Summary
Her, beskriver vi en protokol for en reproducerbar laser fange microdissection (LCM) til isolering af trabekelværket (TM) for downstream RNA analyse. Evnen til at analysere ændringer i genekspression i TM vil hjælpe med at forstå de underliggende molekylære mekanismer af TM-okulær sygdomme.
Abstract
Laser fange microdissection (LCM) har tilladt gen expression analyse af enkelt celler og beriget cellepopulationer i væv sektioner. LCM er et fantastisk værktøj for studier af de molekylære mekanismer bag Celledifferentiering og udvikling og progression af forskellige sygdomme, herunder glaukom. Glaukom, som består af en familie af progressive optic neuropatier, er den mest almindelige årsag til uoprettelige blindhed på verdensplan. Strukturelle ændringer og skader inden for trabekelværket (TM) kan resultere i øget intraokulært tryk (IOP), som er en stor risikofaktor for at udvikle grøn stær. De præcise molekylære mekanismer involveret er dog stadig dårligt forstået. Evnen til at udføre gen expression analyse vil være afgørende for at opnå yderligere indsigt i funktionen af disse celler og dens rolle i reguleringen af IOP og glaukom udvikling. For at opnå dette, beriget en reproducerbar metode til isolering af stærkt TM fra frosne dele af mus øjne og en metode for downstream gen expression analyse, som RT-qPCR og RNA-Seq er nødvendig. Den metode beskrevet heri er udviklet for at isolere meget ren TM fra mus øjne for downstream digital PCR og microarray analyse. Derudover kan denne teknik være let tilpasses til isolation af andre højt beriget okulær celler og celle rum, der har været vanskelige at isolere fra mus øjne. Kombinationen af LCM og RNA analyser kan bidrage til en mere omfattende forståelse af de cellulære begivenheder underliggende glaukom.
Introduction
Glaukom er en gruppe af sygdomme karakteriseret ved optisk neuropati og retinopati, der i sidste ende fører til uoprettelige blindhed1,2. Skønsmæssigt vil leve med en form for sygdom3,4,5,6,7af 2020 over 70 millioner mennesker verden over. Primær åbenvinklet glaukom (POAG), den mest udbredte type af glaukom, er karakteriseret ved et fald i vandige humor (AH) udstrømning fører til øget intraokulært tryk (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Venstre ubehandlet, kronisk forhøjet IOP fører til progressiv og irreversible skader på nethinden og synsnerven hoved forårsager radial blindhed1,2,19. Alle nuværende metoder til at bremse progression af glaukom fokus på at reducere IOP, enten ved at reducere satsen for produktionen af AH af ciliare eller forbedre det udstrømning1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekelværket (TM) spiller en afgørende rolle i aktivt regulere den primære AH udstrømning pathway og dens forkert funktion er en udløsende faktor for hypertensive glaukom1,2,19. Men de molekylære mekanismer forbundet med TM dysfunktion og hvordan det regulerer AH dræning er endnu ikke fuldt forstået og er i øjeblikket en større fokus på glaukom research1,2,19, 20. mens flere genome-wide association studier (GWAS) har knyttet en række gener til grøn stær og øget modstand mod AH udstrømning facilitet på TM, de præcise molekylære mekanismer, der fører til sygdommen ikke er endnu fuldt ud forstået21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Dyremodeller har styrket vores nuværende viden om sygdomsprogression i glaukom (grundigt gennemgået i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flere banebrydende metoder er blevet udviklet for at studere TM34,35,36 , og disse metoder har været meget anvendt til at fremme vores nuværende forståelse af normale og syge væv. Et område, der ikke er blevet grundigt udforsket er brugen af genetisk modificerede musemodeller at studere de molekylære mekanismer af TM fiasko. Transgene knock-i og knock-out mus undersøgelser af TM forbundet gener, som Myocilin (Myoc)37,38 og Cyp1b139, har været de primære værktøjer til at studere de molekylære mekanismer af TM funktion. Forståeligt nok, den lille størrelse af TM i mus repræsenterer en alvorlig forhindring, der skal overvindes for at begynde at studere dette væv. Musemodeller repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge genetik og molekylære mekanismer af sygdommen, mens fremskridt i LCM teknologier give de nødvendige værktøjer for at give studiet af de mindste og mest delikate væv, herunder TM.
