Summary
여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.
Abstract
레이저 캡처 기정 (LCM)는 단일 세포의 유전자 표정 분석을 허용 하 고 조직 섹션에서 세포 인구를 풍성 하 게. LCM 기본 세포 분화와 개발 및 녹 내장을 포함 하 여 다양 한 질병의 진행 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 훌륭한 도구입니다. 녹 내장, 진보적인 광섬유 neuropathies의 가족 구성, 전세계 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인입니다. 녹 내장을 개발 하기 위한 주요 위험 요소 증가 안구 내부 압력 (IOP), 구조 변경 및 배수 채널 (TM) 내에서 손상 발생할 수 있습니다. 그러나, 관련 된 정확한 분자 메커니즘이 아직도 제대로 이해 하 고. 유전자 표정 분석을 수행 하는 기능 추가 이러한 셀 및 IOP와 녹 내장 개발의 규칙에 있는 그것의 역할의 기능에 대 한 통찰력을 얻기에 중요 한 될 것입니다. 이를 위해, 높은 격리에 대 한 재현 방법 실시간 정량 및 RNA-Seq 필요와 같은 마우스 눈 및 다운스트림 유전자 표정 분석 방법의 냉동된 섹션에서 TM 농축. 여기에 설명 된 메서드는 다운스트림 디지털 PCR 및 microarray 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 TM을 개발 된다. 또한,이 기술은 다른 매우 풍부한 눈 세포 및 마우스 눈에서 분리 하기 어려운 세포 구획의 격리에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. LCM 및 RNA 분석의 조합을 녹 내장 기본 셀룰러 이벤트의 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있다.
Introduction
녹 내장 질병 광섬유 신경 및 망막 궁극적으로 돌이킬 수 없는 실명1,2리드 특징의 그룹입니다. 2020 이상에 의해 70 백만 명 세계적으로 살게 될 것입니다 질병3,,45,,67의 일종으로 추정 된다. 기본 개방 각 녹 내장 (POAG), 녹 내장, 가장 널리 퍼진 유형의 액 (AH) 유출 증가 안구 내부 압력 (IOP)8,,910, 선도 저하에 의해 특징입니다. 11,12,13,143,15,,1617,18. 왼쪽된 치료, 만성 높은 IOP 망막 및 시 신경 머리 방사형 실명1,2,19를 일으키는 진보적이 고 돌이킬 수 없는 손상으로 이어집니다. Ciliary 바디 아의 생산의 속도 감소 또는 그것의 유출1,,89, 를 강화 하 여 IOP를 감소에 녹 내장의 진행을 둔화에 대 한 모든 현재 메서드 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 주 아 유출 통로 적극적으로 조절에 중요 한 역할을 담당 하는 배수 채널 (TM)의 부적절 한 함수 이며 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 원인이 되는 요소. 그러나, TM 부전와 어떻게 그것은 아 배수 조절 관련 분자 메커니즘 아직 완전히 이해 되지 않는다 며 현재 녹 내장 연구1,2,19, 의 주요 초점 20. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS)는 녹 내장 및 TM에서 아 유출 시설에 증가 저항 유전자의 수를 연결 하 고, 하는 동안 질병으로 이어질 하지 않은 정확한 분자 메커니즘이 아직 완전히 이해21 , 22 , 23 , 24 , 25.
동물 모델 크게3,15,16,26,,2728, (광범위 하 게 검토 하는 녹 내장에 질병 진행의 우리의 현재 지식 향상 29,,3031,,3233). 몇 가지 선구적인 방법은 TM34,,3536 연구 개발 되었습니다 고 정상과 병에 걸리는 직물의 우리의 현재 이해를 사전에 이러한 방법을 널리 사용 되었습니다. 하나의 영역을 광범위 하 게 탐험 되지 않은 TM 실패의 분자 메커니즘 연구를 유전자 변형된 마우스 모델의 사용 이다. 유전자 변형 노크에 Myocilin (Myoc)37,38 등 Cyp1b139, TM 관련 유전자의 녹아웃 마우스 연구 되었습니다 공부 TM의 분자 메커니즘을 위한 기본 도구 기능입니다. 당연 하 게도, 작은 크기의 마우스에서 TM이이 조직 공부를 시작 하기 위하여 극복 되어야 하는 심각한 장애물이 나타냅니다. 마우스 모델 LCM 기술에서 가장 작고 가장 섬세 한 조직, TM 등의 연구 능력을 필요한 도구를 제공 하는 동안 유전학 및 질병의 분자 메커니즘을 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.
