Summary
Här beskriver vi ett protokoll för en reproducerbar laser fånga lokalt (LCM) för att isolera trabekelverket (TM) för nedströms RNA analys. Förmågan att analysera förändringar i genuttryck i Översättningsminnet hjälp att förstå de bakomliggande molekylära mekanismerna för TM-relaterade ögonsjukdomar.
Abstract
Laser fånga lokalt (LCM) har tillåtet gen uttryck analys av enstaka celler och berikas cellpopulationer i vävnadssnitt. LCM är ett bra verktyg för studier av molekylära mekanismer bakom celldifferentiering och utveckling och progression av olika sjukdomar, inklusive glaukom. Glaukom, som består av en familj av progressiva fiberoptiska neuropatier, är den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet i världen. Strukturella förändringar och skador inom den trabekulära nätverket (TM) kan resultera i ökat intraokulärt tryck (IOP), som är en stor riskfaktor för att utveckla glaukom. Dock är de exakta molekylära mekanismerna som är inblandade fortfarande bristfällig. Förmågan att utföra gen uttryck analys kommer att vara avgörande att få ytterligare insikter om funktionen av dessa celler och dess roll i regleringen av IOP och glaukom utveckling. För att uppnå detta, berikad en reproducerbar metod för att isolera mycket TM från frusna snitt av mus ögon och en metod för nedströms gen uttryck analys, såsom RT-qPCR och RNA-Seq behövs. Den metod som beskrivs häri är utvecklat för att isolera högt rena TM från mus ögon för nedströms digital PCR och microarray analys. Dessutom, kan denna teknik enkelt anpassas för isolering av andra höganrikat okulär celler och cell fack som har varit svåra att isolera från mus ögon. Kombinationen av LCM och RNA analys kan bidra till en mer omfattande förståelse av de cellulära händelser underliggande glaukom.
Introduction
Glaukom är en grupp sjukdomar som kännetecknas av optikusneuropati och retinopati som i slutändan leder till irreversibel blindhet1,2. Det uppskattas att av 2020 över 70 miljoner människor världen över kommer att leva med någon form av sjukdom3,4,5,6,7. Primär öppenvinkelglaukom (POAG), den vanligaste typen av glaukom, kännetecknas av en minskning av kammarvatten (AH) utflöde leder till förhöjt intraokulärt tryck (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Vänster obehandlade, kroniskt förhöjt IOP leder till progressiv och oåterkalleliga skador på näthinnan och synnerven huvudet orsakar radiella blindhet1,2,19. Alla nuvarande metoder för att bromsa utvecklingen av glaukom fokus på att minska IOP, antingen genom att minska produktionstakten Ah av ciliarkroppen eller förbättra dess utflöde1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekelverket (TM) spelar en viktig roll i att aktivt reglera den primära AH utflöde vägen och dess felaktig funktion är en orsakande faktor för hypertensiva glaukom1,2,19. Dock de molekylära mekanismer som är associerad med TM dysfunktion och hur det reglerar AH dränering är ännu inte helt förstått och är för närvarande ett stort fokus på glaukom forskning1,2,19, 20. medan flera genome-wide associationsstudier (GWAS) har kopplat ett antal gener till glaukom och ökad motståndskraft mot AH utflöde anläggning vid TM, de exakta molekylära mekanismerna som leder till sjukdom inte är ännu förstått21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Djurmodeller har kraftigt förbättrat vår nuvarande kunskap om sjukdomsprogression vid glaukom (utförligt recenserade i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flera banbrytande metoder har utvecklats för att studera den TM34,35,36 och dessa metoder har använts i stor utsträckning att avancera vår nuvarande förståelse av normala och sjuk vävnad. Ett område som inte har undersökts i stor utsträckning är användningen av genetiskt modifierade musmodeller att studera molekylära mekanismer för TM misslyckande. Transgena inpressning och knock-out mus studier av TM associerade gener, såsom Myocilin (Myoc)37,38 och Cyp1b139, har varit den primära verktygen för att studera molekylära mekanismer för TM funktion. Förståeligt, den lilla storleken på TM i möss representerar ett allvarliga hinder som måste övervinnas för att börja studera denna vävnad. Musmodeller utgör ett kraftfullt verktyg för att studera genetik och molekylära mekanismer av sjukdom, medan framstegen i LCM teknik ger de nödvändiga verktygen för att ge studien av de minsta och mest känsliga vävnader, inklusive TM.
I betänkandet beskrivs en robust och reproducerbar metod för LCM av höganrikat TM från mus ögon tillsammans med efterföljande RNA isolering och förstärkning för nedströms uttryck analys. Liknande metoder har använts framgångsrikt i möss för att isolera andra typer av ögats vävnader40,41,42,43,44, den metod som rapporteras häri kan tillämpas på andra diskreta vävnaderna i ögat att studera RNA, mikroRNA, DNA och proteiner. Viktigast av allt, möjliggör denna teknik användning av genetiskt modifierade möss att bättre förstå de molekylära mekanismer av TM hos glaukom och okulär sjukdom3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Möjligheten att isolera TM mus ögon av LCM blir en användbar teknik att få ytterligare insikter om molekylära mekanismer för flera ögonsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) djur vård och användning kommittén (ACUC) godkände alla metodiken för denna studie under den NIEHS djur studera förslaget IIDL 05-46.
1. optimala vävnad samling för Laser lokalt
- Skaffa 2 till 3 månader gamla möss, manliga eller kvinnliga C57BL/6. Eutanasi med CO2 för minst 1 min eller tills andning har upphört. Ta bort djuret från buren och försäkra döden genom antingen cervikal dislokation, halshuggning eller torakotomi.
- Innan dissektion, kontrollera alla dissektion verktyg är rena och steriliserade.
Obs: För avlägsnande av ögonen böjd sax och pincett med tandad spets (program storlek: 0,5 x 0,4 mm) kommer att behövas. - Fastställa musen på en plan yta på sin sida så att ögat är lättillgängligt. Förstå på cantus (hörnet av ögat) med hjälp av tången att stabilisera musen, och sedan med böjd sax, inför kurvan från ögat, skär runt ögat med ögonhålan som en guide tills ögongloben kan enkelt tas ur uttaget (Använd kurvan inte den Tips av saxen).
- Dra försiktigt och med böjd sax, klippa på synnerven, som frigör ögat från orbital uttaget. Ta försiktigt bort icke-okulär vävnad från ögat och skölj 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa 1.3-1.4 för det kontralaterala ögat.
- Blot ögat med en vävnad torka bort eventuell fukt innan inbäddning. Placera ögat i preparatet mögel (25 x 20 x 5 mm3) så att linsen och synnerven är parallella med bänk för att få sagittal sektioner. Bädda in ögon i Optimal styckning temperatur (O.C.T.) sammansatta och placera på torris att frysa. När frysta, lagra block vid-80 ° C.
2. frysta avsnittet förberedelse för Laser lokalt
- Innan användning Inkubera polyetentereftalat (PET) glider membran i UV cross-linker vid maximal effekt för 45 min.
- Spray, RNase sanering lösning på borsten, pincett, koppling burkar och montera chuck. Torka noggrant. Skölj med nuclease-gratis vatten och torka. Torka av kryostaten med 100% etanol att undvika korskontaminering.
- Justera kryostaten till-18 ° C. Bort en fryst block från-80 ° C frys i taget och leverera till kryostaten med torris. Låt fryst block temperera med temperaturen av kryostaten i minst 10 min.
- Pressa en liten mängd O.C.T. på montering bit (figur 1A) och ta bort blocket vävnad från mögel och noggrant placera blocket på montering chucken (figur 1B). När vävnad block på montering chucken är frysta fast, infoga preparathållaren av kryostaten (figur 2A).
- Justera kryostaten för att skära 8 µm sektioner och noggrant avsnitt genom O.C.T. blocket för att nå vävnadsprov. När vävnad observeras, stoppa snittning, trimma de frysta block på alla sidor som använder en ren rakblad och lämna 3-4 mm av O.C.T. omgivande vävnaden att aktivera hantering med pensel (figur 2B). Använd en ny ren pensel istället för rulle plattan mellan varje prov förändring att korskontaminering av provet.
- Sektion genom ögat arbetar snabbt. Fläcken varje tredje avsnittet av översvämningar i bilden med en snabb one-step hematoxylin och eosin (H & E) fläcken för 60 s, skölj i rinnande vatten, lufttorka, klart i clearing agent och montera på en laddad glasskiva med ett täckglas. Visa under mikroskopet och fortsätta snittning tills TM är uppenbart i avsnitten skär.
- När TM börjar visas, klipp 2 sektioner och montera på en laddad glasskiva för rutin H & E färgning för att bilda en karta för kapning med LCM.
Obs: Se avsnitt 3 för karta och färgning Detaljer. - Efter första H & E karta slide, skära och rada upp 6 seriell 8 µm tjocka sektioner i kryostaten och samtidigt montera in i PET membran bilden (figur 3A, B). Följa vävnaden av kort glidande behandskade tummen längs baksidan av membranet. Efter montering placera PET membran bilden omedelbart i en bild box på torris.
Obs: Färre sektioner kan monteras, montera flera avsnitt in i bilden på en gång rekommenderas dock att minska RNA nedbrytning genom att begränsa mängden tid varje avsnitt utsätts för luftens temperatur. - Fortsätta att avsnitt ögat, efter varje två PET membran bilder med 6 sektioner varje, samla in två avsnitt på en laddad glasskiva till skapa en annan kartbild för H & E färgning. Fortsätt snittning, cirka 100 följetong 8 µm tjocka sektioner, tills TM inte längre synliga. Bekräfta genom att snabbt färgning ett avsnitt på en laddad glasskiva (se 2.6).
- Lagra alla PET membran bilder vid-80 ° C för senare LCM användning.
3. H & E kartbild färgning protokoll och morfologiska granskning
- För att visualisera och kartbilder på de laddade glasskivor, destillerat korrigera vävnaden genom att överföra omedelbart i en färgning burk fylld med 100 mL snabb fastställande lösning för 7 s. Skölj bilden genom att doppa den i vatten 10 - 20 gånger , sedan överföra bilden till en koppling burk med rent destillerat vatten.
- Ta bort bilden från vatten och läska torrt kanter med vävnad torka. Pipett 200 µL modified filtreras Harris Hematoxylin på varje avsnitt och inkubera i 30 s vid rumstemperatur. Skölj noga i bilden under rinnande vatten tills vattnet är klart. Blot slutet av bilden med en vävnad torka mellan varje steg (blot mellan varje steg från 3,2-3,5) för att ta bort överflödig vätska.
- Plats bilden i 1 x PBS i rumstemperatur i 30 s. Skölj noga i bilden under rinnande vatten för 30 s.
- Doppa i bilden 3 - 4 gånger i 95% etanol bad. Applicera tillräckligt Eosin Y dye lösning för att täcka vävnaden i bilden och inkubera i 15 s vid rumstemperatur.
- Skölj bilden i 95% etanol bad två gånger med 10-20 snabba dopp varje. Skölj bilden i 100% etanol bad två gånger med 10-20 snabba dopp varje. Sedan skölj bild två gånger i xylen bad (10-20 snabba dopp varje).
- Montera genom att tillämpa hartsartade monteringsmedium på vävnaden, lägga täckglas noggrant för att undvika luftbubblor och låt det torka i huven över natten.
- Granska H & E bilderna visuellt eller med hjälp av en digital diascanner. Identifiera kartbilder med TM tydligt synlig och tillgänglig för kapning. Använda PET membran diabilder mellan dessa karta diabilder för LCM.
4. polyeten polyetentereftalat (PET) membran glider bearbetning och färgning protokoll
- Innan borttagning PET bilder från Frys först förbereda tolyloxi violett stamlösning av upplösning 0,3 g tolyloxi violett acetat i 20 mL 75% etanol och placera på shaker för 2 h. Filter lösningen med 0,22 µm sterila filterenheten och förvaras vid 4 ° C längre än 6 mån THS.
