Summary
Hier beschrijven we een protocol voor een reproduceerbare laser vangt microdissection (LCM) voor het isoleren van trabecular gevlochten (TM) voor downstream RNA analyse. De mogelijkheid om het analyseren van wijzigingen in genexpressie in het Vertaalgeheugen zal helpen bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TM-gerelateerde oogbeschadigingen en/of ziekten.
Abstract
Laser vangt microdissection (LCM) heeft toegestaan gen expressie analyse van afzonderlijke cellen en cel populaties in weefselsecties verrijkt. LCM is een geweldig hulpmiddel voor de studie van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de celdifferentiatie, de ontwikkeling en de progressie van verschillende ziekten, met inbegrip van glaucoom. Glaucoom, die bestaat uit een familie van progressieve optic neuropathieën, is de meest voorkomende oorzaak van onomkeerbare blindheid wereldwijd. Structurele veranderingen en schade binnen het trabecular gevlochten (TM) kunnen leiden tot verhoogde intraoculaire druk (IOP), dat een belangrijke risicofactor is voor het ontwikkelen van glaucoom. De exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn echter nog steeds slecht begrepen. De mogelijkheid om het gen expressie analyses uit te voeren zullen van cruciaal belang bij het verkrijgen van meer inzicht in de functie van deze cellen en haar rol in de regulatie van de ontwikkeling van het IOP en glaucoom. Om dit te bereiken, verrijkt een reproduceerbare methode voor het isoleren van sterk TM uit bevroren secties van muis ogen en een methode voor de analyse van de expressie van de stroomafwaartse gen, zoals RT-qPCR en RNA-Seq nodig is. De hier beschreven methode is ontwikkeld om zeer zuivere TM van muis ogen isoleren voor downstream digitale PCR en microarray analyse. Deze techniek kunnen bovendien gemakkelijk aan te passen voor de isolatie van andere hoogverrijkt oogbeschadigingen en/of cellen en de cel compartimenten die moeilijk geweest te isoleren van de ogen van de muis. De combinatie van LCM en RNA analyse kan bijdragen tot een vollediger begrip van de cellulaire gebeurtenissen ten grondslag liggen aan de glaucoom.
Introduction
Glaucoom is een groep van ziekten gekenmerkt door optische neuropathie en retinopathie die uiteindelijk tot onomkeerbare blindheid1,2 leidt. Geschat wordt dat door 2020 meer dan 70 miljoen mensen wereldwijd moeten met een vorm van de ziekte3,4,5,6,7 leven zal. Primaire open hoek glaucoom (POAG), het meest voorkomende type glaucoom, wordt gekenmerkt door een daling in aqueous humor (AH) uitstroom leidt tot verhoogde intraoculaire druk (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Linker onbehandeld, chronisch verhoogde IOP leidt tot progressieve en onomkeerbare schade aan de retina en oogzenuw hoofd veroorzaakt radiale blindheid1,2,19. Alle huidige methoden voor het vertragen van de progressie van glaucoom focus op vermindering van de IOP, hetzij door het verminderen van het percentage van de productie van AH door het straalvormig lichaam of verbetering van het uitstroom1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. het trabecular gevlochten (TM) speelt een cruciale rol bij het reguleren van de primaire AH uitstroom pathway actief en zijn onjuiste functie is een oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Echter de moleculaire mechanismen gekoppeld TM dysfunctie en hoe regelt het AH drainage worden nog niet volledig begrepen en is momenteel een belangrijk aandachtspunt van glaucoom onderzoek1,2,19, 20. terwijl verschillende genoom-brede vereniging studies (GWAS) een aantal genen aan glaucoom en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM hebt gekoppeld, de exacte moleculaire mechanismen die leiden tot de ziekte niet nog volledig begrepen21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Dierlijke modellen hebben aanzienlijk verbeterd onze huidige kennis van de progressie van de ziekte in glaucoom (uitgebreid herzien in3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Verschillende baanbrekende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de TM34,35,,36 en deze methoden hebben wijd verbeid gebruikt om ons huidige begrip van normale en zieke weefsel. Een gebied dat is niet uitgebreid onderzocht is het gebruik van genetisch gemodificeerde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM mislukking. Transgene knock-in en knock-out muis studies van TM verbonden genen, zoals Myocilin (Myoc)37,38 en39van het Cyp1b1, zijn de belangrijkste instrumenten voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM functie. Begrijpelijk, de geringe omvang van de TM in muizen vertegenwoordigt een ernstige hindernis die moet worden overwonnen om te beginnen met het bestuderen van dit weefsel. Muismodellen vertegenwoordigen een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de genetica en de moleculaire mechanismen van ziekte, hoewel de vooruitgang in de LCM technologieën bieden de noodzakelijke hulpmiddelen om de studie van de kleinste en meest delicate weefsels, met inbegrip van de TM machtigen.