이 보고서에는 강력 하 고 재현 방법 후속 RNA 격리 및 다운스트림 식 분석에 대 한 증폭 마우스 눈에서 높은 농축된 TM의 LCM에 대 한 설명 되어 있습니다. 유사한 방법에서에서 사용 된 성공적으로 쥐 눈 조직40,41,42,,4344의 분리, 다른 여기 보고 방법론을 적용할 수 있습니다. RNA, 예측에 관한, DNA, 단백질 공부 하 고 눈의 개별 조직. 중요 한 것은,이 기술은 유전자 변형된 쥐 녹 내장과 눈 질병3,,1516,17 TM 장애의 분자 병 인을 이해를 사용할 수 있습니다. ,18,26,31,,4546. LCM에 의해 마우스 눈의 TM을 능력 추가 여러 눈 질환의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기에 있는 유용한 기술 될 것입니다.
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Protocol
국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIEHS 동물 연구 제안 IIDL 05-46에서이 연구의 모든 방법론을 승인 했다.
1. 최적의 조직 컬렉션 레이저 기정에 대 한
- 2, 3 개월 된 생쥐를 얻을 남성 또는 여성 C57BL/6. 최소 1 분 또는 호흡 정지 했습니다 때까지 CO2 를 안락사. 감 금에서 동물을 제거 하 고 자 궁 경관 탈 구, 잘린, 또는 thoracotomy 죽음을 보장.
- 해 부를 하기 전에 모든 해 부 도구는 깨끗 하 고 소독 확인.
참고: 눈의 제거를 위한 곡선가 위 및 톱니 모양의 팁으로 겸 (선호 하는 팁 크기: 0.5 x 0.4 m m) 필요 하 게 됩니다. - 누워 마우스 옆에 평평한 표면에 눈은 쉽게 접근할 수 있도록. 안구는 소켓에서 쉽게 반입할 수 있습니다 때까지 가이드로 눈 소켓을 사용 하 여 눈 주위를 잘라 눈에서 곡선에 직면 하 고, 곡선된가 위를 사용 하 여 다음 마우스를 안정화 하기 위해 집게와 법 (눈의 모서리)에 파악 (커브를 사용 하 여 하지는 가 위의 팁)입니다.
- 부드럽게 당겨 그리고, 궤도 소켓에서 눈을 해제 시 신경 절단 곡선된가 위를 사용 하 여. 조심 스럽게 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에 씻어 고 눈에서 비 눈 조직 제거. 1.3-1.4 contralateral 눈에 대 한 반복 합니다.
- 포함 하기 전에 모든 습기를 제거 하는 조직 삭제 기능으로 눈을 가릴. 화살 섹션을 얻기 위하여 렌즈와 시 신경은 벤치 탑에 평행 되도록 표본 몰드 (25 x 20 x 5 m m3)로 눈을 놓습니다. 눈에 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물을 포함 하 고 동결을 드라이 아이스에 놓습니다. 즉, 일단 저장-80 ° c.에 블록
2. 냉동된 섹션 준비 레이저 기정
- 전에 사용 하 여 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)를 품 어 막 45 분에 대 한 최대 전력에서 UV cross-linker에 슬라이드.
- 스프레이 브러시, 집게, 항아리, 커플링 및 척 장착에 RNase 오염 솔루션. 철저 하 게 닦아. Nuclease 무료 물으로 헹 구 고 건조. 100% 에탄올을 교차 오염을 피하기 위해 cryostat 아래로 닦으십시오.
- -18 ° c cryostat 조정 한 번에 한 냉동된 블록-80 ° C 냉장고에서 제거 하 고 드라이 아이스와 함께 cryostat 제공. 10 분의 최소 cryostat의 온도와 equilibrate 냉동된 블록을 허용 합니다.