- Förbereda eosin Y alkoholhaltiga lösningen med färska 75% etanol i förhållandet 1:4. Förbereda fixering (75% etanol) och uttorkning lösningar (75%, 95% och 100% etanol) i de rena, nuclease-fri, 50 mL koniska polypropylene rören på is. Lägg RNase Inhibitor till varje lösning.
- Ta bort bild rutan som innehåller frysta vävnadssnitt från-80 ° C frys och placera den på torris. Behandla en bild på gång. Fixa bilder genom att placera bilden omedelbart till kalla 75% etanol för 30 s.
- Försiktigt doppa bilden i nuclease-fritt vatten för 10-15 s att upplösa O.C.T. utan att störa vävnadssnitt.
- Noggrant Pipettera 300 µL av 1,5% tolyloxi violett Acetat lösning direkt på avsnitten och inkubera i 45 s vid rumstemperatur. Sedan tvätta en gång genom att placera den i 75% etanol bad 30 s. pipett 200 µL eosin Y lösning på avsnitten och Inkubera under 3-5 s.
- Torkar ut vävnad genom att placera bilden därefter i 75% etanol, 95% etanol och slutligen 100% etanol bad för 30 s varje. Blot slutet av bilden med en vävnad torka mellan varje steg för att ta bort överflödig vätska. Låt bilden lufttorka helt under huven i 5 min. När torr, utföra LCM omedelbart därefter.
Obs: Det rekommenderas att undvika användning av xylen för detta steg, det kan orsaka vävnadssnitt otillräckligt band till membran bild och minskar effektiviteten i vävnadsinfångning.
5. laser lokalt med UV-Laser
- Slå på datorn och låt boot. Slå på mikroskopet vita ljus strömförsörjningen. Aktivera nyckeln för UV-laser och en gul LED tänds. Starta programvaran LCM, tillåta att ladda fullt och en live video visas. Tryck på knappen laser på rutan controller och en gröna lysdioden tänds.
- Ladda en ny glasskiva till Mikroskop scenen, sedan placera PET membran bilden med den färgade vävnad sidan nedåt direkt på toppen av en glasskiva. Kontrollera att membranet och glasskiva paras tätt på Mikroskop scenen.
- Start LCM genom första bilden gränserna. Välj den lägsta 4 X förstoring i panelen objektiva (figur 4). Definiera sedan arbetsområdet av membran bilden genom att flytta Mikroskop xy-scenen tills det övre vänstra hörnet där metall och membran möts är synlig i den livevideo foder, tryck på knappen ”gräns 1” och en röd rektangel visas på färdplanen. Nästa, gå till xy-steg till det motsatta hörnet och tryck på knappen ”begränsa 2”. Tryck på ”scan” för att skapa en färdplan bild av membranet och vävnader mellan gränsvärdena.
- Dubbel klick nära TM ett av avsnitten ögat inom färdplanen, TM kan vara placerad nära spetsen av iridokorneal vinkel (bild 5A). När TM har identifierats, öka förstoringen till 10 X och manuellt fokus på TM. Upprepa med 20 X och 40 X mål. TM är i fokus med den 40 X-objektiv (figur 5B), navigera till ett tomt område i närheten (fokus kan behöva justeras något), Välj ”freehand drawing tool” och rita en lång rad på ett tomt område av vävnad.
- Ange parametrarna laser så att den ”skär velocity” är 34%, ”fokus” är 58% och ”power” är 70% (figur 4), tryck på knappen ”cut”. Gör fina laser justeringar till hastighet, fokus och power parametrar tills en klar och fin skärning linje observeras (se figur 5 c). Exaktkapning, för skärförloppet följer den ritade linjen.
- Ladda isolering tube locket i cap hållaren och öppna tuben. Tillmäter cap-hissen cap-hållaren och se till att röret är inverterad. Försäkra att självhäftande cap materialet sticker ut utanför spetsen av den gemensamma jordbrukspolitiken till att säkerställa att den önska vävnaden samlas ordentligt.
- Välj ”Manuell” dissektion läget i panelen programvara. Granska noggrant att TM (figur 5B) är direkt under isolering röret. Ställa in vitbalansen och justera ljusstyrkan för att få optimal bildkvalitet (figur 4).