In dit verslag wordt een robuust en reproduceerbare methode beschreven voor de LCM van hoogverrijkt TM van muis ogen samen met de latere RNA isolatie en versterking voor downstream expressie analyse. Soortgelijke methoden hebben met succes gebruikt bij muizen te isoleren van andere soorten oog weefsels40,41,42,43,44, de methodologie die hierin gemeld kan worden toegepast op andere discrete weefsels van het oog om te studeren van RNA, microRNA, DNA en proteïnen. Belangrijk is dat maakt deze techniek het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen voor een beter begrip van de moleculaire pathogenese van TM waardevermindering in glaucoom en oculaire ziekte3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. De mogelijkheid om te isoleren van de TM van muis ogen door LCM zullen een handige techniek bij het verkrijgen van meer inzicht in de moleculaire mechanismen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care en gebruik Comité (ACUC) goedgekeurd alle methodologie van dit onderzoek onder de NIEHS dier studeren voorstel IIDL 05-46.
1. optimale weefsel collectie voor Laser Microdissection
- Verkrijgen van 2 naar 3-maand oude muizen, mannelijk of vrouwelijk C57BL/6. Euthanaseren met CO2 voor een minimum van 1 min of totdat ademhaling heeft opgehouden. Verwijderen van het dier uit de kooi en dood door cervicale dislocatie, onthoofding of Thoracotomie verzekeren.
- Controleer voordat u dissectie, dat alle dissectie tools zijn schoon en gesteriliseerd.
Opmerking: Voor het verwijderen van de ogen gebogen schaar en pincet met getande tip (voorkeur tip grootte: 0,5 x 0.4 mm) nodig zullen zijn. - Vast de muis op een vlakke ondergrond op zijn kant zodat het oog gemakkelijk toegankelijk is. Greep op de canthus (hoek van het oog) met de verlostang om te stabiliseren van de muis, dan rond het oog met behulp van de oogkas als een gids, totdat de oogbol kan gemakkelijk worden genomen uit het stopcontact met behulp van de gebogen schaar, geconfronteerd met de curve uit de buurt van het oog, knip (gebruik de curve niet de Tips van de schaar).
- Trek voorzichtig en, met behulp van de gebogen schaar, snijd de oogzenuw, die releases van het oog van de orbitale aansluiting. Verwijder niet-oculaire weefsel voorzichtig van het oog en spoelen in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal 1.3-1.4 voor het contralaterale oog.
- DEP het oog met een doekje weefsel te verwijderen vocht voordat het insluiten. Plaats het oog in specimen mal (25 x 20 x 5 mm3), zodat de lens en de oogzenuw parallel aan de top van de Bank zijn om te verkrijgen Sagittaal secties. Insluiten ogen in optimale snijden temperatuur (O.C.T.) samengestelde en plaats op de droogijs te bevriezen. Zodra bevroren, slaan de blokken bij-80 ° C.
2. ingevroren sectie Laser Microdissection voorbereiding
- Incubeer polyethyleentereftalaat (PET) membraan dia's in UV cross-linker bij het maximumvermogen gedurende 45 minuten vóór gebruik.
- Spray RNase decontaminatie oplossing op het penseel, pincet, koppeling van potten en montage van chuck. Veeg grondig. Spoel met water nuclease-vrij en droog. Veeg beneden de cryostaat met 100% ethanol te voorkomen van kruisbesmetting.
- Aanpassen van de cryostaat tot-18 ° C. Tegelijk een diepgevroren blok verwijderen uit de diepvries-80 ° C en leveren de cryostaat met droogijs. Het toestaan van diepgevroren blok aan equilibreer met de temperatuur van de cryostaat voor een minimum van 10 min.
- Knijp een kleine hoeveelheid van de O.C.T. op het montage blok (figuur 1A) en het weefsel blok uit de mal te verwijderen en zorgvuldig plaats het blok op de montage chuck (figuur 1B). Zodra het blok weefsel op de montage-chuck is bevroren solide, invoegt op de monsterhouder van de cryostaat (figuur 2A).
- Aanpassen van de cryostaat om te knippen 8 µm secties en zorgvuldig section via het O.C.T. blok te bereiken van het monster weefsel. Zodra het weefsel wordt waargenomen, stoppen afdelen, trim de bevroren blokken aan alle zijden met behulp van een schone scheermesje en laat 3-4 mm van de O.C.T. rond het weefsel om omgaan met de kwast (figuur 2B). Gebruik een nieuwe schone kwast in plaats van de roll-plaat tussen elke steekproef wijziging om te voorkomen dat het monster kruisbesmetting.
- Sectie door het oog snel werkend. Vlek elke derde sectie door overstromingen van de dia met een snelle one-step haematoxyline en eosine (H & E) vlek voor 60 s, spoel met leidingwater, lucht droog, duidelijk in clearing agent en monteren op een geladen glasplaatje met een dekglaasje aan. Bekijken onder de Microscoop en blijven totdat de TM duidelijk in de uitgesneden gedeelten is te segmenteren.
- Zodra de TM begint te verschijnen, 2 secties snijden en mount op een geladen glasplaatje voor routine H & E kleuring vormen een kaart voor het snijden met de LCM.
Opmerking: Zie paragraaf 3 voor kaart en kleuring details. - Nadat de eerste H & E dia kaart, te knippen 6 seriële 8-µm dik secties in de cryostaat line-up en gelijktijdig monteren op de PET membraan dia (figuur 3A, B). Houden het weefsel door te kort schuiven gehandschoende duim langs de achterkant van het membraan. Na montage, onmiddellijk van kracht worden de PET membraan dia in een dia doos op droog ijs.
Opmerking: Minder secties kunnen worden gemonteerd, montage in een keer meerdere secties op de dia wordt echter aanbevolen om aantasting van het RNA door het beperken van de hoeveelheid tijd die elke sectie wordt blootgesteld aan de lucht van de kamertemperatuur. - Blijven afdeling van het oog, na elke twee PET membraan dia's met elk 6 secties, verzamelen van twee secties op een geladen glasplaatje maken een andere kaart dia voor H & E kleuring. Blijven afdelen, ongeveer 100 seriële 8-µm dik secties, totdat TM is niet meer zichtbaar. Bevestigen door snel kleuring een sectie op een geladen glasplaatje (zie 2.6).
- Alle huisdier membraan dia's bij-80 ° C voor later LCM gebruik opslaan.
3. H & E kaart dia kleuring Protocol en morfologische Review
- Om te visualiseren en de kaart dia's op de dia's van geladen glas, fix het weefsel door de overdracht van onmiddellijk in een kleuring pot gevuld met 100 mL van de snelle vaststelling oplossing voor 7 s. spoelen de dia door dompelen in gedestilleerd water 10 - 20 keer , vervolgens de dia overbrengen in een pot van de koppeling met zuiver gedestilleerd water.
- De dia verwijderen met water en DEP de plaatjes droog randen met weefsel doekje. Pipetteer 200 µL bewerkt Harris Hematoxylin gefilterd op elke sectie en incubeer 30 s bij kamertemperatuur. Spoel zorgvuldig de dia onder stromend leidingwater tot water duidelijk loopt. Het einde van de dia met het wissen van een weefsel tussen elke stap (vlek tussen elke stap van 3.2-3.5) de vlek om het overtollige vocht te verwijderen.