- 장착 덩어리 (그림 1A)에 O.C.T.의 작은 금액을 짜 내 고 형에서 조직 블록을 제거 하 고 신중 하 게 장착 척 (그림 1B)에 블록을 배치. 일단 장착 척에 조직 블록 고체 동결, cryostat (그림 2A)의 견본 홀더에 삽입 합니다.
- 8 µ m 섹션을 잘라내어 신중 하 게 조직 샘플을 도달 하는 O.C.T. 블록을 통해 섹션 cryostat을 조정 합니다. 일단 조직 관찰 단면 중지 하 고 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 모든 면에서 냉동된 블록 트림 한 페인트 브러시 (그림 2B)와 함께 처리 수 있도록 주변 조직 O.C.T.의 3-4 mm를 두고. 새로운 깨끗 한 페인트 브러시를 사용 하 여 샘플 교차 오염을 피하기 위해 각 샘플 변경 사이 롤 접시 대신.
- 섹션을 신속 하 게 작업 하는 눈을 통해입니다. 빠른 단계 hematoxylin와 오신 (H & E) 슬라이드 범람 하 여 모든 제 3 섹션 60에 대 한 얼룩 얼룩 s, 수돗물으로 씻어, 건조, 개간 에이전트에 분명 공기와 coverslip로 충전된 유리 슬라이드에 탑재. 현미경 아래 보기 및 단면 컷된 섹션에 TM 분명 때까지 계속.
- 일단 TM 표시를 시작, 2 섹션을 잘라내어 H & E LCM와 절삭에 대 한 지도를 얼룩 루틴에 대 한 청구 유리 슬라이드에 탑재.
참고: 지도 및 얼룩 세부 사항에 대 한 섹션 3 참조. - 후 첫 번째 H & E 슬라이드 지도, 및 줄은 cryostat에 6 직렬 8 µ m 두꺼운 부분을 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드 (그림 3A, B)에 동시에 탑재. 짧게 막의 뒤로 따라 gloved 손가락을 슬라이딩 하 여 조직을 준수 합니다. 장착 후 드라이 아이스에 슬라이드 상자에 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 즉시 놓습니다.
그러나 참고: 적은 부분에 탑재 될 수 있습니다, 그리고, 각 섹션은 실내 온도 공기에 노출 되는 시간의 양을 제한 하 여 RNA 저하를 줄이기 위해 권장은 슬라이드에 여러 섹션을 한 번에 장착. - 계속 6 섹션 마다 두 애완 동물 멤브레인 슬라이드 후 눈, 섹션, H & E 염색에 대 한 다른 지도 슬라이드를 만드는 충전된 유리 슬라이드에 두 개의 섹션을 수집 합니다. 단면, 약 100 직렬 8 µ m 두꺼운 부분, TM은 더 이상 표시 될 때까지 계속 합니다. 신속 하 게 충전된 유리 슬라이드 (2.6 참조)에 대 한 섹션을 착 색 하 여 확인 합니다.
- 나중에 LCM 사용-80 ° C에서 모든 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 저장 합니다.
3. H & E 지도 슬라이드 얼룩 프로토콜 및 형태 검토
- 시각화 하 고 충전된 유리 슬라이드에 지도 슬라이드를 검토, 수정 얼룩 항아리에 즉시 전송 하 여 조직의 가득 급속 한 고정 솔루션의 100 mL 7 미 린스 슬라이드에 그것을 찍기 하 여 증류수 10-20 회 다음 깨끗 한 증류수와 커플링 항아리를 슬라이드를 전송.
- 물에서 슬라이드를 제거 하 고 조직 닦아 건조 가장자리를 되 리. 피펫은 200 µ L 수정 해리스 되며 각 섹션에 필터링 및 30에 대 한 품 어 실 온에서 s. 조심 스럽게 씻어 물 실행 취소 될 때까지 수돗물을 실행 하는 아래의 슬라이드. 과잉 액체를 제거 하려면 각 단계 (3.2-3.5에서 각 단계 사이 오 점) 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점.