- För att börja skära, manuellt justera fokus och dra en linje med verktyget frihand, vara säker på att den samling gemensamma jordbrukspolitiken förblir i uppfällt läge ännu inte röra membranet. Rita partiell cirklar nära där TM möter sklera (figur 5 c), tryck sedan på ”cut”. När de första nedskärningarna är gjort, placera locket i nedfällt läge och justera fokus, sedan rita två linjer i öppen eller fri utrymme att ansluta två partiella cirklar att fylla cirkeln runt TM, sedan tryck på ”cut” och samla vävnad från avsnitt , se till att TM plockades upp av lokalt locket (Bild 5 D-F).
- Placera locket i uppfällt läge och upprepa (5.2-5,8) på de återstående avsnitten. Justera något cap position så alla isolerade prover kommer att passa på den gemensamma jordbrukspolitiken och inte överlappar varandra (figur 5 g). För konsekvens är tidsfönstret för en bild 20 min. Använd färre sektioner per husdjur Skjut om mer tid behövs för att isolera TM från alla sektioner. För nästa PET membranet, infoga en ny isolering tube och repetera avsnitt 5.
6. Lys Microdissected TM vävnad
- Nymalen förbereda RNA lyseringsbuffert till lyse LCM isolerade vävnad. Tillsätt 10 µL β-merkaptoetanol till varje 1 mL lyseringsbuffert. Lagra lyseringsbuffert med β-merkaptoetanol i rumstemperatur längre än 1 månad.
- Ta bort isolering röret från cap innehavaren inom 20 min från början av lokalt. Visualisera cap ytan av ögat att säkerställa tillfångatagandet av TM.
- Noggrant Pipettera 10 μl lyseringsbuffert på locket av samling röret att säkerställa lyseringsbuffert helt täcker microdissected TM. Försiktigt stänga självhäftande cap och inkubera collection tube uppochner i rumstemperatur i 10 min. Efter inkubation, Centrifugera 800 x g i 2 min och placera lysate på torris. Lagra lysates vid-80 ° C för senare rening och analys.
7. RNA isolering och analys av kvalitet
- Analysera RNA kvaliteten genom upptining prover vid rumstemperatur. Pool tillsammans alla prover isolerade från en enda mus i ett RNase-fri 1,5 mL mikrofugrör.
Obs: till exempel för varje biologiska replikat, 10-12 rör med microdissected mössa i 10 µL lysate genererades och alla lysates överfördes till ett enda rör för varje biologiska replikat (100-120 µL lysate). - Lägga till en volym av nylagade 70% etanol (gjort med RNase-fritt vatten) i varje lysate lösning. Sedan, rena total-RNA efter RNA isolering kit i bruksanvisningen. Se till att borttagning av genomisk DNA från varje RNA-prov.
Obs: Genomiskt DNA kan störa nedströms RNA analys. - Mäta kvaliteten på RNA isoleras från TM genom att samla ihop prover från varje mus och analysera ribosomalt RNA integritet (figur 6A).
Obs: På grund av den lilla storleken på TM, ribosomalt RNA toppar inte vara observerbara (figur 6B) i RNA kvalitet profilen (två toppar observerats mellan 1000-4000 bp i figur 6A, C) som används för att beräkna antalet RNA integritet (RIN) 47.- Få ett mer exakt mått på RNA integritet genom att isolera RNA från rikligare återstående vävnaden i membran bilden. För att få en representant RIN, isolera RNA från okulär-vävnaden i membran bilden av pipettering 10 µL lysis buffert på en vävnad avsnitt och utföra RNA isolering. Analysera RNA kvalitet och beräkna RIN (figur 6 c).
- För nedströms RNA applikationer isolerade använda en låg ingång RNA kit för sekvensering och cDNA bibliotek generation ge reproducerbara resultat från så lite som 80 delar av LCM TM.
8. analys
- Kontrollera att den vävnad som samlats in i själva verket är berikad i TM-associerade gener genom att samla in flera ytterligare RNA från microdissected hela ögat, sklera, iris, näthinnan, hornhinnan och linsen från 3 separata möss. Använd denna RNA i kombination med LCM samlat RNA från isolerade TM och ciliary kropp samlas in från 4 separata möss.