I denne betænkning, er en robust og reproducerbar metode beskrevet for LCM af højt beriget TM fra mus øjne sammen med efterfølgende RNA isolering og forstærkning for downstream udtryk analyse. Lignende metoder har været anvendt med succes i mus for at isolere andre typer af øjet væv40,41,42,43,44, metoden rapporteret heri kan anvendes til andre diskrete væv af øjet til at studere RNA, mikroRNA, DNA og proteiner. Vigtigst, denne teknik giver mulighed for brug af genmodificerede mus til bedre at forstå de molekylære patogenese af TM værdiforringelse i glaukom og okulær sygdomme3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Evnen til at isolere TM mus øjne af LCM vil være en nyttig teknik i at opnå yderligere indsigt i de molekylære mekanismer af flere okulær sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care og skik udvalg (ACUC) godkendt alle metoden i dette studie under NIEHS dyr studere forslag IIDL 05-46.
1. optimal væv indsamling til Laser Microdissection
- Få 2 til 3-måned-forhenværende mus, mandlige eller kvindelige C57BL/6. Aflive med CO2 for mindst 1 min eller indtil respiration er ophørt. Fjerne dyret fra buret og forsikre død af cervikal dislokation, halshugning eller torakotomi.
- Før dissektion, sikre alle dissektion værktøjer er rene og steriliseret.
Bemærk: For fjernelse af øjnene buet saks og pincet med savtakket spids (foretrukket tip størrelse: 0,5 x 0,4 mm) vil være behov for. - Lægge musen på en flad overflade på sin side, så at øjet er let tilgængelige. Gribe ind på øjenkrog (hjørnet af øjet) med pincet til at stabilisere musen, derefter ved hjælp af buet saks, vender kurven væk fra øjet, skæres omkring øjet ved hjælp af øjenhulen som vejledning indtil øjeæblet kan nemt tages fra stikket (brug kurven ikke den spidsen af saksen).
- Træk forsigtigt, og ved hjælp af buet saks, klippe synsnerven, som frigiver øjet fra den orbital socket. Forsigtigt fjerne ikke-okulær væv fra øjet og skyl i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Gentag 1.3-1.4 for de kontralaterale øje.
- DUP øjet med en væv tørre at fjerne eventuel fugt før indlejring. Placer øjet ind i modellen form (25 x 20 x 5 mm3), så linsen og synsnerven er parallelle til bænk toppen for at opnå sagittal sektioner. Integrere øjne i Optimal opskæring temperatur (O.C.T.) sammensatte og placere på tøris til at fryse. Når frosne, gemme kodeblokke ved-80 ° C.
2. frosne sektion forberedelse til Laser Microdissection
- Før brug Inkuber polyethylenterephthalat (PET) dias membran i UV tværs linker ved maksimal effekt i 45 min.
- Spray RNase dekontaminering løsning på pensel, pincet, kobling krukker, og montering af chuck. Tør grundigt. Skyl med nukleasen-gratis vand og tør. Tør ned kryostaten med 100% ethanol til at undgå krydskontaminering.
- Justere kryostaterne til – 18 ° C. Fjerne en frossen blok fra-80 ° C fryser på et tidspunkt og levere til kryostaten med tøris. Tillad frosne blok til Reagensglasset med temperatur af kryostaterne i mindst 10 min.
- Klem en lille mængde af O.C.T. til montering chunk (figur 1A) og fjern væv blok fra formen og omhyggeligt placere blokken på montering chuck (figur 1B). Når væv blok på montering chuck er frosset fast, Indsæt præparatholderen af kryostaterne (figur 2A).
- Justere kryostaten for at skære 8 µm sektioner og omhyggeligt sektion gennem O.C.T. blok til at nå vævsprøve. Når vævet er observeret, stop skæring, trim de frosne blokke på alle sider ved hjælp af en ren barberblad og efterlade 3-4 mm af O.C.T. omkringliggende væv til at aktivere håndtering med pensel (figur 2B). Bruge en ny ren malerpensel i stedet for roll plade mellem hver prøve ændring at undgå prøve krydskontaminering.
- Afsnit gennem øjet arbejder hurtigt. Pletten hver tredje afsnit af oversvømmelser dias med en hurtig et-trins hæmatoxylin og eosin (H & E) pletten for 60 s, skylles med vand fra hanen, lufttørre, klart i clearing agent og montere på et opladet glas dias med en coverslip. Se under mikroskop og fortsætte skæreprocessen indtil TM er indlysende i afsnittene cut.
- Når TM begynder at dukke op, skær 2 sektioner og mount diaset en opladet glas for rutine H & E farvning for at danne et kort til at skære med LCM.
Bemærk: Se punkt 3 for kort og farvning detaljer. - Efter den første H & E kort dias, skære og line op 6 serie 8 µm tykt afsnit i kryostater og samtidig mount diaset den PET membran (figur 3A, B). Overholde væv af kortvarigt glidende behandskede tommelfingeren langs bagsiden af membranen. Efter montering, placere PET membran dias straks i et dias boks på tøris.
Bemærk: Færre sektioner kan monteres, men montering flere sektioner i diaset på én gang anbefales at reducere RNA nedbrydning ved at begrænse mængden tid hver sektion er udsat for luften stuetemperatur. - Fortsætte til afsnit øjet, efter hver to PET membran dias med 6 afsnit hver, indsamle to sektioner på en opladet glas dias til at oprette et andet kort dias for H & E farvning. Fortsætte skæreprocessen, ca 100 serie 8 µm tykt sektioner, indtil TM er ikke længere synlig. Bekræft ved hurtigt farvning én sektion på en opladet glas dias (Se 2.6).
- Gemme alle PET membran dias ved-80 ° C til senere LCM brug.
3. H & E kort dias farvning protokol og morfologiske anmeldelse
- For at visualisere og anmeld kort dias på ladet glas lysbilleder, destilleret fix væv ved at overføre straks i en farvnings-krukke fyldt med 100 mL af hurtig fastsættelse for 7 s. Skyl diasset ved at dyppe det i vand 10 - 20 gange , derefter overføre diasset til en kobling krukke med ren destilleret vand.
- Fjerne diasset fra vand og dup tør kanter med væv tørre. Pipette 200 µL ændret filtreret Harris Hematoxylin på hver sektion og Inkuber i 30 s ved stuetemperatur. Omhyggeligt skyl dias under rindende vand, indtil vandet løber klar. Dup enden af dias med en væv tørre mellem hvert trin (skamplet mellem hvert trin fra 3.2-3.5) for at fjerne overskydende væske.
- Sted dias i 1 x PBS ved stuetemperatur i 30 s. Derefter skylles omhyggeligt dias under rindende vand for 30 s.
- Dyp dias 3 - 4 gange i 95% ethanol bad. Anvende nok Eosin Y farvestof løsning for at dække væv på diaset og Inkuber i 15 s ved stuetemperatur.
- Skyl diaset i 95% ethanol bad to gange med 10-20 hurtig dips hver. Skyl diaset i 100% ethanol bad to gange med 10-20 hurtig dips hver. Skyl derefter, dias to gange i xylen bad (10-20 hurtig dips hver).
- Montere ved at anvende harpiksholdige montering medium til vævet, tilføje coverslip omhyggeligt for at undgå luftbobler og lad det tørre i hætten natten over.
- Anmeld H & E dias, visuelt eller ved hjælp af en digital dias scanner. Identificere kort dias med TM klart synligt og let tilgængeligt for skæring. Bruge PET membran dias mellem disse kort dias til LCM'EN.
4. polyethylen polyethylenterephthalatfolie (PET) membran glider forarbejdning og farvning protokol
- Før fjernelse PET dias fra fryseren først forberede cresyl violet stamopløsning ved at opløse 0,3 g cresyl violet acetat i 20 mL af 75% ethanol og sted på shaker til 2 h. Filter løsning med 0,22 µm sterile filterenhed og opbevares ved 4 ° C i længere end 6 mon ths.
