Summary
Протокол для индукции в vitro эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT), которая является полезной для расследования сотовой сигнальных путей, участвующих в EndMT, описал. В этой экспериментальной модели EndMT вызванные лечение с TGF-β в эндотелиальных клетках MS-1.
Abstract
Фенотипические пластичности эндотелиальных клеток лежит в основе развития сердечно-сосудистой системы, сердечно-сосудистые заболевания и различные условия, связанные с фиброзом орган. В этих условиях дифференцированной эндотелиальные клетки приобретают мезенхимы как фенотипы. Этот процесс называется эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT) и характеризуется Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров, и морфологических изменений. EndMT индуцируется несколько сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и паз и регулируется молекулярные механизмы аналогичны эпителия мезенхимальных перехода (EMT) важные для гаструляция, фиброз тканей, и метастазами рака. Понимание механизмов EndMT имеет важное значение для разработки диагностических и терапевтических подходов, ориентации EndMT. Надежные индукции EndMT в vitro полезным характеризовать общим подписи выражение гена, определять druggable молекулярных механизмов и экран для модуляторы EndMT. Здесь мы описываем в vitro метод для индукции EndMT. MS-1 мыши поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки проходят EndMT после увеличиваемой подвержения к TGF-β и показать upregulation мезенхимальных маркеров и морфологические изменения, а также индукции несколько воспалительных chemokines и цитокинов. Также включены методы для анализа микроРНК (miRNA) модуляции. Эти методы предоставляют платформу для изучения механизмов лежащих в основе EndMT и вклад адаптивной к EndMT.
Introduction
Эндотелия мезенхимальных переход (EndMT) является процессом, в котором дифференцированной эндотелиальных клеток проходит целый ряд молекулярных изменений, что приводит к фибробластоподобных мезенхимальных клеток1. Первоначально EndMT был описан как преобразование эндотелиальных клеток во время разработки в сердце2,3. В начале развития сердца сердце трубка состоит из эндокарда внутренний и наружный миокарде. Эти два слоя разделены слоем внеклеточного матрикса, называется сердечной желе. Эмбриональные клетки эндокарда, которые приобретают эндотелиальных клеток маркеры, транзита в Мезенхимальные клетки, вторгнуться базовой сердца желе и способствуем формированию сердца подушки, создавая основу для Предсердно-желудочковые клапаны и перегородки и Полулунные клапаны. Кроме того было предложено EndMT быть источники pericytes и сосудистой гладкой мышечной клетки в других эмбриональной сосудистой системы, включая коронарных сосудов, брюшной аорты и легочной артерии4,5,6. Кроме того EndMT причастны физиологических ангиогенных прорастания7.
Накапливая доказательства предположил, что EndMT также участвует в нескольких сердечно-сосудистых заболеваний и других болезней1,8. EndMT связанного условия включают сосудистой кальцификации, атеросклероз, легочной артериальной гипертензии, кавернозных мальформация, орган фиброз, вен трансплантата Ремоделирование, аллотрансплантатом дисфункции в трансплантации почки и рак8, 9,10,11,12,13,14,,1516,17, 18. недавнем докладе говорится, что несколько молекулярных маркеров EndMT может быть инструментом для диагностики и прогноза предсказания дисфункции почек трансплантата в почечной трансплантации17. Модуляции клеточных сигнальных путей, связанных с EndMT было показано для улучшения несколько условий болезни, включая фиброз сердца и вен трансплантата Ремоделирование в животных моделей8,15. Таким образом понимание механизмов базовой EndMT важно развивать диагностические и терапевтические стратегии, ориентированные EndMT.
EndMT характеризуется потерей ячеек развязок, увеличение миграционным потенциалом, Даунрегуляция эндотелиальной конкретных генов как ве Кадгерины и upregulation мезенхимальных генов, включая актина α-гладких мышц (α-SMA). Кроме того EndMT и эпителия мезенхимальных перехода (EMT), аналогичный процесс, который преобразует эпителиальных клеток мезенхимальных клеток, связаны с измененной производства различных компонентов внеклеточного матрикса, которые могут внести вклад в развитие 8,фиброз тканей19.