- 1 x 30에 대 한 실 온에서 PBS에 장소 슬라이드 s. 그럼, 신중 하 게 씻어 30 수돗물 실행 하는 아래의 슬라이드 s.
- 3-4 회 95% 에탄올 목욕으로 슬라이드를 찍어. 슬라이드에 티슈 커버 15 알을 품을 정도로 오신 Y 염료 솔루션 적용 실 온에서 s.
- 두 번을 10-20 빠른 딥 각 95% 에타 놀 목욕에서 슬라이드를 씻어. 100% 에탄올 욕실 두 번 10-20 빠른 딥 각에서 슬라이드를 씻어. 그런 다음 슬라이드 두 번에에서 린스 크 실 렌 목욕 (10-20 빠른 딥 각).
- 수 지 장착 매체 조직에 적용 하 여 탑재, 신중 하 게을 피하기 위해 공기 방울 후드에 하룻밤 말리 coverslip 추가.
- 시각적으로 또는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 H & E 슬라이드를 검토 합니다. TM 명확 하 게 표시 하 고 절단에 대 한 접근으로 지도 슬라이드를 식별 합니다. 애완 동물을 사용 하 여 이들 사이 막 슬라이드는 LCM에 대 한 슬라이드를 지도.
4. 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물) 막 슬라이드 처리 및 얼룩 프로토콜
- 냉동 고에서 제거 애완 동물 슬라이드 먼저 0.3 g cresyl 바이올렛 아세테이트 75% 에탄올 20 mL에 용 해 하 여 cresyl 바이올렛 재고 솔루션을 준비 하 고에 배치 하기 전에 6 월 보다 2 h. 필터 0.22 μ m 살 균 필터 단위와 4 ° C에서 더 이상 저장소 솔루션에 대 한 셰이 커 ths입니다.
- 1:4 비율로 신선한 75% 에탄올 오신 Y 알코올 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 깨끗 한, nuclease 무료, 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 고정 (75% 에탄올) 및 탈수 솔루션 (75%, 95%, 및 100% 에탄올)를 준비 합니다. 각 솔루션에 RNase 억제제를 추가 합니다.
- -80 ° C 냉동 고에서 언된 조직 단면도 포함 하는 슬라이드 상자를 제거 하 고 드라이 아이스에 배치. 번에 하나의 슬라이드를 처리 합니다. 30에 대 한 차가운 75% 에탄올으로 즉시 슬라이드를 삽입 하 여 슬라이드를 수정 s.
- 부드럽게 슬라이드에 대 한 10-15 O.C.T. 조직 섹션을 방해 하지 않고 해산 nuclease 무료 물에 담근 다.
- 신중 하 게 1.5 %cresyl 바이올렛 아세테이트 솔루션 섹션에 직접의 300 µ L 플라스틱 및 45 품 어 실 온에서 s. 다음, 30 미 피 펫 200 µ L 오신 Y 솔루션 섹션에 대 한 75% 에탄올 욕조에 그것을 배치 하 여 한 번 세척 하 고 3-5에 대 한 품 어.
- 75% 에탄올, 95% 에탄올, 및 마지막으로, 100% 에탄올 30에 이후에 슬라이드를 삽입 하 여 조직을 탈수 s 각. 과잉 액체를 제거 하려면 모든 단계 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점. 슬라이드 어 후드 5 분 동안 완전히 건조 보자. 일단 건조, LCM 즉시 그 후 수행 합니다.
참고: 것이 좋습니다이 단계에 대 한 크 실 렌의 사용을 피하기 위해, 그것은 inadequately 막 슬라이드에 결합 조직 섹션을 발생할 수 있습니다 조직 캡처의 효율성을 감소 시킨다.
5. 레이저 서 UV 레이저
- 컴퓨터를 켜고 부팅을 허용. 현미경 흰색 빛 전원 공급 장치를 켭니다. 설정 UV 레이저 키와 노란색 led가 켜 집니다. LCM 소프트웨어를 시작, 그것은 완벽 하 게 로드 하 고 라이브 비디오 표시 됩니다 수 있습니다. 컨트롤러 상자에 레이저 버튼을 누르고 녹색 LED가 켜 집니다.
