Summary
Ett protokoll för in vitro- induktion av endothelial-mesenkymala transition (EndMT), som är användbar för att undersöka cellulära signalvägar involverade i EndMT, beskrivs. I denna experimentella modell induceras EndMT genom behandling med TGF-β i MS-1 endotelceller.
Abstract
Fenotypisk plasticitet av endotelceller ligger bakom hjärt-systemutveckling, hjärt-och kärlsjukdomar och olika villkor som är förknippade med orgel fibros. I dessa villkor förvärva differentierade endothelial celler mesenkymala-liknande fenotyper. Denna process kallas endotel-mesenkymala övergången (EndMT) och kännetecknas av nedreglering av endothelial markörer, uppreglering av mesenkymala markörer och morfologiska förändringar. EndMT framkallas av flera signalvägar, inklusive omvandla tillväxtfaktor (TGF)-β, Wnt, och Notch, och regleras av molekylära mekanismer liknar epitelial-mesenkymala övergången (EMT) viktigt för gastrulation, vävnad fibros, och cancer metastaser. Förstå mekanismerna bakom EndMT är viktigt att utveckla diagnostiska och terapeutiska metoder inriktade EndMT. Robust induktion av EndMT in vitro- är användbart att karakterisera vanliga gen uttryck signaturer, identifiera druggable molekylära mekanismer och skärm för modulatorer av EndMT. Här beskriver vi en in vitro- Metod för induktion av EndMT. MS-1 mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller genomgår EndMT efter långvarig exponering för TGF-β och Visa uppreglering av mesenkymala markörer och morfologiska förändringar såväl induktion av flera inflammatoriska chemokiner och cytokiner. Metoder för analys av mikroRNA (miRNA) moduleringen ingår också. Dessa metoder ger en plattform för att undersöka mekanismerna bakom EndMT och bidrag MicroRNA till EndMT.
Introduction
Endothelial-mesenkymala övergången (EndMT) är den process genom vilken en differentierad endothelial cellen genomgår en mängd molekylära förändringar, vilket resulterar i en fibroblast-liknande mesenkymala cell1. EndMT beskrevs ursprungligen som en endotelceller omvandling under utvecklingen av hjärtat2,3. I tidig utveckling av hjärtat består hjärtat röret av en inre endocardium och en yttre myokardiet. Dessa två lager skiljs åt av ett lager av extracellulär matrix som kallas hjärt gelé. De endokardiella embryoceller, som förvärvar endotelceller markörer, transitering till mesenkymala celler, invadera underliggande hjärt gelé och främja bildandet av hjärt kuddarna, som tillhandahåller grunden för atrioventrikulärt ventiler och septum och semilunar ventiler. Dessutom har EndMT föreslagits vara källor av pericyter och vaskulära glatta muskelceller i andra embryonala vaskulära system inklusive koronar fartyg, bukaorta och lungartären4,5,6. EndMT är dessutom inblandad i fysiologiska angiogena groning7.
Ackumulerande bevis har föreslagit att EndMT också är involverad i flera hjärt-och kärlsjukdomar och andra sjukdomar1,8. EndMT-associerade villkor omfattar vaskulär förkalkning, åderförkalkning, pulmonell arteriell hypertension, cavernous missbildningar, orgel fibros, ven transplantat remodeling, transplantatavstötning dysfunktion i njurtransplantation och cancer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en färsk rapport beskrivs att flera molekylära EndMT markörer kan vara ett verktyg för diagnos och prognos Prediktion av nedsatt transplantatdysfunktion i njur transplantation17. