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Biology

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.

Abstract

Plasticidad fenotípica de las células endoteliales es la base de desarrollo del sistema cardiovascular, enfermedades cardiovasculares y diversas condiciones asociadas con fibrosis del órgano. En estas condiciones, las células endoteliales diferenciadas adquieren mesenquimales como fenotipos. Este proceso se llama transición endotelio-mesénquima (EndMT) y se caracteriza por el downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos. EndMT es inducida por varias vías de señalización, incluyendo transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y Notch y regulados por mecanismos moleculares similares a los de transición epitelial-mesenquimal (EMT) importante para el gastrulation, fibrosis del tejido, y metástasis del cáncer. Comprensión de los mecanismos de EndMT es importante para desarrollar enfoques diagnósticos y terapéuticos dirigidos a EndMT. Fuerte inducción de EndMT en vitro es útil para caracterizar las firmas de expresión de genes comunes, identificar los mecanismos moleculares druggable y pantalla para moduladores de EndMT. Aquí, describimos un método en vitro para la inducción de EndMT. Células endoteliales microvasculares pancreático de ratón MS-1 se someten a EndMT después de la exposición prolongada a TGF-β y mostrar upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos, así como la inducción de citoquinas y quimiocinas inflamatorias múltiples. También se incluyen métodos para el análisis de microARN (miARN) modulación. Estos métodos proporcionan una plataforma para investigar mecanismos subyacentes a EndMT y el aporte de miRNAs a EndMT.

Introduction

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Transición mesenquimal endotelial (EndMT) es el proceso por el que un distinguido de la célula endotelial sufre una variedad de cambios moleculares, lo que resulta en un fibroblasto-como de células mesenquimales1. EndMT fue descrito inicialmente como una transformación de la célula endotelial durante el desarrollo del corazón2,3. En el temprano desarrollo del corazón, el tubo del corazón consiste en un endocardio interno y un externo miocardio. Estas dos capas están separadas por una capa de matriz extracelular llamada la gelatina cardiaca. Las células embrionarias del Canal auriculoventricular, que adquieren marcadores de células endoteliales, tránsito en las células mesenquimales, invaden la gelatina cardiaca subyacente y promoción la formación de las almohadillas cardiacas, proporcionando la base para las válvulas auriculoventriculares y tabique y las válvulas semilunares. Además, EndMT ha sugerido que las fuentes del pericitos y células musculares lisas vasculares en otros sistemas vasculares embrionarios incluyendo los vasos coronarios, aorta abdominal y arteria pulmonar4,5,6. Además, EndMT está implicado en angiogénicos fisiológicos germinación7.

Acumulación de evidencia ha sugerido que EndMT también está implicado en varias enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades1,8. Afecciones asociadas con la EndMT incluyen calcificación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial pulmonar, malformación cavernosa, fibrosis del órgano, remodelación de injerto de vena, disfunción del aloinjerto en trasplante de riñón y cáncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un informe reciente describió que varios marcadores moleculares de EndMT pueden ser una herramienta para la predicción del diagnóstico y pronóstico de la disfunción del injerto renal en riñón trasplante17. Modulación de vías de señalización celulares relacionados con el EndMT se han demostrado para mejorar varias condiciones de enfermedad incluyendo fibrosis cardiaca y vena del injerto remodelación en animales modelos8,15. Por lo tanto, comprensión de los mecanismos EndMT subyacente es importante desarrollar estrategias diagnósticas y terapéuticas dirigidas a EndMT.

EndMT se caracteriza por la pérdida de las ensambladuras de la célula, aumento en el potencial migratorio, desregulación de genes endoteliales específicos como VE-cadherina y upregulation de los genes mesenquimales incluyendo la actinia del músculo liso de α (α-SMA). Además, EndMT y transición epitelial-mesenquimal (EMT), un proceso similar que convierte las células epiteliales para las células mesenquimales, se asocian con producción alterada de los diversos componentes de la matriz extracelular, que pueden contribuir al desarrollo de tejido fibrosis8,19.