Недавно несколько исследований в пробирке EndMT раскрыты подробности молекулярных механизмов EndMT15,20. EndMT индуцируется различных сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и надрезать1. Среди них TGF-β играет ключевую роль в индукции EMT и EndMT. В EndMT продолжительное воздействие TGF-β результаты в EndMT в различных эндотелиальных клеток, в то время как короткие выдержки, как представляется, недостаточно21. Здесь мы описали простой протокол для индукции EndMT, в которых Свен 1 миля (МС-1) поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши пройти EndMT в vitro после увеличиваемой подвержения к TGF-β20. В этой модели можно выполнить несколько ниже по течению анализа расследовать отличительной черты EndMT, в том числе морфологические изменения, Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров и воспалительные гены, цитоскелета перестановки и сокращение гель коллагена.
МикроРНК (интерферирующим) являются ~ 22 nt малых регулирования РНК, которые направляют посттранскрипционного репрессии в отношении различных мРНК целей22,-23. Через признание целевой последовательности опосредованной семян адаптивной подавить сотни целевых генов и модулировать различных клеточных функций, таких как дифференцировки клеток, распространением и подвижности. Это также касается регулирования EMT и EndMT, и несколько интерферирующим были зарегистрированы как регуляторы EMT и EndMT24,25. EndMT модель, представленная в этом обзоре можно легко комбинируется с Мирна модуляции процедур для проверки роли интерферирующим в EndMT. Настоящий обзор обобщает наши экспериментальные процедуры расследования TGF-β-индуцированной EndMT в клетках MS-1 и также включает в себя сравнение условий EndMT индукции, TGF-β в других эндотелиальных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. индукция EndMT
- Поддерживать клетки MS-1 в условиях стандартной культуры и избежать confluency. Источник клеток MS-1 описан в Таблице материалов. Для MS-1 ячеек используйте минимум основных средне α (MEM-α) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 50 ед/мл пенициллин и 50 мкг/мл стрептомицина.
- Вымойте MS-1 клетки на 10 см блюдо с 1 x-фосфатный буфер (PBS) и добавить 1,0 мл трипсина к пластине. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- Отсоедините ячейки, используя 9 мл культуры средств массовой информации. Собирайте суспензию клеток в 15 мл.
- Центрифуга суспензию клеток на 300 – 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Тщательно удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в подогретым культуры средств массовой информации.
- Количество жизнеспособных клеток с помощью Трипановый синий раствор и стандартные Горяева или счетчик автоматический клеток.
- Плита MS-1 клетки на немелованной стандартных культуры пластин на 0,5 x 103 клеток на2 см для долгосрочной термин культуры. К примеру плита 5.0 x 103 клеток на хорошо в 6 хорошо культуры пластины. Используйте же культура СМИ, включая такой же концентрации FCS. В MS-1 клеток TGF-β индуцирует EndMT в долгосрочной перспективе культуре (по крайней мере 48-72 ч) с использованием FCS.
- Стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл) после 24 ч.
- Культура клетки в увлажненные инкубатора (5% CO2, 37 ° C). Ежедневно контролировать клетки при фокусировке на морфологические изменения.
- Замените свежей подогретым культуры носителей, содержащих TGF-β2 после 48 часов лечения с TGF-β в долгосрочной перспективе культуры средств массовой информации.
- Перейти к течению анализы. Как правило Даунрегуляция эндотелиальной маркеров и upregulation мезенхимальных маркеров наблюдаются после 48-72 ч лечения с TGF-β, и реорганизации актина наблюдается после 24 часов лечения.
2. иммуноцитохимическое анализ
- Сохранить клетки MS-1 в стандартной культуры условиях.
- Плита MS-1 клетки на 4 хорошо клетки культуры палата слайды на 1,0 x 103 клеток / колодец (1,7 см2). Слайды предварительно покрытых с желатином. Использование 0,5 – 1,0 мл культуры средств массовой информации за хорошо.
- Стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл) после 24 ч. При анализе участия рок в EndMT, добавьте рок ингибитор Y-27632 (10 мкм) 1 h предварительного лечения TGF-β. При оценке воздействия сигналов торможения TGF-β, может использоваться ингибитора киназы рецепторов TGF-β.
- Культура клетки в увлажненные инкубатора (5% CO2, 37 ° C). Реорганизация актина наблюдается в MS-1 клеток после 24 ч лечения с TGF-β. Другие изменения становятся очевидными после 48-72 ч лечения. 72 h культуры замените свежим СМИ, содержащий TGF-β после 48 часов лечения с TGF-β СМИ.
-
F-актина пятнать
- После 24 часов лечения TGF-β удалите СМИ, исправить клетки с параформальдегида 4% в однократном ПБС втечение 20 мин при комнатной температуре и промойте клетки с ПБС.
- Проинкубируйте с 0,2% Тритон X-100 5 минут при комнатной температуре.
- Промойте клетки три раза с ПБС.
- Проинкубируйте с Фаллоидин тетраметилродамина B Изотиоцианаты от бледная поганка, разбавленный 150-fold с блокирующий буфер за 1 ч при комнатной температуре.
- Промойте клетки три раза с ПБС.
- Пятно ядер с привязки нуклеиновой кислоты цианиновые красители для 5 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды и гора coverslips лицом вниз на слайде с помощью слайд монтаж средств массовой информации.
- Наблюдения с помощью конфокального микроскопа. Используйте для обнаружения флуоресценции Фаллоидин 543 Нм лазер и фильтр выбросов 560 – 615 Нм. Используйте 633 нм лазер и фильтра выбросов более чем 650 Нм для ядерных пятнать. После лечения с TGF-β будет соблюдаться формирования волокна толщиной стресс.
-
VE-Кадгерины и пятнать α-SMA
- После 72 ч TGF-β лечения, удаления средств массовой информации, исправить клетки с холодной 50% метанола и 50% ацетона (0,5 – 1,0 мл в колодец) за 5 мин.
- Промойте клетки три раза с ПБС (0,5 – 1,0 мл в колодец).
- Проинкубируйте с первичных антител в блокирующем буфере на ночь при 4 ° C в темноте по данным производителя рекомендуемая концентрация. Использование VE-Кадгерины моноклональных антител (BV13, разведение 1: 100) и конъюгированных Cy3 α-SMA моноклональных антител (1A4, разведение 1: 200)20.
- Промойте клетки три раза с ПБС.
- Инкубируйте клетки с зеленый краситель конъюгированных вторичное антитело для VE-Кадгерины антитела в блокирующем буфере 1 ч при комнатной температуре в темноте по данным производителя рекомендуемая концентрация.
- Промойте клетки три раза с ПБС.
- Пятно ядер с привязки нуклеиновой кислоты цианиновые красители для 5 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды и гора coverslips лицом вниз на слайде с помощью слайд монтаж средств массовой информации.
- Наблюдения с помощью конфокального микроскопа. Используйте для обнаружения α-SMA (Cy3) 543 Нм лазер и фильтр выбросов 560 – 615 Нм. Используйте для обнаружения VE-Кадгерины 488 нм лазер и фильтр выбросов 505 – 550 Нм. Обычно, после обращения с TGF-β лечения, уменьшение VE-Кадгерины сигналов и будет наблюдаться увеличение α-SMA сигналов.
3. трехмерные коллаген гель сужением Assay
- Выполняют культуры клеток MS-1 с/без TGF-β за 72 ч до пробирного сужением гель коллагена.