- Forberede eosin Y alkoholholdige løsning med friske 75% ethanol i forholdet 1:4. Forberede fiksering (75% ethanol) og dehydrering løsninger (75%, 95% og 100% ethanol) i ren, nukleasen-fri, 50 mL konisk polypropylen rør på is. Tilføje RNase-hæmmer til hver løsning.
- Fjerne boksen dias, der indeholder frosne væv sektioner fra-80 ° C fryser og anbringes på tøris. Behandle ét dias på tid. Fix dias ved at placere dias straks i koldt 75% ethanol til 30 s.
- Forsigtigt dyppe dias i nukleasen-gratis vand for 10-15 s til at opløse O.C.T. uden at forstyrre afsnittene væv.
- Omhyggeligt Tilsæt 300 µL af 1,5% cresyl violet acetat løsning direkte på afsnittene og Inkuber i 45 s ved stuetemperatur. Derefter vaskes en gang ved at placere det i 75% ethanol bad for 30 s. Pipette 200 µL eosin Y løsning på afsnittene og Inkuber i 3-5 s.
- Dehydrere væv ved at placere lysbillede efterfølgende i 75% ethanol, 95% ethanol, og endelig, 100% ethanol bad for 30 s hver. Dup enden af dias med en væv tørre mellem hver skridt til at fjerne overskydende væske. Lad slide lufttørre helt ind under hood i 5 min. Når tør, udføre LCM umiddelbart derefter.
Bemærk: Det anbefales at undgå brugen af xylen til dette trin, det kan forårsage væv sektioner til utilstrækkeligt obligation til diasset membran og mindsker effektiviteten af væv capture.
5. laser Microdissection med UV-Laser
- Tænd computeren og lad boot. Tænde mikroskopet hvide lys strømforsyning. Slå tasten UV laser og en gul LED lyser. Start LCM software, giver mulighed for at indlæse fuldt og en live video vises. Tryk på laser-knappen på boksen controller og en grøn LED lyser.
- Indlæse et nyt glas dias på mikroskop-scenen, og derefter placere PET membran dias med farvede væv side vender nedad direkte på toppen af glas dias. Sørg for, at membranen og glas dias er parret tæt på stadiet mikroskop.
- Start LCM'EN ved først at slide grænser. Vælg de laveste 4 X forstørrelse i panelet objektiv (figur 4). Derefter definere arbejdsområdet på membran dias ved at flytte mikroskoper xy-trin indtil den øverste venstre hjørne, hvor metal og membran mødes er synlige i live video feed, tryk på knappen "Limit 1" og en rød rektangel vises på køreplanen. Næste, gå til xy-fase til det modsatte hjørne og tryk på knappen "begrænse 2". Tryk på knappen "scan" for at skabe en køreplan image af membranen og væv mellem de fastsatte grænser.
- Dobbeltklik på nær TM af en af sektionerne øje i køreplanen, TM kan være i nærheden af toppen af iridocorneal vinklen (figur 5A). Når TM er blevet identificeret, øge forstørrelsen til 10 X og manuelt fokus på TM. Gentag med 20 X og 40 X mål. Når TM er i fokus med den 40 X mål (figur 5B), navigere til et tomt område i nærheden (fokus skal måske justeres lidt), Vælg "freehand affattelse værktøj" og tegne en lang linje på et tomt område af væv.
- Angive parametrene laser, så den "cut velocity" er 34%, "fokus" er 58%, og "magt" er 70% (figur 4), og tryk på knappen "cut". Gøre fine laser justeringer til hastighed, fokus og magt parametre, indtil en klar og fine skæring linje er observeret (Se figur 5 c). Præcis skæring, sikre skæreforløb følger den tegnede linje.
- Indlæse isolering tube låg til indehaveren af den fælles landbrugspolitik og åbne tuben. Tillægger cap-lift cap-indehaveren og sørg for, at røret er inverteret. Sikre, at den klæbende cap materiale rager ud over spidsen af hætten til at sikre, at den ønskede væv er korrekt fanget.
- Vælg "Manuel" dissektion tilstand i panelet software. Nøje gennemgå at TM (figur 5B) er direkte under isolering tube. Indstille hvidbalancen og justere lysstyrken for at opnå optimal billedkvalitet (figur 4).