Recientemente, varios estudios en vitro de EndMT han aclarado los detalles de los mecanismos moleculares de la EndMT15,20. EndMT es inducida por varias vías de señalización como transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y muesca1. Entre ellos, TGF-β juega un papel fundamental en la inducción de la EMT y EndMT. En EndMT, la exposición prolongada a resultados de TGF-β en EndMT en diversas células endoteliales, mientras que el corto de la exposición parece ser insuficiente21. Aquí describimos un protocolo sencillo para la inducción de EndMT, en que 1 milla de SVEN (MS-1) células endoteliales microvasculares pancreáticas de ratón se someten a EndMT en vitro después de la exposición prolongada a TGF-β20. En este modelo, se pueden realizar múltiples análisis aguas abajo para investigar características del sello de EndMT, incluyendo cambios morfológicos, downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de los genes inflamatorios, citoesqueleto y marcadores mesenquimales los cambios y contracción del gel de colágeno.

MicroRNAs (miRNAs) son ~ 22 nt small RNAs reguladoras que represión postranscripcional de varios mRNA objetivos22,23. A través del reconocimiento de semillas mediada por la secuencia blanco, miRNAs suprimir cientos de genes diana y modula diversas funciones celulares como la diferenciación celular, proliferación y motilidad. Este es también el caso para la regulación de la EMT y EndMT, y varios miRNAs se han divulgado como reguladores de la EMT y EndMT24,25. El modelo de EndMT presentado en esta revisión se puede combinar fácilmente con procedimientos de la modulación de miRNA para probar las funciones de miRNAs en EndMT. La presente revisión resume los procedimientos experimentales para investigar EndMT inducida por el TGF-β en las células MS-1 y también incluye la comparación de las condiciones de inducción de EndMT por TGF-β en otras células endoteliales.

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Protocol

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1. inducción de EndMT

  1. Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar y evitar la confluencia. Una fuente de células MS-1 se describe en la Tabla de materiales. Para las celdas de MS-1, usar medio-α mínimo esencial (MEM-α) con 10% de suero fetal de ternero (FCS), 50 U/mL de penicilina y 50 de μg/mL estreptomicina.
  2. Células de lavado MS-1 en 10 cm plato con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y añadir 1,0 mL de tripsina a la placa. Incubar por 5 min a 37 ° C.
  3. Separar las células con 9 mL de medio de cultivo. Recoger la suspensión de células en un tubo de 15 mL.
  4. Centrifugue la suspensión celular en 300-400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y suspender el precipitado de células en medios de cultivo precalentado.
  6. Contar las células viables usando la solución de azul de tripano y un hemocitómetro estándar o un contador celular automático.
  7. Células de la placa MS-1 en placas de cultivo estándar sin recubrimiento de 0.5 x 103 células por cm2 para el cultivo de término largo. Por ejemplo, células de3 placa de 5.0 x 10 por pozo en una 6 cultura bien la placa. Utilizar los mismos medios de cultivo incluyendo la misma concentración de FCS. En las células MS-1, TGF-β induce EndMT en cultura a largo plazo (al menos 48-72 h) con el uso de FCS.
  8. Estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL) después de 24 h.
  9. Células en cultivo en una incubadora humidificada (5% CO2, 37 ° C). Supervisar diariamente las células cuando centrándose en cambios morfológicos.
  10. Sustituir los medios de comunicación con fresco con los medios de cultivo que contiene TGF-β2 después de 48 h de tratamiento con TGF-β en la cultura a largo plazo.
  11. Proceder a los análisis posteriores. Por lo general, reorganización de la actina se observa después de 24 h de tratamiento, y downregulation de marcadores endoteliales y upregulation de marcadores mesenquimales se observan después de 48-72 h de tratamiento con TGF-β.