- Подготовить тип я гель коллагена на льду. Смесь холодной коллагена раствор, 10 x сосредоточены MEM среднего и коллаген разрежения буфер, содержащий 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3и 200 мм HEPES рН 7,4 на 8:1:1 соотношение.
- Смешайте 200 мл суспензии TGF-β-лечение эндотелиальных клеток (1.0 х 106 клеток/200 мкл) или управления и 800 мкл раствора гель коллагена. TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β2 (1 нг/мл) для суспензии клеток.
- Добавить 1,0 мл смеси в каждой скважине 12-ну культуры пластин и позволяют закрепить в инкубаторе при 37 ° C за 30-60 мин.
- После желатинизации наложение 1,0 мл MEM-α содержащий 10% FCS, 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 мкг/мл до плавать геля. TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β2 (1 нг/мл) в средствах массовой информации.
Примечание: Для TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β гель и культуры средств массовой информации. - Инкубируйте плавающей гели при 37 ° C в течение 48 часов.
- Сканирование изображений Гели от нижней части пластины с помощью сканера. Кроме того записи изображения с помощью цифровой камеры на фиксированном расстоянии выше Гели гели.
- Определить площадь поверхности геля на основе числа пикселей с помощью ImageJ. Выберите гель с помощью freehand selection или связанные выбор инструментов, или с использованием геля «изображение | Отрегулируйте | Цветовой порог» инструмент, а затем определить области применения геля «анализ | Мера» команда.
4. ингибирование Мирна мероприятий, основанных на Locked нуклеиновых кислот Мирна ингибиторы
- Сохранить клетки MS-1 в стандартной культуры условиях.
- Transfect к морю нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна ингибиторы, искусственных микроРНК дуплексы или малые интерферирующие РНК (20 или 50 Нм) с использованием реагентов липофекция согласно инструкции производителя. В наших предыдущих докладах26,27были описаны детали и источники Мирна ингибиторы LNA, искусственных микроРНК дуплексы и малые интерферирующие РНК. В MS-1 клетки transfection стандартные процедуры, основанные на инструкции изготовителя хорошо работать для введения LNA Мирна ингибиторы, искусственных микроРНК дуплексы или малые интерферирующие РНК.
- После 16-48 h стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл).
- Перейти к различных течению анализов, включая анализ выражения (последовательности РНК (РНК seq) анализы и количественного RT-PCR) РНК, иммуноцитохимическое и assay репортера. Вниз по течению анализы были описаны в наших предыдущих докладах20,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TGF-β является мощным индуктором EndMT в различных эндотелиальных клеток. После лечения в 24 ч с TGF-β в клетках МС-1 пятнать для F-актина показывает реорганизации актина стресс волокон (рис. 1A)20. Предварительной обработки с рок ингибитор Y-27632 подавляет всасывание актина реорганизации20. MS-1 эндотелиальных клеток меняются от классическая морфология булыжник как к мезенхимальных веретеновидной формы морфология после лечения TGF-β (рис. 1B). TGF-β-лечение клетки теряют контакт ячеек. После лечения с TGF-β для 48-72 ч иммуноцитохимическое анализы показывают снижение выражение VE-Кадгерины и увеличение выражение α-SMA (рис. 1 c). TGF-β резко Индуцирует экспрессию α-SMA уровня мРНК и белков в клетках MS-1 после 48-72 ч лечения (цифры 1 d и 1E). У млекопитающих TGF-β включает TGF-β1, 2 и 3 изоформы. Предыдущего исследования, с помощью мыши культивированный эндокарда подушки эксплантов показал, что TGF-β2 но не TGF-β3 является обязательным для преобразования эндокарда подушки клетки28. С другой стороны мы ранее сравнил эффекты трех изоформ на α-SMA выражения и подтвердил, что все изоформ аналогично индуцированную экспрессию α-SMA в MS-1 клетки20. Коллаген гель сужением пробирного показывает расширение сжатие коллагена типа, которую я гель клетками МС-1, после лечения TGF-β (Рисунок 1F). Этот эффект предполагает приобретение потенциала мезенхимальных клеток для того чтобы remodel внеклеточного матрикса. Эти функции являются отличительной черты EndMT20. В наших предыдущих доклада20лечение ингибитором рок Y-27632 сильно подавлены индукции мезенхимальных маркеры α-SMA и SM22α без сопутствующего подавления индукции других генов-мишеней TGF-β например фибронектин 1 и ММП-2.