- 현미경 단계에 새로운 유리 슬라이드 로드 다음 직접 유리 슬라이드 위에 얼룩진된 조직 면 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 장소. 멤브레인 및 유리 슬라이드는 현미경 스테이지에 단단히 짝는 다는 것을 확인 하십시오.
- 첫 번째 슬라이드 제한을 설정 하 여 LCM을 시작입니다. 최저 4 배속 선택 객관적인 패널 (그림 4)에 확대. 금속와 막 만나는 왼쪽된 상단에 라이브 비디오 피드, 보도 "제한 1" 버튼 빨간색 사각형도로 지도에 표시 됩니다 표시 됩니다 때까지 현미경 xy 스테이지를 이동 하 여 막 슬라이드의 작업 영역을 정의 합니다. 다음, 반대 코너를 xy 스테이지를 이동 하 고 "제한 2" 버튼을 누릅니다. 설정된 한계 사이 조직과 막의 로드맵 이미지를 만드는 "스캔" 버튼을 누릅니다.
- 더블 클릭 로드맵 내 눈 섹션 중 하나의 TM 근처, TM iridocorneal 각도 (그림 5A)의 꼭대기 근처에 있을 수 있습니다. TM 식별 되 면 10 배와 수동으로 TM 배율을 늘립니다. 20 X 40 X 목적과 함께 반복 합니다. TM 40 X 목표 (그림 5B)와 초점에 있을 때 근처의 빈 영역으로 이동 (초점 약간 조정 해야 합니다), "프리 핸드 그리기 도구"를 선택 하 고 조직의 빈 영역에 긴 줄을 그립니다.
- "컷" 속도가 34%, "초점"은 58%, 그리고 "파워" 70% (그림 4), "잘라내기" 버튼을 누르면 레이저 매개 변수를 설정 합니다. 조정을 잘 레이저 속도, 포커스, 그리고 파워 매개 변수를 명확 하 고 정밀한 커팅 라인 (참조 그림 5C) 관찰 때까지. 정확한 절단, 절삭 그려진된 라인을 다음과 같이 확인 합니다.
- 절연 튜브 뚜껑 캡 홀더를 로드 하 고 튜브를 엽니다. 모자-리프트에 뚜껑 홀더를 부착 하 고 튜브 반전 다는 것을 확인. 접착제 모자 소재 원하는 조직을 제대로 캡처 되도록 뚜껑의 끝 넘어 돌출을 확신 합니다.
- 소프트웨어 패널에서 "수동" 해 부 모드를 선택 합니다. (그림 5B) TM 절연 튜브 바로 아래에 주의 깊게 검토. 화이트 밸런스를 설정 하 고 최적의 이미지 품질 (그림 4)을 취득 하는 밝기를 조정 합니다.
- 절단을 시작, 수동으로 초점을 조정 및 자유형 도구를 사용 하 여 선 그리기, 컬렉션 모자 아직 막 만지고 위쪽 위치에 남아 해야 합니다. TM sclera (그림 5C), 만나는 근처 그리기 부분 동그라미 누릅니다 "잘라." 첫 번째 컷 일단 뚜껑 아래 위치에 위치에 초점을 다시 조정 그리고 언론 "잘라내기" 그리고 조직 섹션에서 수집 TM, 주위에 동그라미를 완료 하는 두 개의 부분 동그라미를 연결할 오픈 또는 자유 공간에서 두 줄을 그립니다 확인 TM 서 모자 (그림 5 D-F)에 의해 포착 되었다.
- 위쪽에 다시 모자를 위치 하 고 나머지 부분에 (5.2-5.8)를 반복 합니다. 약간 모든 격리 샘플 뚜껑에 적합 하 고 (그림 5G)를 덮지 캡 위치를 조정 합니다. 일관성을 위해 시간 창 한 슬라이드에 대 일 분 사용 애완 동물 당 적은 부분 슬라이드 모든 섹션에서 TM을 분리 하는 데 더 많은 시간이 필요 하는 경우입니다. 다음 애완 동물 멤브레인에 대 한 새로운 절연 튜브를 삽입 하 고 섹션 5를 반복 합니다.
