de fabricage, de totale dikte van deze films werd 103.3 ± 13,9 µm en na opslag 98,1 ± 9.1 µm.

In verdere experimenten PDMS 10:1 en SSA 50:50 samengestelde films met een totale dikte van ca. 105 µm hebben gewerkt cel cultuur substraten (Figuur 8). Samengestelde films vervaardigd in stap protocolnummer 1 kunnen gemakkelijk worden verwijderd uit de PET-folie en knippen in de gewenste afmetingen en geometrische vormen. Bovendien, wanneer de films op een rigide vast te houden oppervlakte, voor voorbeeld glas, meerdere films weergeven van verschillende Youngs moduli naast elkaar kunnen worden gekoppeld en kunnen worden geplaatst binnen een enkel putje van een cel cultuur plaat. Films kunnen worden gekoppeld aan de polystyreen oppervlak direct zonder een extra dekglaasje aan. Ook kon films worden aangepast aan verschillende oppervlakken en geometrische structuur, zoals buizen of ringen, waardoor verdere studies niet realiseerbaar met conventionele cel cultuur materialen. In de uitgevoerde experimenten afgebeeld in Figuur 8 zijn samengestelde films op PET-folie geplaatst rechtstreeks in de cel cultuur platen of films hebben verwijderd van de PET-folie en geplaatst op glas cover slips. Voor de experimentele omstandigheden, zijn sommige polymeren met lucht plasma te verhogen van hun vrije oppervlakte-energie behandeld. In het algemeen, PDMS bezit een contacthoek van water van ca. 115° vóór de plasma behandeling en wordt zeer hydrofiele (water contacthoek < 30°) nabehandelingsinrichting8. Plasma behandeling maakt het oppervlak biocompatibel en vergemakkelijkt de bevestiging van eukaryote cellen. Afhankelijk van de behandeltijd en intensiteit het polymeer oppervlak wordt veranderd, een hogere mate van ruwheid weergeven en ook crack kan worden weergegeven. Onmiddellijk na de behandeling, wordt een hydrofobe herstelproces waargenomen. Zoals beschreven onder protocol stap 4.3.5 werd een goniometer gebruikt voor het bepalen van de statische water contacthoeken. Daarom zijn polymeren die zijn geplaatst in ddH2O voor 1 h na de luchtbehandeling voor plasma vervolgens geanalyseerd. Plasma behandeling de contacthoek water aanzienlijk verminderd (PDMS ongerepte: 117.0 ± 2,2 °; SSA ongerepte: 127.9 ± 5,6 °; PDMS plasma: 18,0 ± 7,2 °; SSA plasma: 29.3 ± 11,5 °).

Voor de steekproef inbedding van een waterige montage is medium vereffend. Als op enig moment van tijd de monsters weer worden verwijderd moeten, kunnen de specimens worden geplaatst in een petrischaal 's nachts met water. Uiteindelijk, kan de hoes glijdt worden verwijderd voor aanvullende analyse.

De bijlagen en morfologie van cellen van de L929 zaadjes voor 3 dagen op PDMS en SSA 50:50 samengestelde films is bepaald door de fase contrast microscopie en na kleuring met fluorescentie geconjugeerd phalloidin-488 en Hoechst kleurstof 33342 (Figuur 8). Beeldacquisitie met fase contrast microscopie is een aanrader, vooral voor polymeren niet behandeld met plasma. Als gevolg van de zwakke cellulaire hechting op deze polymere oppervlakken afzonderlijke cellen of geaggregeerd gemakkelijk losgekoppeld, complicerende correcte interpretatie van de latere analysemethoden.

Cellen zaadjes van de ongerepte polymeren weergegeven arme bijlage en mobiele uitspreiden gedrag (figuur 8A1 en C1) terwijl een confluente enkelgelaagde werd waargenomen voor cellen gekweekt op plasma behandelde oppervlakken (figuur 8B1 en D1) . De vorming van cellulaire aggregaten en detachement van het oppervlak is meer uitgesproken op ongerepte oppervlakken. Visualisatie van actine-filamenten na fixatie met 4% paraformaldehyde bleek weinig cellen migreren naar de periferie van de cellulaire aggregaten en emanatie van lamellipodia uitsteeksels aan ongerepte PDMS en SSA 50:50 samengestelde films (figuur 8A2 en C2, pijlen). Geen grote kwalitatieve verschillen kon worden waargenomen tijdens het vergelijken van beide polymere materialen. Als een terzijde, blijkt dat een minder hoeveelheid cellulaire aggregaten waren aanwezig op SSA 50:50 in vergelijking met de PDMS. De aggregaten gekoppeld aan de oppervlakken op SSA 50:50 verscheen ook, dat meer afgevlakt (figuur 8C 1). Zoals verwacht, verbeterd behandeling met lucht plasma cellulaire bijlage en verspreiden op beide oppervlakken aanzienlijk, wat leidt tot de vorming van opmerkelijke lamellipodia uitsteeksels en een confluente enkelgelaagde (figuur 8B2 en 8D 2).