- Konvertera RNA microdissected prover var till cDNA med en cDNA omvänd Transkription kit. Förstärk RNA från LCM isolerade prover och konvertera till cDNA med en låg input RNA till cDNA kit.
- Analysera alla RNA för trabekelverket uttrycker gener, myocilin (MYOC) och alpha-aktin-2 (ACTA2), och normalisera använder genen HSP90a1 städning av digital PCR (figur 7A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM samlas RNA från TM och ciliarkroppen från 4 olika möss var isolerad för att kunna analysera genuttryck och jämföra uttrycket med det i hela ögat, sklera, iris, näthinnan, hornhinnan och linsen isolerade från tre separata möss. TM uttrycker gener, analyserades MYOC48 och ACTA249 i alla insamlade vävnader att bekräfta att de isolera TM proverna var verkligen höganrikat i TM. På grund av den extremt låga mängden cDNA LCM prover användes digital PCR, vilket har bevisats vara mer reproducerbar med mindre material50. Uttryck för MYOC och ACTA2 var normaliserade använder genen HSP90a1 städning, sedan varje vävnad var jämfört med det hela ögats. Dessa resultat visar att MYOC (figur 7A) och ACTA2 (figur 7B) mycket uttrycks i TM prover, bekräftar den framgångsrika isoleringen av hög kvalitet RNA höganrikat TM prover för nedströms RNA analys. Som proof of concept användes denna teknik för TM-isolerade RNA beredd från WT möss och från en stam av möss med ett förhöjt IOP-fenotyp och analyseras av microarray. Denna analys identifierat många gener inblandade i glaukom som uttrycks differentially mellan TM av WT möss och möss med glaukom fenotypen (figur 7 c).
Figur 1: placering av fryst vävnad blockera i kryostaten. (A) O.C.T monteringsmedium tillämpas kryostaten montering bit. (B) frysta preparatsegment placeras jämnt på montering chucken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: snittning tillvägagångssättet av frysta ögat vävnad i kryostaten. (A) beredning av skärytan att nå ögat vävnad. (B) trimma O.C.T. av frysta block innan du samlar in avsnitt för laser lokalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förberedelse av frusna snitt i kryostaten. (A) 6 seriell 8 µm tjocka sektioner är uppradade i kryostaten. (B) avsnitt monteras samtidigt i PET membran bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: skärmdump av laser lokalt programvara belysa viktiga funktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: placering av trabekelverket och UV laser parameterinställningar för ordentlig isolering av trabekelverket. (A) låg (4 X) förstoring av ett enda avsnitt på PET membranet belyser det trabekulära nätverket för laser lokalt. (B) High (X 40) förstoring av trabekelverket och angränsande vävnader. (C) första partiella cirkel styckningsdelar av TM nära regionen skleral med locket i uppfällt läge. (D) Final nedskärningar i det lediga utrymme som Fyll cirkeln runt TM med locket i nedfällt läge. (E) TM tas bort från avsnittet och (F) kopplade till den gemensamma jordbrukspolitiken. (G) flera skär avsnitt klipp från samma PET membranet inte överlappande klibbade till den gemensamma jordbrukspolitiken. S (sklera), SC (Schlemm's Canal), TM (trabekelverket), AC (främre kammaren). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Total-RNA avkastning och kvalitet uppskattning erhålls från microdissected trabekelverket vävnad. (A) Total-RNA från 80 delar av trabekelverket (tillnärmade området storlek var 0,8 mm2). (B) Total-RNA från 20 sektioner av trabekelverket (tillnärmade området storlek var 0,2 mm2). (C) Total-RNA från återstående ögat vävnad efter laser lokalt. RIN, RNA integritet nummer; BP, baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: nedströms RNA analys av LCM isolerade trabekelverket. Kvantitativa digital PCR-analys av TM-associerade gener i TM isolerat av LCM. TM-associerade gener (A) MYOC (B) ACTA2 starkt uttryckt i LCM fångat TM prover jämfört med andra ögat vävnader. (C) Heatmap genereras från data som erhållits från microarray analys av trabekelverket RNA isoleras från WT möss och KO möss med