2. Análisis de Immunocytochemical

  1. Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar.
  2. Las células de la placa MS-1 a 4 células bien diapositivas cámara de cultura en 1.0 x 103 células por pocillo (1.7 cm2). Diapositivas se encuentran sensibilizadas con gelatina. Uso 0,5 – 1,0 mL de medios de cultivo por pozo.
  3. Estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL) después de 24 h. Al analizar la participación de roca en EndMT, agregue a un antes de 1 h ROCK inhibidor de la Y-27632 (10 μM) para tratamiento de TGF-β. Al evaluar el efecto de la inhibición de señalización de TGF-β, pueden utilizarse inhibidores de quinasa del receptor de TGF-β.
  4. Células en cultivo en una incubadora humidificada (5% CO2, 37 ° C). Reorganización de la actina se observa en las células 1 MS después de 24 h de tratamiento con TGF-β. Otros los cambios se hacen evidentes después de 48-72 h de tratamiento. Para el cultivo de 72 h, sustituir los medios de comunicación con medio fresco que contiene TGF-β después de 48 h de tratamiento con TGF-β.
  5. La coloración de la F-actina
    1. Después de 24 h de tratamiento TGF-β, eliminar los medios de comunicación, fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS 1 x por 20 min a temperatura ambiente y lavar las células con PBS 1 x.
    2. Incubar con 0,2% Tritón X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.
    4. Incubar con phalloidin-tetramethylrhodamine B isotiocianato de phalloides de la Amanita 150-fold diluido con solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
    5. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.
    6. Se tiñen los núcleos con tintes de unión del ácido nucleico de Cianina por 5 min a temperatura ambiente.
    7. Enjuague portaobjetos y cubreobjetos de Monte cara abajo sobre un portaobjetos utilizando medios de montaje de la diapositiva.
    8. Observar con un microscopio confocal. Usar láser 543 nm y un filtro de emisión de 560 – 615 nm para la detección de la fluorescencia de phalloidin. Uso de láser 633 nm y un filtro de emisión de más de 650 nm para la tinción nuclear. Sobre el tratamiento con TGF-β, se observaría la formación de fibras de estrés gruesa.
  6. VE-cadherina y la coloración de la α-SMA
    1. Después de 72 h de tratamiento TGF-β, eliminar los medios de comunicación, fijar las células con frío 50% de metanol y acetona al 50% (0.5 – 1.0 mL por pozo) durante 5 minutos.
    2. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x (0.5 – 1.0 mL por pozo).
    3. Incubar con anticuerpos primarios en solución amortiguadora de bloqueo durante la noche a 4 ° C en la oscuridad según la concentración recomendada del fabricante. Uso de anticuerpo monoclonal de VE-cadherina (BV13, dilución 1: 100) y α-SMA Cy3-conjugado anticuerpo monoclonal (1A4, dilución 1: 200)20.
    4. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.
    5. Incubar las células con un anticuerpo secundario conjugado con tinte verde a VE-cadherina anticuerpo en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad según la concentración recomendada del fabricante.
    6. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.
    7. Se tiñen los núcleos con tintes de unión del ácido nucleico de Cianina por 5 min a temperatura ambiente.
    8. Enjuague portaobjetos y cubreobjetos de Monte cara abajo sobre un portaobjetos utilizando medios de montaje de la diapositiva.
    9. Observar con un microscopio confocal. Utilizando láser 543 nm y un filtro de emisión de 560 – 615 nm para la detección de α-SMA (Cy3). Para la detección de VE-cadherina, utilice láser 488 nm y un filtro de emisión de 505-550 nm. Por lo general, sobre el tratamiento con el tratamiento de TGF-β, disminución de la VE-cadherina señales y se observaría un aumento en las señales de la α-SMA.