6입니다. Microdissected TM 조직 세포
- 갓 LCM 절연 조직 lyse RNA 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다. 세포의 용 해 버퍼의 각 1 mL에 10 µ L β-mercaptoethanol을 추가 합니다. 1 개월 이상에 대 한 실 온에서 β-mercaptoethanol와 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다.
- 캡 홀더는 서의 시작부터 20 분 이내에서 절연 튜브를 제거 합니다. TM의 캡처 수 있도록 눈으로 뚜껑 표면 시각화.
- 신중 하 게 세포의 용 해 버퍼 완전히 커버 microdissected TM 보장 컬렉션 튜브의 뚜껑에 10 µ L 세포의 용 해 버퍼 플라스틱. 부드럽게 접착제 뚜껑 닫고 컬렉션 튜브 거꾸로 10 분 동안 실 온에서 품 어. 부 화, 이후 2 분 동안 800 x g에서 원심 하 고 드라이 아이스에 lysate 놓습니다. 이후 정화 및 분석-80 ° C에서 lysates를 저장 합니다.
7. RNA 격리 및 품질 분석
- 샘플 실 온에서 해 동 하 여 RNA 품질을 분석. 수영장 함께 모든 샘플 한 RNase 무료 1.5 mL microfuge 관으로 단일 마우스에서 고립.
참고: 예를 들어 각 생물 복제에 대 한 10-12 튜브 microdissected 모자 10 µ L lysate에서 생성 된 그리고 모든 lysates 각 생물 복제 (100-120 µ L lysate)에 대 한 단일 관으로 옮겨 졌다. - 각 lysate 솔루션 (RNase 무료 물으로 만든) 갓된 70% 에탄올에의 한 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 RNA 격리 키트 사용자 지침에 따라 총 RNA 정화. 각 RNA 샘플에서 게놈 DNA의 제거를 확인 합니다.
참고: 게놈 DNA 다운스트림 RNA 분석을 방해할 수 있습니다. - 함께 각 마우스에서 샘플 풀링 하 고 (그림 6A) 리보솜 RNA 무결성을 분석 하 여 TM에서 격리 하는 RNA의 품질을 측정 합니다.
참고: TM의 작은 크기로 인해 ribosomal RNA 봉우리 되지 않을 수 있습니다 관찰 (그림 6B) RNA 품질 프로 파일 ( 그림 6A, C1000-4000 bp 사이 관찰 하는 두 개의 봉우리)에 RNA 무결성 번호 (린) 계산에 사용 되 47.- 막 슬라이드에 더 풍부한 나머지 조직에서 RNA를 분리 하 여 RNA 무결성의 더 정확한 측정을 얻을. 대표 린, pipetting 10 막 슬라이드에 안구 조직에서 격리 RNA를 µ L 세포 하나의 조직 섹션에 버퍼 고 RNA 격리를 수행 합니다. RNA 품질을 분석 하 고 린 (그림 6 c)를 계산 합니다.
- 다운스트림 RNA에 대 한 응용 프로그램에 대 한 재현를 시퀀싱 및 cDNA 라이브러리 생성을 위한 낮은 입력된 RNA 키트 LCM의 작은 80 섹션에서 결과 사용 하 여 TM 고립.
8입니다. 분석
- 수집 조직 TM 관련 된 유전자에 농축 사실 확인, microdissected 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막 및 렌즈 3 별도 마우스에서에서 여러 추가 RNA를 수집 합니다. LCM와 결합에서이 RNA에서 RNA를 수집 사용 고립 TM 및 ciliary 바디 4 별도 마우스에서 수집.
- Microdissected 샘플에서 RNA는 cDNA cDNA 역방향 전송 키트를 사용 하 여 변환 합니다. LCM 격리 샘플에서 RNA를 증폭 및 낮은 입력 RNA cDNA 키트를 사용 하 여 cDNA를 변환.
- 배수 채널 유전자, myocilin (MYOC)와 알파 걸 2 (ACTA2), 표현에 대 한 모든 RNA를 분석 하 고 디지털 PCR (그림 7A-B), HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정상화.
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Representative Results
LCM TM에서 RNA를 수집 및 4 다른 마우스에서 모양 몸은 유전자 발현을 분석 하 고 비교 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막, 및 렌즈 3 별도 쥐에서 고립에서 그 식 수 절연. TM 유전자 표현, MYOC48 와 ACTA249 격리 TM 샘플 TM에 농축 실제로 높게 했다 확인 모든 수집 된 조직에서 분석 되었다. LCM 샘플에서 cDNA의 매우 낮은 수량에 따라 디지털 PCR 사용 되었다는 입증 된 더 적은 소재50재현할 수 있습니다. MYOC 및 ACTA2 의 식 HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정규화 되었는지 다음 각 조직 전체 눈의 비교 되었다. 이러한 결과 MYOC (그림 7A) 및 ACTA2 (그림 7B) 높은 표현 됩니다 TM 샘플에서 다운스트림 RNA에 대 한 높은 품질 높은 농축된 TM 샘플에서 RNA의 성공적인 격리 확인 분석입니다. 개념의 증거로,이 기술은 TM 절연 RNA WT 쥐 및 쥐 높은 IOP 표현 형으로의 변형 준비 및 microarray 분석에 적용 되었습니다. 이 분석 TM의 WT 쥐 녹 내장 형 (그림 ℃)와 쥐의 그 사이 차동 표현 된다 많은 유전자 녹 내장에 연루 확인.
그림 1: 냉동된 조직의 배치는 cryostat 블록. (A) O.C.T 장착 매체 cryostat 장착 덩어리에 적용 됩니다. (B) 냉동 표본을 블록 장착 척에 균등 하 게 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 절차는 cryostat에 얼어붙은 눈 조직의 단면. 눈 조직에 도달 절단 표면 (A) 준비 합니다. (B) 레이저 기정에 대 한 섹션을 수집 하기 전에 언된 블록의 O.C.T.를 트리밍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 준비는 cryostat 냉동된 섹션의. (A) 6 직렬 8 µ m 두꺼운 부분에는 cryostat 줄지어 있다. (B) 섹션 동시에 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 거치 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 중요 한 기능을 강조 하는 레이저 서 소프트웨어의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 배수 채널 및 배수 채널의 적절 한 격리에 대 한 UV 레이저 매개 변수 설정의 위치. (A) 레이저 기정에 대 한 배수 채널을 강조 하는 애완 동물 멤브레인에 단일 섹션의 낮은 (4 배속) 확대. (B) 높은 (40 X) 확대 배수 채널 및 인접 한 조직. (C) 위쪽에 모자 scleral 지역 근처 TM의 첫 번째 부분 원 인하. (D) 최종 완료는 아래 위치에 모자와 TM 원을 여유 공간에 잘라냅니다. (E) TM 섹션 및 (F) 뚜껑에 연결 된에서 제거. (G) 여러 컷된 섹션 잘라 하지 중복 같은 애완 동물 멤브레인에서 준수는 모자. S (Sclera), 사우스 캐롤라이나 (Schlemm의 운하), TM (배수 채널), AC (앞쪽 챔버). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 총 RNA 수율과 품질 평가 microdissected 배수 채널 조직에서 얻은. (A) 배수 채널의 80 섹션에서 총 RNA (근접된 영역 크기는 0.8 m m2). (B) 의 배수 채널 20 섹션에서 총 RNA (근접된 영역 크기는 0.2 m m2). (C) 레이저 서 후 나머지 눈 조직에서 총 RNA. 린, RNA 무결성 번호; bp, 기본적인 쌍 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: LCM의 다운스트림 RNA 분석 배수 채널 절연. LCM에 의해 분리 하는 TM에 TM 관련 유전자의 양적 디지털 PCR 분석. TM 관련 유전자 (A) MYOC (B) ACTA2 높은 LCM에 표현 다른 눈 조직에 비해 TM 샘플을 캡처한. (C) Heatmap 배수 채널 RNA의 microarray 분석에서 얻은 데이터에서 생성 된 격리 WT 쥐와 코에서 높은 IOP 표현 형을 가진 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 조직 준비 최적화 전후 비교. 섹션을 잘라 눈에 귀 여 워 막 슬라이드 (A) (B) 표준 95% 에탄올 탈수 준비 또는 최적화 된 75% 에탄올 탈수 준비로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