- Plaats dia in 1 x PBS bij kamertemperatuur voor 30 s. Vervolgens spoel zorgvuldig de dia onder stromend leidingwater voor 30 s.
- Dompel de dia 3 - 4 keer in Bad van 95% ethanol. Breng genoeg eosine Y kleurstof oplossing om te dekken van het weefsel op de dia en incubeer gedurende 15 s bij kamertemperatuur.
- Spoel de dia in 95% ethanol bad tweemaal met 10-20 snelle dips elke. Spoel de dia in 100% ethanol bad tweemaal met 10-20 snelle dips elke. Vervolgens spoel dia twee keer in xyleen bad (10-20 snelle dips elk).
- Mount door harsachtige montage medium op het weefsel te passen, voeg dekglaasje aan zorgvuldig om luchtbellen te voorkomen en te laten 's nachts drogen in de kap.
- Bespreek H & E dia's visueel of met behulp van een digitale dia scanner. Kaart dia's identificeren met TM duidelijk zichtbaar en toegankelijk voor het snijden. Gebruik de PET membraan dia's tussen deze kaart dia's voor LCM.
4. polyethyleen tereftalaat (PET) membraan dia's verwerking en kleuring Protocol
- Voordat verwijderen PET dia's uit diepvries eerst cresyl violet stockoplossing bereiden door ontbinding van 0,3 g cresyl violet acetaat in 20 mL van 75% ethanol en plaats op pepermolens voor 2 h. Filter de oplossing met 0,22 µm steriele filter eenheid en bewaren bij 4 ° C niet langer dan 6 mon ths.
- Bereid de alcoholische oplossing eosine Y met verse 75% ethanol bij een verhouding van 1:4. Fixatie (75% ethanol) en uitdroging oplossingen (75%, 95% en 100% ethanol) voorbereiden in de schone, nuclease-vrij, 50 mL conische polypropyleen-buizen op het ijs. RNase remmer toevoegen aan elke oplossing.
- Verwijder dia doos met bevroren weefselsecties uit de diepvries-80 ° C en plaats het op droog ijs. Één dia tegelijk verwerken. Dia's bevestigen door het plaatsen van de dia onmiddellijk in koud 75% ethanol voor 30 s.
- Voorzichtig Dompel de dia in nuclease-gratis water voor 10-15 s te ontbinden O.C.T. zonder interferentie met de weefselsecties.
- Zorgvuldig Pipetteer 300 µL van 1,5% cresyl violet acetaat oplossing direct op de secties en incubeer gedurende 45 s bij kamertemperatuur. Vervolgens één keer wassen door deze te plaatsen in 75% ethanol bad voor 30 s. Pipetteer 200 µL eosine Y oplossing op de secties en incubeer gedurende 3-5 s.
- Uitdrogen van weefsel door het plaatsen van de dia vervolgens in 75% ethanol, 95% ethanol, en ten slotte, 100% ethanol bad voor 30 s elke. DEP het einde van de dia met het wissen van een weefsel tussen elke stap tot het overtollige vocht te verwijderen. Laat de dia lucht volledig drogen onder de motorkap voor 5 min. Eenmaal droog, uitvoeren LCM onmiddellijk daarna.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om te voorkomen dat het gebruik van xyleen voor deze stap, het kan leiden tot weefselsecties onvoldoende obligatie naar de membraan-dia en vermindert de efficiëntie van weefsel vastleggen.
5. laser Microdissection met UV-Laser
- Zet de computer en laat opstarten. Inschakelen van de Microscoop witte lichte voeding. Schakel de UV-laser-toets en een geel LED zal verlichten. Start de LCM-software, zodat het volledig laden en een live video wordt weergegeven. Druk op de knop van de laser op het vak van de controller en een groene LED zal verlichten.
- Laden van een nieuwe glasplaatje op het podium van de Microscoop, dan plaatst u de PET membraan dia met de gekleurd weefsel zijde naar beneden rechtstreeks op de bovenkant van het glasplaatje. Controleer of dat het membraan en het glasplaatje strak op het podium van de Microscoop zijn gekoppeld.