ett förhöjt IOP-fenotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: jämförelse av vävnad förberedelse före och efter optimering. Ögat avsnitt skär och placeras på PET membran bilder antingen med (A) standard 95% etanol uttorkning beredning (B) eller optimerad 75% etanol uttorkning förberedelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TM spelar en viktig roll i att aktivt bibehålla homeostatiska IOP och dess dysfunktion är allmänt accepterat som den viktigaste orsakande faktorn för hypertensiva glaukom1,2,19. Ett antal enda nukleotid polymorfismer i flera gener identifierats GWAS analys har kopplats till ökad glaukom risk och ökat motstånd mot AH utflöde anläggning vid TM; dock är de exakta molekylära mekanismer som ger upphov till denna sjukdom ännu inte helt förstått21,22,23,24,25. Genetiska musmodeller kan ge ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära mekanismer för glaukom. Men representerar den lilla storleken på mus TM vävnad en formidabel utmaning för isolering av höganrikat TM från mus ögon och hög kvalitet RNA för gen uttryck analys. LCM är en värdefull teknik för att isolera ett enda eller lågt antal celler och kan användas för att studera genuttryck i vävnadsprover berikad för specifika celltyper. I denna studie beskrivs en robust och reproducerbara LCM metod att isolera höganrikat TM och högkvalitativa RNA som kan användas för att studera reglering av genuttryck och cell signalering i Översättningsminnet. Dessutom kan den beskrivna LCM-metoden också tillämpas på andra vävnader i ögat.
LCM-teknik och en hög uppmärksamhet på Detaljer för optimering av vävnad hantering spelade en viktig roll i en framgångsrik utveckling av denna metod. Methodologyen av vävnad bevarande och isolering är en nyckelkomponent i isolera högkvalitativa RNA för profilering av gen-uttryck. LCM kräver en mycket hög uppmärksamhet på detaljer i dissekera, kryosnitt, fixering, färgning, dehydrering och varaktighet för laser lokalt ska lyckas att få kvalitet RNA51. Vävnaden snittjockleken kan ökas; men tjockleken ökar så UV laser kraft som behövs. Ökade laser power resultat i en bredare laser-sökväg som kan orsaka RNA nedbrytning. Det konstaterades att laser sökvägen med 8 µm avsnitt var tunn och tillhandahålls tillräckligt vävnad för nedströms RNA analys. Figur 8 visar hur optimering av vävnad preparatet kan drastiskt förändra förmågan att laser dissekera TM från ögat. Optimering av detta steg i protokollet (som beskrivs i avsnitt 4) gav överlägsna okulär-vävnad immobilisering och fullständig borttagning av O.C.T. (figur 8B) genom att bara använda 75% istället för 95-procentig etanol (figur 8A) för att torka vävnaden följt av inkubation i RNase-fritt vatten för att avlägsna montering media. Ytterligare uttorkning och färgning uppnås genom att använda alkoholbaserad färgning reagenser. Dessutom konstaterades det att alkoholbaserade färgning reagenser gav superior resultat i förhållande till vattenhaltiga färgning reagenser (vattenbaserad tolyloxi violett eller hematoxylin) och ytterligare hjälper till att bevara RNA integritet52. Sammantaget bearbetning okulära vävnader med hjälp av optimerad protokollet med alkoholbaserade färgning reagenser gav konsekvent okulär-vävnadssnitt som var helt orörlig i PET membran bilden.
Vårt mål för denna studie var att utveckla en robust och pålitlig metod för att isolera högkvalitativa mRNA från TM mus ögon för nedströms uttryck analys för att få insikter om de molekylära mekanismer som ligger bakom förhöjt IOP och glaukom. I heatmap i figur 7 cvisas beskrivna protokollet av isolerande TM av LCM ger en mycket tillförlitlig metod för att isolera RNA från TM och studera skillnader i genuttryck i TM från vildtyp och muterade möss. Den metod som beskrivs häri gör att utredarna att utföra molekylär analys på en vävnad som är centrala för patogenesen av glaukom i ett in vivo -system som är relativt lätt och pålitlig och kan tillämpas på gen uttryck analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