- For at begynde at skære, manuelt justere fokus og trække en linje ved hjælp af værktøjet frihånd, være sikker på, at samling cap forbliver i op-position endnu ikke rører membranen. Draw delvis kredse nær hvor TM møder sclera (figur 5 c), tryk derefter på "klip". Når de første nedskæringer er færdig, placere fælles landbrugspolitik i sænket stilling og re-justere fokus og derefter tegne to linjer i den åbne eller gratis plads til at forbinde de to delvise cirkler at udfylde cirklen rundt TM, så tryk på "cut" og indsamle væv fra sektionen , sikre at TM blev afhentet af microdissection cap (Fig. 5 D-F).
- Placer hætten tilbage i op-position og Gentag (5,2-5,8) på de resterende sektioner. Lidt justere positionen cap, så alle isolerede prøverne vil passe på fælles landbrugspolitik og ikke overlapper hinanden (figur 5 g). For konsistens er tidsvindue for ét dias 20 min. Brug færre dele per kæledyr skub hvis er behov for mere tid til at isolere TM fra alle sektioner. For den næste PET membran, indsætte en ny isolering tube og gentage afsnit 5.
6. lysering af Microdissected TM væv
- Frisk forberede RNA lysisbuffer til lyse LCM isoleret væv. Tilføje 10 µL β-mercaptoethanol til hver 1 mL af lysisbuffer. Gemme lysisbuffer med β-mercaptoethanol ved stuetemperatur i længere end 1 måned.
- Fjerne isolering tuben fra cap indehaveren inden for 20 min fra starten af microdissection. Visualisere cap overfladen af øjet at sikre erobringen af TM.
- Omhyggeligt afpipetteres 10 µL lysisbuffer på låget af collection tube sikrer lysisbuffer fuldstændig dækker microdissected TM. Forsigtigt lukke klæbende cap og inkuberes collection tube hovedet ved stuetemperatur i 10 min. Efter inkubationen centrifugeres ved 800 x g i 2 min. og placere lysate på tøris. Gemme lysates på-80 ° C for senere oprensning og analyse.
7. RNA isolering og analyse af kvalitet
- Analysere RNA kvalitet ved optøning prøverne ved stuetemperatur. Pool sammen alle prøver isoleret fra en enkelt mus i én RNase-fri 1,5 mL mikrofuge rør.
Bemærk: For eksempel, for hver biologiske replikeres, 10-12 rør med microdissected caps i 10 µL lysate blev genereret og alle lysates blev overført til et enkelt rør for hver biologiske replikat (100-120 µL lysate). - Tilføje et volumen af frisklavede 70% ethanol (lavet med RNase-fri vand) til hver lysate løsning. Derefter, rense total RNA efter RNA isolering kit bruger retningslinjer. Sikre fjernelse af genomisk DNA fra hver RNA prøve.
Bemærk: Genomisk DNA kan interferere med downstream RNA analyse. - Måle kvaliteten af RNA isoleret fra TM ved at samle sammen prøver fra hver mus og analysere de ribosomale RNA integritet (figur 6A).
Bemærk: På grund af den lille størrelse af TM, ribosomale RNA toppe kan være observerbare (fig. 6B) på RNA kvalitet profil (to toppe observeret mellem 1.000-4.000 bp i figur 6A, C) som bruges til at beregne RNA integritet nummer (RIN) 47.- Få en mere nøjagtig måling af RNA integritet ved at isolere RNA fra det mere rigelige resterende væv på diasset membran. For at få en repræsentant RIN, isoleres RNA fra okulær-væv på diasset membran af pipettering 10 µL lysis buffer på en væv sektion og udføre RNA isolering. Analysere RNA kvalitet og beregne RIN (figur 6 c).
- Til downstream RNA applikationer isoleret brug en lav input RNA kit til sekvensering og cDNA bibliotek generation at give reproducerbare resultater fra så lidt som 80 dele af LCM TM.
8. analyse
- For at kontrollere at vævet indsamlet er faktisk beriget i TM-associerede gener, indsamle flere ekstra RNA fra microdissected hele øjet, sclera, iris, nethinden, hornhinden og linsen fra 3 separate mus. Brug denne RNA i kombination med LCM indsamlet RNA fra isoleret TM og ciliaere organ indsamlet fra 4 separate mus.