- Start LCM door eerste het instellen van de dia-limieten. Kies de laagste 4 X vergroting in het objectieve deelvenster (Figuur 4). Definieer het werkgebied van de membraan dia door het bewegen van de microscopen xy-fase tot de linkerbovenhoek waar de metaal en membraan ontmoeten zichtbaar in de live video feed is, druk op de knop "Limit 1" en een rode rechthoek op de routekaart verschijnen zal. Vervolgens naar de xy-fase naar de tegenoverliggende hoek verplaatsen en druk op de knop 'Beperk 2'. Druk op de "scan" knop om te maken een beeld van de routekaart van het membraan en weefsels tussen de vastgestelde grenzen.
- Dubbelklik in de buurt van de TM van één van de oog-onderdelen van de routekaart, de TM bevinden zich in de buurt van de top van de hoek van de iridocorneal (figuur 5A). Zodra de TM is geconstateerd, het zoompercentage op 10 X en handmatig de focus op de TM. Herhaal met 20 X en 40 X doelstellingen. Wanneer de TM in focus met de 40 X doelstelling (figuur 5B), navigeren in een leeg gebied in de buurt (focus wellicht enigszins worden aangepast), selecteer de "freehand tekengereedschap" en een lange lijn tekenen op een leeg gebied van weefsel.
- De laser parameters zo ingesteld dat de "gesneden snelheid" 34 is %, "focus" 58 is %, en "macht" is 70% (Figuur 4), en druk vervolgens op "cut". Fijne laser wijzigingen aanbrengen in de snelheid, focus en kracht parameters totdat een duidelijk en fijn snijlijn wordt waargenomen (Zie figuur 5C). Zorgen voor exact snijden, snijden actie volgt de getekende lijn.
- Het deksel van de buis isolatie in de cap-houder laden en open de buis. De GLB-houder hechten aan de GLB-lift en zorg ervoor dat de buis is omgekeerd. Verzekeren dat het materiaal zelfklevend GLB buiten de tip van het GLB om ervoor te zorgen uitsteekt dat de gewenste weefsel goed is gevangen.
- Kies de "Manual" dissectie functie in het deelvenster van de software. Controleer zorgvuldig de TM (figuur 5B) wordt direct onder de isolatie buis. Stel de wit balans en helderheid te verwerven van de optimale beeldkwaliteit (Figuur 4).
- Om te beginnen snijden, handmatig aanpassen van de focus en een lijn tekent met behulp het freehand gereedschap, er zeker van te zijn dat het GLB collectie blijft in de up positie nog niet aanraken van het membraan. De gedeeltelijke cirkels tekenen in de buurt van waar de TM voldoet aan de sclera (figuur 5C), druk op "cut". Zodra de eerste bezuinigingen klaar bent, plaats van het GLB in de down positie en opnieuw de focus aanpassen, dan twee lijnen tekenen in de open of vrije ruimte om verbinding te maken met de twee gedeeltelijke cirkels voltooiing van de cirkel rond de TM, vervolgens pers "knippen" en verzamelen van weefsel van de sectie , verzekeren dat de TM werd opgepikt door het GLB microdissection (Figuur 5 D-F).
- Plaats de dop terug in de up positie en herhaal (5.2-5,8) op de resterende secties. Iets de GLB-positie aanpassen zodat alle geïsoleerde monsters zal op het GLB passen en elkaar niet (Figuur 5 g overlappen). Het venster van de tijd voor één dia is consistentie, 20 min. gebruik minder secties per huisdier dia als meer tijd nodig is voor het isoleren van TM uit alle geledingen. Voor de volgende PET membraan, invoegen van een nieuwe isolatie buis en herhaal punt 5.
6. lysis van Microdissected TM weefsel
- Vers bereiden RNA lysis-buffermengsel lyse LCM geïsoleerde weefsel. 10 µL β-mercaptoethanol toevoegen aan elk 1 mL van de lysis-buffermengsel. Bewaar de lysis-buffermengsel met β-mercaptoethanol bij kamertemperatuur niet langer dan 1 maand.
- Verwijder de isolatie buis van dop houder binnen 20 min vanaf het begin van de microdissection. Visualiseren van het oppervlak van het GLB op het oog om de vangst van TM.