3. ensayo de contracción de Gel de colágeno tridimensional

  1. Realizar cultivo de células de 1 MS con o sin TGF-β durante 72 h antes del ensayo de contracción de gel de colágeno.
  2. Preparar el tipo gel de colágeno en el hielo. Mezclar solución de colágeno frío, 10 x concentrado MEM medio y tampón de dilución de colágeno que contiene 0,05 N NaOH, 2.2% de NaHCO3y 200 mM HEPES pH 7.4 un 8:1:1 ratio.
  3. Mezclar 200 mL de control o suspensiones de células endoteliales tratadas con TGF-β (1.0 x 106 células/200 μL) y 800 μl de la solución del gel de colágeno. Para TGF-β muestras tratadas, añadir TGF-β2 (1 ng/mL) a la suspensión de células.
  4. Añadir 1,0 mL de la mezcla a cada pozo de pozo de 12 placas y dejar para solidificar en la incubadora a 37 ° C durante 30 – 60 min.
  5. Después de la gelatinización, superposición de 1,0 mL de MEM-α que contiene 10% FCS, 50 U/mL de penicilina y estreptomicina 50 μg/mL para flotar el gel. Para TGF-β muestras tratadas, añadir TGF-β2 (1 ng/mL) a los medios de comunicación.
    Nota: Para las muestras tratada de TGF-β, agregar TGF-β en el gel y los medios de cultivo.
  6. Incubar los geles flotantes a 37 ° C durante 48 h.
  7. Escanear las imágenes de los geles de la parte inferior de las placas mediante un escáner. También puede grabar las imágenes de geles con una cámara digital a una distancia fija por encima de los geles.
  8. Cuantificar la superficie de gel basada en número de píxeles con ImageJ. Seleccione el gel utilizando una selección a mano alzada o herramientas de selección, o seleccione el gel mediante "imagen | Ajustar | Umbral del color"de la herramienta y luego determinar el área de la utilización de gel" analizar | Comando de medida".

4. inhibición de miRNA actividades por miRNA bloqueado-basados en ácidos nucleicos inhibidores

  1. Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar.
  2. Transfectar ácido nucleico bloqueado (LNA) inhibidores de la miRNA, miRNA sintético dúplex o siRNAs (20 o 50 nM) lipofection reactivos según las instrucciones del fabricante. Datos y fuentes de LNA miRNA inhibidores sintéticos miRNA dúplex y siRNAs fueron descritas en nuestros anteriores informes26,27. En las células MS-1, procedimientos de transfección estándar basados en las instrucciones del fabricante funcionan bien para introducción de LNA inhibidores de miRNA, miRNA sintético dúplex o siRNAs.
  3. Después de 16-48 h, estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL).
  4. Proceder a distintos análisis aguas abajo, incluyendo análisis de la expresión (RT-PCR cuantitativa y análisis de RNA-secuencia (RNA-seq)) RNA, análisis de immunocytochemical y ensayo de reportero. Análisis posteriores se han descrito en nuestros anteriores informes20,26,27.

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Representative Results

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TGF-β es un potente inductor de EndMT en diversas células endoteliales. Después del tratamiento de 24 h con TGF-β en las células MS-1, tinción para actina F muestra reorganización de la actina estrés las fibras (figura 1A)20. Tratamiento previo con un inhibidor de la roca Y-27632 inhibe la inducción de actina reorganización20. Las células endoteliales MS-1 cambian de una clásica morfología de adoquines-como a una morfología mesenquimal fusiformes sobre el tratamiento de TGF-β (figura 1B). Células tratadas con TGF-β pierden el contacto célula-célula. Después del tratamiento con TGF-β durante 48-72 h, análisis de immunocytochemical demuestran expresión disminuida de VE-cadherina y aumento de la expresión de α-SMA (figura 1). Drásticamente, TGF-β induce la expresión de α-SMA en los niveles de mRNA y proteína en las células MS-1 después de 48-72 h de tratamiento (figuras 1 y 1E). Mamíferos de TGF-β incluye TGF-β1, 2 y 3 isoformas. Un estudio previo utilizando explantes de ratón cultivado endocárdico ha demostrado que el TGF-β2 pero no TGF-β3 es obligatorio para la transformación de las células de endocárdico28. Por otro lado, anteriormente en comparación con los efectos de tres isoformas para la expresión de α-SMA y confirmó que isoformas todos igualmente induce expresión de α-SMA en las células de MS-120. Ensayo de contracción de gel de colágeno muestra mayor contracción de colágeno de tipo que gel por MS-1 células después del tratamiento de TGF-β (Figura 1F). Este efecto sugiere la adquisición de la capacidad de las células mesenquimales para remodelar la matriz extracelular. Estas características son rasgos distintivo de EndMT20. En nuestro anterior informe20, tratamiento con un inhibidor Y-27632 de la roca fuertemente había reprimida inducción de marcadores mesenquimales α-SMA y SM22α sin concomitante supresión de la inducción de otros genes diana de TGF-β como fibronectina 1 y MMP-2.