- Konverter RNA fra microdissected prøver var til cDNA ved hjælp af en cDNA reverse transkription kit. Forstærke RNA fra LCM isoleret prøver og konvertere til cDNA ved hjælp af en lav input RNA til cDNA kit.
- Analysere alle RNA for trabekelværket giver udtryk for gener, myocilin (MYOC) og alpha-actin-2 (ACTA2), og normalisere ved hjælp af HSP90a1 husholdning gen af digital PCR (figur 7A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM indsamlet RNA fra TM og corpus ciliare fra 4 forskellige mus blev isoleret for at kunne analysere genekspression og sammenligne udtryk med det i hele øjet, sclera, iris, nethinden, hornhinden og linsen isoleret fra tre separate mus. TM giver udtryk for gener, blev MYOC48 og ACTA249 analyseret i alt indsamlet væv til at bekræfte, at de isolerede TM prøver var stærkt beriget i TM. På grund af den ekstremt lave mængden af cDNA fra LCM prøver blev digital PCR brugt, som har vist sig for at være mere reproducerbare med mindre materiale50. Udtryk for MYOC og ACTA2 var normaliseret, ved hjælp af HSP90a1 husholdning gen, så hver væv blev sammenlignet med hele øjet. Disse resultater viser, at MYOC (figur 7A) og ACTA2 (figur 7B) er stærkt udtrykt i TM prøver, bekræfter den succesfulde isolation af høj kvalitet RNA fra de yderst højberiget TM prøver for downstream RNA analyse. Som proof of concept, blev denne teknik anvendt til den TM-isolerede RNA forberedt fra WT mus og fra en stamme af mus med en forhøjet IOP fænotype og analyseret af microarray. Denne analyse konstateret mange gener involveret i grøn stær, der udtrykkes varierende mellem TM af WT mus og mus med glaukom fænotype (figur 7C).
Figur 1: placering af frossen væv blokere i kryostaterne. (A) O.C.T montering medium er anvendt til kryostaten montering luns. (B) frosne modellen blok placeres jævnt på montering chuck. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skæring procedure af frosne øjet væv i kryostaterne. (A) forberedelse af skærefladen at nå øjet væv. (B) trimning O.C.T. af den frosne blok før indsamling sektioner for laser microdissection. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forberedelse af frosne sektioner i kryostaterne. (A) 6 serie 8 µm tykt afsnit er linet op i kryostaterne. (B) afsnittene er samtidigt monteret på PET membran dias. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Screenshot af laser microdissection software fremhæve vigtige funktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: placering af trabekelværket og UV laser parameterindstillinger for ordentlig isolering af trabekelværket. (A) lav (4 X) forstørrelse af et enkelt afsnit på PET membranen fremhæve trabekelværket for laser microdissection. (B) høj (40 X) forstørrelse af trabekelværket og tilstødende væv. (C) første delvis cirkel skærer af TM nær scleral regionen med fælles landbrugspolitik i op-position. (D) afsluttende nedskæringer i det frie rum, der fuldføre cirklen rundt TM med fælles landbrugspolitik i sænket position. (E) TM fjernes fra sektionen og (F) er knyttet til fælles landbrugspolitik. (G) flere snit sektioner skåret fra samme PET membranen ikke overlappende overholdt den fælles landbrugspolitik. S (Sclera), SC (Schlemm's Canal), TM (trabekelværket), AC (forreste kammer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Total RNA udbytte og kvalitet vurdering opnået fra microdissected trabekelværket væv. (A) samlede RNA fra 80 dele af trabekelværket (tilnærmet område størrelse var 0,8 mm2). (B) samlede RNA fra 20 dele af trabekelværket (tilnærmet område størrelse var 0,2 mm2). (C) Total RNA fra resterende øjet væv efter laser microdissection. RIN, RNA integritet antallet; BP, basepar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Downstream RNA analyse af LCM isoleret trabekelværket. Kvantitative digital PCR analyse af TM-associerede gener i TM isoleret af LCM. De TM-associerede gener (A) MYOC (B) ACTA2 stærkt udtrykt i LCM'EN fanget TM prøver i forhold til andre øjet væv. (C) Heatmap genereret fra data indhentet fra microarray analyse af trabekelværket RNA isoleret fra WT mus og KO mus med en forhøjet IOP fænotype. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: sammenligning af væv forberedelse før og efter optimering. Øjet sektioner skåret og placeret på PET membran dias enten med (A) standard 95% ethanol dehydrering forberedelse (B) eller optimeret 75% ethanol dehydrering forberedelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TM spiller en afgørende rolle i aktivt opretholde homeostatiske IOP og dens dysfunktion er bredt accepteret som den vigtigste udløsende faktor for hypertensive glaukom1,2,19. En række enkelt nucleotid polymorfier i flere gener identificeret ved GWAS analyse har været knyttet til øget glaukom risiko og øget modstand mod AH udstrømning facilitet på TM; de præcise molekylære mekanismer, der giver anledning til denne sygdom er dog ikke endnu fuldt ud forstået21,22,23,24,25. Genetiske musemodeller kan levere et kraftfuldt værktøj til at studere de molekylære mekanismer af glaukom. Men den lille størrelse af musen TM væv repræsenterer en enorm udfordring for isolation af højt beriget TM fra mus øjne og høj kvalitet RNA for gen expression analyse. LCM er en værdifuld teknik til at isolere et enkelt eller lavt antal celler og kan bruges til at studere genekspression i vævsprøver beriget til bestemte celletyper. I denne undersøgelse er en robust og reproducerbare LCM metode beskrevet at isolere højtberiget TM og høj kvalitet RNA, der kan bruges til at undersøge regulering af genekspression og celle signalering i TM. Metoden beskrevet LCM kan desuden også anvendes til andre væv i øjet.
LCM teknologi og en høj opmærksomhed for detaljer for optimering af væv håndtering spillede en afgørende rolle i den vellykkede udvikling af denne metode. Metode af væv bevarelse og isolation er en nøglekomponent i isolere høj kvalitet RNA til gen expression profilering. LCM kræver en meget høj sans for detaljer i dissekere, cryosectioning, fiksering, farvning, dehydrering, og varigheden af laser microdissection skal lykkes at opnå kvalitet RNA51. Væv snittykkelse kan øges; men tykkelsen stiger så UV laser magt er nødvendig for. Øget laser power resultater i en bredere laser sti, der kan forårsage RNA nedbrydning. Det konstateredes, at laser stien med 8 µm sektioner var tynd og fastsatte downstream RNA analyse nok væv. Figur 8 viser hvordan optimering af væv forberedelse kan drastisk ændre evne til laser dissekere TM fra øjet. Optimering af dette trin i protokollen (som beskrevet i afsnit 4) givet superior okulær-væv immobilisering og fuldstændig fjernelse af O.C.T. (fig. 8B) ved blot at bruge 75% i stedet for 95% ethanol (figur 8A) til at dehydrere væv efterfulgt af inkubation i RNase-fri vand for at fjerne montering medier. Yderligere dehydrering og farvning opnås ved hjælp af alkohol-baserede farvning reagenser. Det konstateredes desuden, at alkohol-baserede farvning reagenser gav superior resultater i forhold til vandige farvning reagenser (vandbaseret cresyl violet eller hæmatoxylin) og yderligere hjælper bevare RNA integritet52. Generelt, behandling af okulære væv ved hjælp af optimeret protokollen med alkohol-baserede farvning reagenser givet konsekvent okulær-væv sektioner, der var fuldt immobiliseret på PET membran dias.
Vores mål for denne undersøgelse var at udvikle en robust og pålidelig metode til at isolere høj kvalitet mRNA fra TM mus øjne for downstream udtryk analyse for at få indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for forhøjet IOP og grøn stær. Som vist i heatmap i figur 7C, giver isolere TM af LCM beskrevet protokollen en meget pålidelig metode til at isolere RNA fra TM og studere forskellene i genekspression i TM fra vildtype og mutant-mus. Den metode beskrevet heri vil tillade efterforskere at udføre molekylære analyser på en central betydning for patogenesen af glaukom væv i en in vivo -system, der er relativt nem og pålidelig og kan anvendes til gen expression analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