- Zorgvuldig Pipetteer 10 µL lysis-buffermengsel op het deksel van de buis van de collectie zorgen voor de lysis-buffermengsel volledig bedekt het microdissected TM. Zachtjes sluit zelfklevende GLB en incubeer collectie buis ondersteboven bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na incubatie, centrifugeer bij 800 x g gedurende 2 min en plaats lysate op droog ijs. Opslaan lysates bij-80 ° C voor later zuivering en analyse.
7. RNA isolatie en analyse van de kwaliteit
- Analyseer de RNA-kwaliteit door de monsters bij kamertemperatuur ontdooien. Zwembad samen alle monsters geïsoleerd van een enkele muis in één RNase-vrije 1,5 mL microfuge buis.
Opmerking: bijvoorbeeld, voor elke biologische repliceren, 10-12 buizen met microdissected doppen in 10 µL lysate werden gegenereerd en alle lysates werden overgebracht in een enkele buis voor elke biologische repliceren (100-120 µL lysate). - 1 deel vers bereide 70% ethanol (gemaakt met RNase-gratis water) toevoegen aan elke lysate oplossing. Vervolgens zuiveren totaal RNA na de RNA isolatie kit gebruiker richtsnoeren. Zorgen voor de opheffing van de genomic DNA van elk monster RNA.
Opmerking: Genomic DNA kan interfereren met stroomafwaartse RNA analyse. - Het meten van de kwaliteit van RNA geïsoleerd van het Vertaalgeheugen door het bundelen van monsters van elke muis en analyseren van de integriteit van de ribosomaal RNA (figuur 6A).
Opmerking: Als gevolg van de geringe omvang van de TM, ribosomaal RNA pieken wellicht niet waarneembare (figuur 6B) in het RNA kwaliteit Profiel (twee pieken waargenomen tussen 1000-4.000 bp in figuur 6A, C) die wordt gebruikt voor het berekenen van het RNA integriteit nummer (RIN) 47.- Een meer nauwkeurige maatstaf van RNA integriteit krijgen door het isoleren van RNA uit het meer overvloedig resterende weefsel op de dia membraan. Verkrijgen van een vertegenwoordiger RIN, isoleren RNA van het oculair-weefsel op de membraan dia door pipetting 10 µL lysis buffer op een weefselsectie en uitvoeren van RNA isolatie. Analyseren van RNA kwaliteit en bereken RIN (Figuur 6 c).
- Voor downstream RNA toepassingen, gebruik een lage input RNA kit voor sequencing en cDNA Bibliotheek generatie opleveren reproduceerbare uit zo weinig als 80 delen van LCM resultaten geïsoleerd TM.
8. analyse
- Om te verifiëren dat het weefsel verzameld in feite in TM-geassocieerde genen is verrijkt, meerdere extra RNA van microdissected hele oog, sclera, iris, netvlies, hoornvlies en lens van 3 aparte muizen te verzamelen. Gebruik die deze RNA in combinatie met LCM verzameld RNA van geïsoleerd TM en Ciliaire lichaam verzameld uit 4 aparte muizen.
- Convert die RNA van de microdissected monsters moest cDNA met behulp van een cDNA omgekeerde transcriptie kit. Amplify RNA van LCM geïsoleerd monsters en omzetten van cDNA met behulp van een lage input RNA, cDNA Kit.