EndMT es un proceso altamente dinámico. En las células MS-1, los efectos del TGF-β en α-SMA expresión y morfología son reversibles; después de la privación de TGF-β, α-SMA expresión disminuye a niveles basales (figura 2A) y las células recupera una guijarro-como morfología (figura 2B). Además, la inducción de EndMT y EMT está asociada con cambios dinámicos en la capacidad secretora de múltiples quimiocinas y citocinas. Varias quimiocinas inflamatorias y citocinas incluyendo CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 y Angptl2 son inducidas por el TGF-β en las células MS-1, que previamente señalamos fenotipo secretor asociados EndMT (EndMT-SP)26. Este modelo experimental es útil para investigar los supuestos reguladores de EndMT y EndMT-SP. Anteriormente hemos estudiado el papel de varios miRNAs en EndMT por aumento o inhibición de miRNA actividades26,27. En MS-1 células, miRNA actividades pueden modular robusta por miRNA mímica oligonucleótidos o inhibidores de miRNA basada en LNA, y múltiples análisis aguas abajo, incluyendo análisis de RNA-seq pueden ser fácilmente realizados (figura 3). Basado en el análisis del transcriptoma integradora, nos hemos vinculado previamente constitutivamente activa miR-31 Reglamento EndMT en MS-1 células26. Análisis de RNA-seq demostrado que la inhibición de miR-31 por LNA miRNA inhibidor resultados en atenuación de la inducción de genes de EndMT-SP (figura 3) y marcadores mesenquimales (Figura 3A), mientras que no afecta la inducción convencional blanco de TGF-β genes como fibronectina 1, PAI-1 y Smad7 (figura 3B) y el downregulation de marcadores endoteliales (figura 3D)26. TGF-β y miR-31 downregulate Stk40, un regulador negativo de la vía NF-κB, que actúa como un potencial regulador de EndMT-SP. Aunque TGF-β no aumenta la expresión de miR-31, TGF-β induce exclusión mediada por poliadenilación alternativa de secuencia interna poly(A) Stk40 3' UTR, potenciando así orientación de Stk40 constitutivo activa miR-31 y finalmente suprimiendo Stk4026. Además, previamente examinamos el papel de TGF-β-inducible miR-27b EndMT27. Inhibición de miR-27 suprimido upregulation de marcadores mesenquimales (Figura 3A) mientras que los efectos sobre la convencionales genes de la blanco de la TGF-β, genes EndMT-SP, y marcadores endoteliales fueron marginales (figuras 3B, 3C y 3D)27 .