EndMT представляет собой весьма динамичный процесс. В клетках МС-1 обратимы эффекты TGF-β на α-SMA выражение и морфологии; после лишения TGF-β α-SMA выражение уменьшается базальных уровней (рисунок 2A), и клетки восстановить булыжник как морфология (рис. 2B). Кроме того индукции EndMT и EMT ассоциируется с динамических изменений в секреторную способность несколько chemokines и цитокинов. Несколько воспалительных chemokines и включая CCL17, CX3CL1, CXCL16, цитокинов ИЛ-6 и Angptl2 индуцированных TGF-β в MS-1 клетки, которые мы ранее назначали EndMT связанные секреторной фенотип (EndMT-SP)26. Эта экспериментальная модель полезна для расследования предполагаемого регуляторы EndMT и EndMT-SP. Ранее мы изучили роль несколько интерферирующим в EndMT путем повышения или ингибирования Мирна деятельности26,27. В MS-1 клеток Мирна мероприятия можно надежно модулировать Мирна мимических олигонуклеотиды или ингибиторов на основе LNA Мирна, и несколько ниже по течению анализов, включая анализ РНК seq может быть легко выполнена (рис. 3). Основываясь на анализе интегративной транскриптом, мы ранее связаны конститутивно активных мир-31 с EndMT регулирование в MS-1 клетки26. РНК seq анализ показал что ингибирование мир-31 LNA Мирна ингибитор результаты в затухания индукции мезенхимальных маркеров (Рисунок 3А) и EndMT-SP генов (рис. 3 c), хотя это не влияет на всасывание обычных целевой фонд TGF-β гены фибронектин 1, PAI-1 и Smad7 (рис. 3B) и Даунрегуляция эндотелиальной маркеры (рис. 3D)26. TGF-β и мир-31 помощью Stk40, негативный регулятор NF-κB путь, который действует как потенциального регулятор EndMT-SP. Хотя Фонд TGF-β не увеличивает выражение мир-31, TGF-β индуцирует альтернативные сплайсингу опосредованной исключение внутреннего poly(A) последовательности в Stk40 3' УТР, укрепив тем самым нападения на Stk40 учредительный активных мир-31 и наконец подавления Stk4026. Кроме того мы рассмотрели ранее роли TGF-β-индуцибельной мир 27b в EndMT27. Ингибирование мир-27 подавлены upregulation мезенхимальных маркеров (Рисунок 3А) при воздействии на обычных TGF-β целевых генов, EndMT-SP генов, и эндотелиальных маркеров были маргинальным (цифры 3B, 3 C и 3D)27 .
Рисунок 1 : Индукция EndMT в MS-1 клеток путем TGF-β. (A) актин реорганизации в MS-1 клетки после 24 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (B) морфологический изменения в клетках MS-1 после 72 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (C) иммуноцитохимическое анализ для VE-Кадгерины и α-SMA в MS-1 клеток после 72 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (D, E) Изменения выражения в α-SMA, определяется Стандартный количественный анализ ПЦР-(D) и западной помарки анализа (E). (F) коллагена гель пробирного сужением. Отношение площади поверхности после 72 ч культуры с/без лечения TGF-β2 (1 нг/мл) к исходной поверхности отображаются. Масштаб баров = 20 мкм (A и C) и 200 мкм (B). Данные изменяются от Михира и др. 20. погрешностей представляют стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Обратимые эффекты TGF-β в клетках МС-1. Выражение mRNA α-SMA (A) и (B) морфологии клеток после вывода TGF-β2 в клетках МС-1. Масштаб баров = 200 мкм. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ РНК seq в клетках МС-1. После введения LNA Мирна ингибиторы и обращения с TGF-β2 (72 ч.) выполненных в26,27был РНК seq анализ. NC: отрицательный контроль. Показаны изменения выражения представитель генов (A, мезенхимальные маркеров; B, обычные TGF-β целевых генов; C, EndMT-SP генов; и D, эндотелиальные маркеров). FPKM (фрагментов на kilobase транскрипт на миллион сопоставленных прочтений) значения были нормализованы значениями контрольной пробы (LNA-NC без лечения TGF-β2). Планки погрешностей представляют стандартных отклонений.
| Тип ячейки | Состояние мезенхимальных маркер индукции | Ссылка |
| эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVEC) | Индукция средой мезенхимальных дифференциации (TGF-β 5 нг/мл, PDGF-BB 25 нг/мл), 5 – 21 дней. | Проектная и др. |
| кожный микрососудистой эндотелиальных клеток человека (HCMEC) | Индукции, TGF-β2 (10 нг/мл), без FBS, 2 дня. | Медичи и др. |
| эндотелиальные клетки человека коронарного (НСЕС) | Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), 6 дней. Ингибирование BMP-7. | Zeisberg и др. |
| эндотелиальные клетки мыши легких (ТЗЭТ) | Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), сократить до 2% FBS, без эндотелиальной Митоген, 2 дня. | Zeisberg и др. |
| эндотелиальные клетки мозга крысы (BEC) | Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), 2 дня. | Krizbai и др. |
| говядину аорты эндотелиальных клеток (КАЭБ) | Индукции, TGF-β1 (1 нг/мл), 5 дней. | Арсиньегас и др. |
| увековечен говядину микрососудистой эндотелиальных клеток сетчатки (iBREC) | Индукции, TGF-β2 (10 нг/мл), 3 – 6 дней. | Deissler и др. |
| эндотелиальные клетки баранину аортального клапана | Индукция TGF-β1 или 3 (1 нг/мл), 6 дней. | Параня и др. |
| Поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши MS-1 | Индукции, TGF-β (10 нг/мл), активированный РАН выражение, 1 день. | Хасимото и др. |
| Поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши MS-1 | Индукции, TGF-β2 (1 нг/мл), 2-3 дня. | Михира и др. |
Таблица 1: индукция EndMT TGF-β в различных клетках эндотелия. Кратко излагаются условия культуры EndMT индукции, TGF-β. Также отмечены изменения в условиях культуры, включая концентрацию сыворотки и добавление или удаление других факторов роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сообщается, что активированные ран и TGF-β лечения для 24 h индуцированных EndMT в клетках МС-1, в то время как TGF-β только удалось побудить EndMT в этот короткий период21. Последовательно мы наблюдали, что TGF-β существенно индуцированных EndMT после длительного лечения (48-72 ч) в MS-1 клетки20. EndMT неоднократно наблюдалось после длительного лечения с TGF-β (2 – 6 дней) в различных эндотелиальных клеток, таких как человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC), человеческого кожного микрососудистой эндотелиальных клеток (HCMEC), коронарный эндотелиальных клеток человека ( НСЕС), эндотелиальные клетки мыши легких (ТЗЭТ), эндотелиальные клетки мозга крысы (BEC), говядину аорты эндотелиальных клеток (КАЭБ), увековечен говядину микрососудистой эндотелиальные клетки сетчатки (iBREC) и баранину аортального клапана эндотелиальные клетки8, 18,29,30,,3132,,3334. В таблице 1мы кратко условия мезенхимальных маркер индукции, TGF-β в различных эндотелиальных клеток8,18,20,21,29, 30,,3132,,3334. Сравнение этих докладов свидетельствует о том, что каждая линия эндотелиальных клеток имеет различные пороговые значения для EndMT. Дифференциальный чувствительность TGF-β или другие механизмы могут лежать в основе различных патологических состояний, связанных с EndMT в различных органах. Это следует рассматривать вместе с результатами исследований в естественных условиях .
Детали в пробирке EndMT индукции протоколе должны быть адаптированы в различных клеточных линий: например., концентрация TGF-β, концентрации сыворотки, добавление или удаление других факторов роста и культуры периода. К примеру HUVECs часто плохо реагировать TGF-β и EndMT бы индуцированных сочетании с другими факторами, например, PDGF-BB и воспалительных стимулы и/или модуляции сывороточной концентрации и других компонентов среды в более культуры, установив29 , 35. Кроме того, overconfluency бы смягчить ответы TGF-β.
EndMT представляет собой динамичный процесс и противоположный процесс, называемый мезенхимы эндотелиальные перехода (MEndoT) был недавно сообщили36. Хотя индукции мезенхимальных маркеров, TGF-β только является обратимым в клетках МС-1 (рис. 2), было сообщено, что Даунрегуляция эндотелиальной маркеров в ячейках MS-1 с активированной РАН сохраняется после вывода TGF-β21. Необратимых EndMT также сообщалось в iBREC и баранину аортального клапана эндотелиальных клеток33,34. Кроме того предыдущий доклад показал, что процесс EndMT сохраняется после вывода TGF-β из-за постоянной активации рас-GTP и метилирования RASAL1 промоутер в эндотелиальных клеток человека коронарного37. Таким образом сравнение этих моделей может быть также полезно понять механизмы регулирования пластичности эндотелиальных клеток.
Оперативности эндотелиальных клеток к EndMT индукции, как представляется, существенно гетерогенных38. Xiao et al. сообщили, что опухоль – специфичные эндотелиальные клетки из опухоли молочной железы модели показывают различные формы EndMT в ответ на стимуляцию TGF-β38. TGF-β-driven EndMT модулируется также другие сигнальные пути, включая BMP-7 ФБП-2 и ИЛ 1β35,,3738. Мы также обнаружили, что TNF-α повышает TGF-β-индуцированной EndMT и EndMT-SP в MS-1 клетки26. Кроме того это хорошо известно, что EndMT индуцируется других сигнальных путей, включая Wnt, паз и гипоксия1. Таким образом сочетание с другими стимулами в различных эндотелиальных клеток может быть важно понимать неоднородность EndMT реакции.
Протокол EndMT, представленные здесь могут быть легко изменены для расследования регуляторов EndMT. В самом деле мы были характерны различные регуляторы EndMT в MS-1 клетки20,,2627. Фактор обменом нуклеотида гуанина Arhgef5 и myocardin связанных транскрипционный фактор-(MRTF-A) вызванных Smad сигналов, и способствуют upregulation α-SMA в MS-1 клетки20. Таким образом, Фонд TGF-β сигнализации активирует обоих ро сигналов и MRTF-A, чтобы заставить EndMT. Кроме того мы также обнаружили, что конститутивно активных мир-31 и TGF-β-индуцибельной мир 27b положительно регулировать EndMT индукции26,27. В MS-1 клеток конститутивно активных мир-31 необходима также для TGF-β-индуцированной EndMT-СП26. В целом эти в vitro процедуры индукции EndMT будет полезным для понимания биологии EndMT, определение EndMT связанных генов подписей и разработки стратегий для модуляции этот процесс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Zea Борок и Kohei Miyazono за предложения по подготовке рукописи. H.I.S. и M.H. поддерживаются Уэхара Мемориальный фонд исследовательских стипендий, и H.I.S. поддерживается Осаму Hayaishi Мемориал стипендии для обучения за рубежом. Эта работа была поддержана грант от фонда науки Такеда (А.С).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).