- Alle RNA voor trabecular gevlochten uiting van genen, myocilin (MYOC) en alpha-actine-2 (ACTA2), analyseer en normaliseren met behulp van het HSP90a1 huishouding gen door digitale PCR (figuur 7A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM RNA verkregen in de TM en straalvormig lichaam van 4 verschillende muizen werd geïsoleerd om te kunnen analyseren van genexpressie en de expressie met dat in het hele oog, sclera, iris, netvlies, hoornvlies en lens geïsoleerd uit drie aparte muizen te vergelijken. TM uiting van genen, werden MYOC48 en49 van de ACTA2geanalyseerd in alle verzamelde weefsels te bevestigen dat de geïsoleerde TM monsters inderdaad in TM hoogverrijkt waren. Als gevolg van de extreem lage hoeveelheid cDNA van de LCM monsters werd digitale PCR gebruikt, die heeft bewezen als meer reproduceerbare met minder materiële50. De uitdrukking van MYOC en ACTA2 was genormaliseerd met behulp van het HSP90a1 -huishouden-gen, en vervolgens elk weefsel was vergeleken met die van het hele oog. Deze resultaten laten zien dat MYOC (figuur 7A) en ACTA2 (figuur 7B) sterk in de TM-monsters uitgedrukt zijn, bevestiging van de succesvolle isolatie van hoge kwaliteit RNA van de hoogverrijkt TM monsters voor downstream RNA analyse. Als bewijs van concept, werd deze techniek toegepast op de TM-geïsoleerde RNA van WT muizen en van een stam van muizen met een verhoogde IOP fenotype voorbereid en geanalyseerd door microarray. Deze analyse geïdentificeerd veel genen betrokken bij glaucoom die differentieel tussen de TM van WT muizen en die van de muizen met het fenotype van glaucoom (Figuur 7 c) worden uitgedrukt.
Figuur 1: plaatsing van bevroren weefsel blokkeren in de cryostaat. (A) O.C.T montage medium wordt toegepast op de cryostaat montage Brok. (B) bevroren specimen blok wordt gelijkmatig op de montage-chuck geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: procedure van bevroren oogweefsel in de cryostaat segmenteren. (A) voorbereiding van snijvlak te bereiken oogweefsel. (B) het trimmen van O.C.T. van het diepgevroren blok vóór het verzamelen van secties voor laser microdissection. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: opstellen van bevroren secties in de cryostaat. (A) 6 seriële 8 µm dik secties staan opgesteld in de cryostaat. (B) secties zijn gelijktijdig gemonteerd op de PET membraan dia. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Screenshot van laser microdissection software markeren van de belangrijke kenmerken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: locatie van trabecular gevlochten en UV laser parameterinstellingen voor goede isolatie van trabecular gevlochten. (A) (4 X) laag vergroting van één afdeling op het membraan van de PET markeren het trabecular gevlochten voor laser microdissection. (B) (40 X) hoge vergroting van trabecular gevlochten en aangrenzende weefsels. (C) snijdt de eerste gedeeltelijke cirkel van de TM in de buurt van de scleral regio met het GLB in de up positie. (D) finale snijdt in de vrije ruimte om de cirkel rond de TM met het GLB in de down positie te voltooien. (E) TM verwijderd uit de sectie en (F) gekoppeld aan het GLB. (G) meerdere gesneden secties gesneden uit de dezelfde PET membraan niet overlappende zelfklevend aan het GLB. S (Sclera), SC (Schlemm van kanaal), TM (Trabecular gevlochten), AC (voorste kamer). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: totale RNA opbrengst en kwaliteit schatting verkregen microdissected trabecular gevlochten weefsel. (A) totaal RNA van 80 secties van trabecular gevlochten (benaderd oppervlakte was 0.8mm2). (B) totale RNA van 20 delen van trabecular gevlochten (benaderd oppervlakte was 0.2 mm2). (C) totaal RNA van resterende oogweefsel na laser microdissection. RIN, het nummer van de integriteit van het RNA; BP, basenparen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Downstream RNA analyse van LCM geïsoleerd trabecular zitschalen. Kwantitatieve digitale PCR analyse van TM-geassocieerde genen in het Vertaalgeheugen geïsoleerd door de LCM. De TM-geassocieerde genen (A) MYOC (B) ACTA2 sterk uitgedrukt in de LCM gevangen TM monsters ten opzichte van andere weefsels van het oog. (C) Heatmap gegenereerd op basis van gegevens die zijn verkregen uit microarray analyse van trabecular gevlochten RNA geïsoleerd van WT muizen en KO muizen met een verhoogde IOP fenotype. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: vergelijking van weefsel voorbereiding voor en na de optimalisatie. Oog secties gesneden en geplaatst op PET membraan dia's met (A) de standaard 95% ethanol uitdroging voorbereiding (B) of de voorbereiding van de uitdroging geoptimaliseerde 75% ethanol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De TM speelt een vitale rol in het actief onderhouden homeostatische IOP en zijn dysfunctie wordt algemeen erkend als de belangrijkste oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Een aantal single nucleotide polymorphisms in verschillende genen geïdentificeerd door GWAS analyse zijn gekoppeld aan verhoogde glaucoom risico en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM; echter, de exacte moleculaire mechanismen die aanleiding tot deze ziekte geven nog niet volledig begrepen21,22,23,24,25. Genetische Muismodellen bieden een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van glaucoom. Echter, de geringe omvang van muis TM weefsel vertegenwoordigt een formidabele uitdaging voor isolatie van hoogverrijkt TM uit muis ogen en hoge kwaliteit RNA gen expressie p.a.. LCM is een waardevolle techniek voor het isoleren van een enkelvoudige of lage aantal cellen en kan worden gebruikt voor het bestuderen van genexpressie in weefselsteekproeven verrijkt voor specifieke celtypes. In deze studie is een robuuste en reproduceerbare LCM-methode beschreven om hoogverrijkt TM en hoge kwaliteit RNA dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van de regulatie van genexpressie en cel signalering in de TM te isoleren. De beschreven methode van de LCM kan daarnaast ook worden toegepast op andere weefsels in het oog.
LCM-technologie en een hoge aandacht voor detail voor optimalisatie van weefsel behandeling speelde een vitale rol in de succesvolle ontwikkeling van deze methode. De methodologie van weefsel instandhouding en isolatie is een belangrijk onderdeel van het isoleren van hoge kwaliteit RNA voor gen expressie profilering. LCM vereist een zeer hoge aandacht voor detail in ontleden, cryosectioning, fixatie, kleuring, uitdroging en tijdsduur van laser microdissection succesvol bij het verkrijgen van kwaliteit RNA51. Dikte van de sectie van de weefsel kan worden verhoogd; echter, zoals de dikte zo verhoogt de UV laser voeding vereist. Verhoogd laser macht resultaten in een bredere laser-pad dat leiden aantasting van het RNA tot kan. Bleek dat het pad van de laser met 8 µm secties was dun genoeg weefsel voorzien downstream RNA analyse. Figuur 8 toont hoe optimalisatie van het weefsel preparaat drastisch de mogelijkheid veranderen kan om de laser ontleden de TM uit het oog. De optimalisatie van deze stap in het protocol (zoals beschreven in sectie 4) leverde superieure oculair-weefsel immobilisatie en volledige verwijdering van de O.C.T. (figuur 8B) door eenvoudig met behulp van 75% in plaats van 95% ethanol (figuur 8A) om uitdrogen van het weefsel gevolgd door incubatie in RNase-gratis water om montage media te verwijderen. Verdere uitdroging en kleuring wordt bereikt door het gebruik van alcohol gebaseerde kleuring reagentia. Daarnaast bleek dat alcohol gebaseerde kleuring reagentia leverde superior resultaten ten opzichte van waterige kleuring reagentia (watergedragen cresyl violet of Haematoxyline) en verder helpt RNA integriteit52te behouden. Over het geheel genomen verwerking oogbeschadigingen en/of weefsels met behulp van de geoptimaliseerde protocol met alcohol gebaseerde kleuring reagentia leverde consistente oculair-weefselsecties die volledig geïmmobiliseerdet op de PET membraan dia waren.
Ons doel voor dit onderzoek was een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van hoge kwaliteit te ontwikkelen mRNA van de TM van muis ogen voor downstream expressie analyse om het verkrijgen van inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de verhoogde IOP en glaucoom. Zoals blijkt uit de heatmap in Figuur 7 c, biedt het beschreven protocol van isolerende TM door LCM een zeer betrouwbare methode om te isoleren van RNA van TM en bestuderen van de verschillen in genuitdrukking in TM van wild type en mutant muizen. De hierin beschreven methode zal toestaan onderzoekers moleculaire analyse uitvoeren op een centraal in de pathogenese van glaucoom weefsel in een in vivo -systeem dat is relatief eenvoudig en betrouwbaar en kan worden toegepast op gen expressie analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