TM는 중요 한 역할을 적극적으로 유지 하는 항상성 IOP와 그 장애는 널리 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 주요 원인이 되는 요소 하실. GWAS 분석에 의해 확인 된 여러 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 수 증가 녹 내장 위험 및 TM;에서 아 유출 시설에 증가 저항에 연결 된 그러나,이 질병을 정확한 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해21,,2223,,2425. 유전 마우스 모델 녹 내장의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 강력한 도구를 제공할 수 있습니다. 그러나, 마우스 TM 조직의 소형 마우스 눈 및 유전자 표정 분석에 대 한 고품질의 RNA에서 높은 농축 TM의 격리에 대 한 강력한 도전을 나타냅니다. LCM 셀의 단일 또는 낮은 수를 고립 시키기를 위한 귀중 한 기술 이며 특정 세포 유형에 대 한 농축 조직 샘플에서 유전자 발현을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 본이 연구에서는 강력 하 고 재현할 수 LCM 메서드 매우 풍부한 TM 및 TM에 신호 하는 세포 유전자 발현의 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 고품질 RNA 분리 설명 되어 있습니다. 또한, 설명된 LCM 메서드는 눈 내의 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.
LCM 기술과 조직 처리의 최적화에 대 한 세부 사항에 높은 관심을이 방법의 성공적인 개발에 중요 한 역할을 했다. 조직 보존 및 절연의 방법론 유전자 식 프로 파일링에 대 한 높은 품질 RNA 분리에서 핵심 구성 요소입니다. LCM 얼룩, 탈수, 및 기간 품질 RNA51을 얻기에서 성공적 이기 위하여 레이저 서의 해 부, cryosectioning, 고정, 세부 사항에 매우 높은 관심을 필요 합니다. 조직 섹션 두께 증가 시킬 수 있다; 그러나, 두께 증가 그렇게 않습니다 UV 레이저 전원 필요한. 레이저 파워 결과 RNA 저하 될 수 있습니다 넓은 레이저 경로에 증가 했다. 8 µ m 섹션으로 레이저 경로 얇은 되었고 다운스트림 RNA 분석에 대 한 충분 한 조직 제공 발견. 그림 8 쇼 조직 준비의 최적화 크게 레이저 수를 변경할 수 있습니다 어떻게 해 눈에서 TM 부. 이 단계 (섹션에서에서 설명한 대로 4) 프로토콜의 최적화 단순히 조직의 탈수를 95% 에탄올 (그림 8A) 대신 75%를 사용 하 여 우수한 안구 조직 동원 정지 및 O.C.T. (그림 8B)의 완전 한 제거를 굴복 설치 미디어를 제거 하려면 RNase 무료 물 부 화 뒤. 더 탈수와 얼룩 알코올 기반 착 색 시 약을 사용 하 여 이루어집니다. 또한, 그것 그 알코올 기반의 얼룩 굴복 시 약 우수한 수성 착 색 시 약 (물 기반 cresyl 바이올렛 또는 hematoxylin)를 기준으로 결과 및 추가 RNA 무결성52를 보존 하는 데 도움이 발견 했다. 전반적으로, 알코올 기반의 얼룩 시 약 굴복 일관 된 안구 조직 섹션 완전히 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 동원 되지 않은 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 눈 조직을 처리 합니다.
이 연구에 대 한 우리의 목표는 고품질 격리 하기 위한 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했다 높은 IOP와 녹 내장의 기반이 되는 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위하여 다운스트림 식 분석에 대 한 마우스 눈의 TM에서 mRNA. 그림 ℃에서 heatmap 같이 LCM에 의해 분리 TM의 설명된 프로토콜 TM에서 RNA를 분리 하 고 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 TM에 유전자 발현의 차이 연구 하는 매우 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 여기 설명 하는 방법을 조사자는 vivo에서 시스템은 상대적으로 간단 하 고 신뢰할 수 있는 녹 내장의 병 인을 중앙 조직에 분자 분석을 수행 하 고 유전자 표정 분석에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
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