Figure 1
Figura 1 : Inducción de EndMT en MS-1 células por TGF-β. (A) reorganización de la actina en MS-1 células después de 24 h de tratamiento TGF-β2 (1 ng/mL). Morfológicas (B) cambios en las células 1 MS después de 72 h de tratamiento TGF-β2 (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analiza para VE-cadherina y α-SMA en las células 1 MS después de 72 h de tratamiento TGF-β2 (1 ng/mL). (D, E) Cambios de la expresión de α-SMA, determinado por análisis de RT-PCR cuantitativa estándar (D) y Western blot análisis (E). Ensayo de contracción del gel del colágeno (F). Se muestran la proporción de la superficie después de la cultura 72 h con o sin tratamiento de TGF-β2 (1 ng/mL) a la superficie original. Barras de escala = 20 μm (A y C) y 200 μm (B). Cifras se modifican de Mihira et al. 20. barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Efectos reversibles de TGF-β en las células MS-1. La expresión del mRNA α-SMA (A) y (B) morfología de la célula tras la retirada del TGF-β2 en células MS-1. Barras de escala = 200 μm. Barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análisis de RNA-seq en las células MS-1. Después de la introducción de los inhibidores de miRNA LNA y tratamiento con TGF-β2 (72 h), análisis de RNA-seq fue realizado26,27. NC: control negativo. Cambios de expresión de los genes representativos se muestran en (A, marcadores mesenquimales; Bconvencionales genes de la blanco del TGF-β; C, genes EndMT-SP; y D, marcadores endoteliales). Valores FPKM (fragmentos por kilobase de transcripción por lecturas asignadas millones) fueron normalizados con los valores de una muestra de control (LNA-NC sin tratamiento TGF-β2). Barras de error representan desviaciones estándar.

Tipo de la célula Condición de inducción marcador mesenquimal Referencia
células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) Inducción por medio de diferenciación mesenquimal (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5-21 días. Krenning et al.
células endoteliales microvasculares cutáneas humanas (HCMEC) Inducción de TGF-β2 (10 ng/mL), sin SFB, 2 días. Medici et al.
células endoteliales coronarias humanas (HCEC) Inducción de TGF-β1 (10 ng/mL), 6 días. Inhibición por BMP-7. Zeisberg et al.
células endoteliales de pulmón de ratón (LMCE) Inducción de TGF-β1 (10 ng/mL), reducir al 2% FBS, sin mitógeno endotelial, 2 días. Zeisberg et al.
células endoteliales de cerebro de rata (BEC) Inducción de TGF-β1 (10 ng/mL), 2 días. Krizbai et al.
células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) Inducción de TGF-β1 (1 ng/mL), 5 días. Arciniegas et al.
inmortalizadas bovinas microvasculares endoteliales células de la retina (iBREC) Inducción de TGF-β2 (10 ng/mL), 3-6 días. Deissler et al.
células endoteliales aórticas ovina Inducción de TGF-β1 o 3 (1 ng/mL), 6 días. Paranya et al.
Células endoteliales microvasculares pancreático de ratón MS-1 Inducción de TGF-β (10 ng/mL), activa la expresión de Ras, 1 día. Hashimoto et al.
Células endoteliales microvasculares pancreático de ratón MS-1 Inducción de TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 días. Mihira et al.

Tabla 1: inducción de EndMT por TGF -β en células endoteliales diferentes. Se resumen las condiciones de cultivo de EndMT inducción de TGF-β. También se observan cambios en las condiciones de cultivo como concentración de suero y adición o eliminación de otros factores de crecimiento.

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Discussion

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Se ha divulgado que activado tratamiento Ras y TGF-β durante 24 h inducida por EndMT en células de MS-1, mientras que TGF-β solo ha podido inducir EndMT en este corto período21. Constantemente, observamos que TGF-β sustancialmente inducida por EndMT después de un tratamiento más largo (48-72 h) en MS-1 células20. EndMT se ha observado repetidamente después de tratamiento prolongado con TGF-β (2-6 días) en diversas células endoteliales como umbilical humana de las células endoteliales (HUVEC), humanas células endoteliales microvasculares cutáneas (HCMEC), células endoteliales coronarias humanas (la vena HCEC), células endoteliales de pulmón de ratón (LMCE), células endoteliales de cerebro de rata (BEC), células endoteliales aórticas bovinas (BAEC), inmortalizadas bovinas microvasculares endoteliales células de la retina (iBREC) y ovinos aórtica válvula células endoteliales8, 18,29,30,31,32,33,34. En la tabla 1, resumimos las condiciones de inducción del marcador mesenquimal por TGF-β en diversas células endoteliales8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. La comparación de estos informes indica que cada línea celular endotelial tiene diferentes umbrales para EndMT. Sensibilidad diferencial a la TGF-β u otros mecanismos puede subyacer diversas condiciones patológicas relacionadas con el EndMT en diferentes órganos. Esto se debe considerar junto con los resultados de los estudios en vivo .

Los detalles de en vitro EndMT protocolo de inducción deben ser adaptados en diferentes líneas celulares: por ej., concentración de TGF-β, concentración de suero, adición o eliminación de otros factores de crecimiento y cultura. Por ejemplo, HUVECs a menudo responden a TGF-β y EndMT inducida por la combinación con otros factores tales como PDGF-BB y estímulos inflamatorios o modulación de la concentración del suero y otros componentes del medio en una cultura más ajuste de29 , 35. Además, overconfluency mitigaría las respuestas a TGF-β.

EndMT es un proceso dinámico y un proceso opuesto llamado transición mesenquimal endotelial (MEndoT) ha sido recientemente reportado36. Mientras que la inducción de los marcadores mesenquimales por TGF-β sólo es reversible en las células MS-1 (figura 2), se ha divulgado eso downregulation de marcadores endoteliales en MS-1 células con Ras activado persistió tras la retirada del TGF-β21. EndMT irreversible se ha divulgado también en iBREC y ovinos de la válvula aórtica células endoteliales33,34. Además, un informe anterior demostró que el proceso de EndMT persistió tras la retirada del TGF-β debido a una activación sostenida de la Ras-GTP y la metilación del promotor en células endoteliales coronarias humanas37RASAL1. Así, la comparación de estos modelos puede ser también útil para entender los mecanismos de regulación de la plasticidad de la célula endotelial.

Capacidad de respuesta de las células endoteliales a EndMT inducción parece ser substancialmente heterogéneos38. Xiao et al. divulgó que las células endoteliales tumorales de un modelo de tumor mamario muestran formas distintas de EndMT en respuesta al TGF-β estimulación38. EndMT impulsada por el TGF-β es también modulada por otras vías de señalización como FGF-2 y BMP-7, IL-1β35,37,38. También se encontró que el TNF-α aumenta la EndMT inducida por el TGF-β y EndMT-SP en MS-1 células26. Además, es bien sabido que EndMT es inducida por otras vías de señalización como hipoxia, Wnt y Notch1. Así, junto con otros estímulos en varias células endoteliales puede ser importante para comprender la heterogeneidad de la respuesta de EndMT.

El protocolo de EndMT presentado aquí puede modificarse fácilmente para investigar los reguladores del EndMT. De hecho, se han caracterizado varios reguladores de EndMT en el MS-1 células20,26,27. Un factor de intercambio de nucleótido de guanina Arhgef5 y un factor de transcripción relacionado con myocardin-(MRTF-A) es inducida por señales de Smad, y ambos contribuyen al upregulation de α-SMA en las células de MS-120. Por lo tanto, señalización de TGF-β activa ambas señales de Rho y MRTF-A para inducir EndMT. Además, también se encontró que constitutivamente activa miR-31 y TGF-β-inducible miR-27b regulan positivamente EndMT inducción26,27. En las células MS-1, también es necesario inducida por el TGF-β EndMT-SP26constitutivamente activa miR-31. En general, estos procedimientos de inducción en vitro EndMT sería útiles para entender la biología de EndMT, identificar firmas de gen EndMT asociados y desarrollo de estrategias para modular este proceso.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos Zea Borok y Kohei Miyazono sugerencias en la preparación del manuscrito. H.I.S. y M.H. son compatibles con la beca de investigación Fundación Uehara Memorial y H.I.S. es apoyada por Osamu Hayaishi Memorial Scholarship para estudio en el extranjero. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de ciencia de Takeda (A.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

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References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42, (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77, (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80, (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12, (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35, (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13, (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125, (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129, (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131, (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498, (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225, (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6, (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67, (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18, (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151, (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43, (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88, (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149, (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9, (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109, (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21, (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161, (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248, (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29, (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437, (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10, (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103, (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18, (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159, (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218, (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514, (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105, (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75, (7), 1244-1254 (2015).
Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β
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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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