Release van LDH na 3 dagen van cultuur werd gebruikt als een indicator om te bepalen van cytotoxische effecten (figuur 9A). In het algemeen, LDH niveaus waren vergelijkbaar voor cellen gekweekt op beide polymere materialen, met minder dan 5% cytotoxiciteit (ongerepte PDMS: 2,8 ± 2,0%, ongerepte SSA 50:50: 4.5 ± 3,6%; plasma behandeld PDMS: 3,4 ± 1,5%; plasma behandeld SSA 50:50: 3,4 ± 1,6%). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met de gegevens in onze eerder gepubliceerde studie zich te concentreren op het onderzoek van beide elastomeren. 8 als u wilt verder valideren de resultaten van de LDH test, een trypan blauwe uitsluiting test werd uitgevoerd. Bovendien was de hele cel bevolking vastbesloten om het weergeven van verschillen in proliferatie activiteit (figuur 9B). In het algemeen minder dan 5% Trypan blauw positieve cellen werden geteld (ongerepte PDMS: 2.4 ± 0,3%; ongerepte SSA 50:50: 3.8 ± 2,5%; plasma behandeld PDMS: 0,74 ± 1,3% plasma behandeld SSA 50:50: 0.95 ± 1,6%).

Figure 1
Figuur 1: voorbereiding van PDMS films op poly-(vinyl alcohol) (PVA) PET-folie bekleed: Het proces voor het vervaardigen van PDMS films met verschillende dikte op een PET-folie werd toegepast om na te gaan van de reproduceerbaarheid en de behandeling van de prestaties (A). De diktes van de PDMS films werden geanalyseerd met optische microscopie na uitharding bij 95 ° C (B). N = 3 onafhankelijk geproduceerde films werden geanalyseerd. Van elke film, 3 verschiedene Standorte werden gekozen, knippen en 3 posities op elk monster werden geanalyseerd (k = 27). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: voorbereiding van samengestelde films van PDMS bereid in andere mengverhoudingen: Samengestelde films vertonen verschillende mengverhoudingen van de base (onderdeel A) naar crosslinker (onderdeel B) voor PDMS werden vervaardigd door doctor blade techniek. De bovenste laag bestaande uit PDMS in de verhouding 10:1 (component A:B), werden 45:1 en 70:1 toegepast op de top van een eerder genezen PDMS 10:1 film (A). Na het uitharden van de latere bij 95 ° C was de dikte van de samengestelde films geanalyseerd door optische microscopie (B) en scanning elektronen microscopie (C). N = 3 onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd en geanalyseerd met optische microscopie (D). Elke onafhankelijke vervaardigde film vormen, 3 verschiedene Standorte werden gekozen, knippen en 3 posities op elke monsters werden geanalyseerd (k = 27). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: bepaling van de topografische oppervlakteruwheid van de twee substraten voor de hechting metingen gebruikt: Twee glazen substraten bezitten verschillende oppervlakteruwheid werden gekenmerkt. Drie dimensionale profilometric analyse van het oppervlak werd uitgevoerd op het 'gladde' substraat GS (A1) en de 'ruwe' substraat GR (B1). Overeenkomstige enkellijns curven zijn afgebeeld in A2 en B2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: beginsel van de normale hechting metingen: Een maatwerk setup werd gebruikt voor het karakteriseren van de eigenschappen van de hechting van de polymeer-monsters. De meting setup wordt afgebeeld in (A) en (B) details worden weergegeven. Bij de analyse van de meting, werd stress bepaald door een stress tijd curve (C). Werk van scheiding werd bepaald door een integratie van de curve van de stress-verplaatsing tussen seinde en s0 (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: bepaling van de eigenschappen van de hechting van samengestelde films met verschillende mengverhoudingen voor PDMS: Pull-off stress (A) en werk van (B) scheiding van de samengestelde films geproduceerd voor PDMS in mengen ratio 10:1, 45:1 en 70:1 werden gemeten. Bij de analyse, een 'gladde' glas substraat (GS) exposeren een Ra = 0.013 µm en een 'ruwe' glas-substraat (GR) met Reen = 0.338 µm werden gebruikt. N = 3 onafhankelijk geproduceerde films werden geanalyseerd. Van elke film, twee stukken werden gekozen en drie verschillende posities op elk monster werden geanalyseerd (k = 18). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: voorbereiding van samengestelde films van SSA met variërende dikte: SSA 50:50 werd toegepast op de top van een eerder genezen PDMS 10:1 film (A). Verschillende natte diktes van deze laag variërend van 40 tot 500 µm werden toegepast en de dikte na uitharding onderzocht met optische microscopie (B). Bevestiging van de films aan de achterkant van een hand weergegeven dat films met een totale dikte van ca. 100 µm (film #2) gelijkvormig goed aan de ruwheid van de huid (C) vrijwilligers. Dikte van de enkele lagen en de totale dikte van de samengestelde films worden getoond in figuur 6B. Voor de analyse n = 3 onafhankelijk vervaardigde monsters werden gemeten met optische microscopie. Van elke film, 3 verschiedene Standorte werden gekozen, knippen en 3 posities op elk monster werden geanalyseerd (k = 27). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Schaal bar in 6C toont ca. 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: bepaling van de wrijvingscoëfficiënt eigenschappen van samengestelde films van de zachte huid lijm: Dunne samengestelde films van SSA als toplaag en PDMS 10:1 als steun laag werden vervaardigd. De dikte van de toplaag was varieerde tussen de 50 en 330 µm. Pull-off stress (A) en werk van (B) scheiding van de samengestelde films gemeten met twee verschillende glazen substraten werden geanalyseerd (een 'vlotte' glas-substraat (GS) exposeren een Reen = 0.013 µm en een 'ruwe' glas-substraat (GR) met Reen = 0.338 µm). Voorbeeld foto's van het detachement mechanismen worden gevisualiseerd in C. Voor data analyse n = 3 onafhankelijk vervaardigde experimenten werden geanalyseerd. Van elke film, twee stukken werden gekozen en drie verschillende posities op elk monster werden geanalyseerd (k = 18). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Schaal bars in 7C verbeelden 0.5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: cellulaire morfologie van L929 fibroblasten gekweekt op dunne films: L929 lymfkliertest fibroblasten werden gekweekt voor 3 dagen op de dunne films vervaardigd uit PDMS (A1, A2, B1, B2) of SSA (C1, C2, D1 en D2). Om hydrophilicity van de oppervlakken lucht plasma behandeling werd uitgevoerd (B1, B2, D1, D2). Schaal bars in D1 en D2 verbeelden 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: bepaling van de cytotoxiciteit en cellulaire proliferatie: Voor de bepaling van de cytotoxische effecten en cellulaire proliferatie, werden L929 cellen zaadjes voor drie dagen op PDMS 10:1 en SSA 50:50 samengestelde films. Vrijlating van lactaat dehydrogenase (LDH) werd bepaald door een bepaling van de activiteit LDH en minder dan 5% bleek cytotoxiciteit (A). Totale celaantal na de teeltduur evalueerden na handleiding tellen de enkelvoudige cellen met een Neubauer-kamer (B). N = 3 onafhankelijk experimenten uitgevoerd werden geanalyseerd. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het ontwerp van composiet structuren kan de eenvoudige aanpassing van de eigenschappen van het materiaal, zoals Youngs modulus of de dikte van de monsters. De Youngs modulus voor PDMS kan effectief worden gewijzigd in een brede waaier door de mengverhouding tussen deze twee onderdelen wijzigen of vervaardiging van mengsels met behulp van een verschillende silicone-elastomeer30,31. De beschreven methoden zijn niet beperkt tot het PDMS van gebruikt in het huidige onderzoek, maar vooral de prestaties van de lijm hangt sterk af van het specifieke type wordt gebruikt. Een kritieke stap binnen dit protocol is het productieproces van de samengestelde films (Figuur 1). Het bleek dat de dikte van de films sterk het gedrag van de hechting van de films op verschillende ondergronden beïnvloedt, met inbegrip van de huid (Figuur 5 en Figuur 6). Naast de laagdikte, tijd- en temperatuurdisplays tijdens het genezen is van invloed op de eigenschappen van het materiaal-32. Parameters als de dikte van de polymere lagen moeten daarom zorgvuldig worden aangepast en geverifieerd.

Analyse van de adhesieve eigenschappen van de dunne films werd uitgevoerd met de normaalkracht hechting metingen met behulp van twee glazen substraten met verschillende oppervlakte ruwheid tot Ra = 0.338 µm (Figuur 3). In het algemeen, de ruwheid invloed aanzienlijk de hechting van oppervlakken, met name van elastische materialen33,34. De ruwheid van glas kan gemakkelijk worden gevarieerd door schuren met schuurpapier van verschillende asperity afmetingen, waardoor de fabricatie van substraten vertonen hogere waarden van de ruwheid21. In toevoeging, andere materialen, kan bijvoorbeeld epoxyhars worden gebruikt voor de productie van substraten15,35. Dit zou een ingrijpende wijziging-strategie van de gepresenteerde protocol. Bijvoorbeeld, als substraten tentoonstellen van verschillende oppervlakte vrije energieën nodig of specifieke zijn topografieën vereist. Hier, werden pull-off stress en werk van de scheiding van de dunne films geproduceerd voor PDMS en SSA geanalyseerd met een op maat gemaakte setup (macroscopische hechting meting apparaat (MAD, Figuur 4)). 36 optische uitlijning van substraat en indenter is een cruciale stap voor de analyse van de meetresultaten. Daarom moet de aanpassing van de tilt hoek met de goniometer, zo nauwkeurig mogelijk uit te voeren. Dit kan worden bereikt met voldoende nauwkeurigheid doordat handmatig het substraat in contact met het oppervlak van de film tot een horizontale contactpersoon is bereikt.

In het huidige protocol was de wachtruimte tijd constant gehouden op één seconde (Figuur 5 en Figuur 7). Vooral voor het onderzoek van de zelfklevende prestaties van een elastische film op een ruwe ondergrond oppervlak biedt een uitbreiding van de wacht tijd aanvullende informatie. Bijvoorbeeld, is een toename van de stress-pull-off met toenemende greep tijd gerapporteerde8geweest. Naast de metingen in het huidige protocol, andere methoden, bijvoorbeeld peel tests kunnen worden uitgevoerd, waardoor een meer omvattende onderzoek van hechting prestaties37.

De adhesieve eigenschappen van samengestelde films vertonen verschillende film diktes van de zachte huid lijm werden vastgesteld (Figuur 7). Onze resultaten zijn in overeenstemming met de gepubliceerde gegevens, waaruit blijkt dat een daling van film dikte leiden tot een toename van de stress pull-off als de opsluiting, dat wil zeggen, de verhouding tussen substraat diameter en film dikte, verhogingen38,39 . Op basis van deze resultaten en de gegevens die zijn afgebeeld in Figuur 7, concluderen we dat samengestelde films met een totale dikte van ca. 100 µm (een dikte van de laag van de SSA van ca. 60 µm toegepast op een PDMS-film met een dikte van circa 40 µm) gunstige hechting p vertonen eigenschappen op ruwe oppervlakken.

Vervolgens experimenten aan de karakterisering van biologische gerelateerde hebben verricht voor de ongerepte samengestelde films en plasma behandeld samengestelde films (Figuur 8). Plasma behandeling van silicium elastomeren is een vaak toegepaste, veelzijdige techniek te verhogen de hydrofiele eigenschappen van oppervlakken en het bevorderen van cellulaire gehechtheid en mobiele verspreiding van40,41. Siliconen staan bekend om hun lage toxiciteit en de hoge biostability maar kunnen bevatten residuele monomeren of katalysatoren die fysiologische processen, leidt ook tot cytotoxiciteit42,43kunnen beïnvloeden. In de uitgevoerde experimenten die we hebben waargenomen minder dan 5% cytotoxiciteit met LDH release als een indicator en een Trypan blauw uitsluiting assay. In het voorgestelde protocol, de gehele cellulaire bevolking, met inbegrip van cellulaire aggregaten vrijstaande vorm die het oppervlak heeft geanalyseerd voor proliferatie analyse (figuur 9B). Een wijziging van het protocol kan meer gedifferentieerde resultaten opleveren. Voor elk monster, kon het supernatant met vrijstaande cellulaire aggregaten worden overgebracht naar een aparte reactiebuis en niet gecombineerd met de cellen enzymatisch verwijderd van het oppervlak van het polymeer. Dat zou mogelijk de exacte beoordeling van cellen die zijn gekoppeld aan het oppervlak en uiteindelijk het onthullen van een meer gedetailleerde bepaling van de invloed van de polymeren vallende op het proces van cellulaire hechting. Naast de immunocytochemische methoden hier gepresenteerd, misschien cellen met immunoblot methoden, waardoor een gedetailleerde kwantitatieve beoordeling van eiwit expressie voor onderzoek worden geoogst.

Kortom, hebben wij vastgesteld productie voorwaarden voor de productie van dunne elastomere samengestelde films voor toepassingen in geavanceerde celonderzoek cultuur. Bovendien bezitten deze dunne lagen hoog aanpassingsvermogen huid ruwheid, waardoor geavanceerde ontwerp van huid lijm.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Martin Danner is erkend voor zijn hulp bij de voorbereiding van de monsters en de vaststelling van cel cultuur procedures. De auteurs bedank Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Duitsland), met name Robert Radsziwill voor continue ondersteuning en discussies. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (FP/2007-2013) ERC subsidieovereenkomst n. 340929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050 (2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116 (2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499 (2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017 (2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437 (2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101 (2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805 (2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204 (2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132 (2009).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 137 poly(di-methylsiloxane) dunne film composiet elastomeren huid lijmen adhesie celkweek
Dunne Film samengestelde Silicon elastomeren voor celkweek en huid toepassingen: productie- en karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L.,… More

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter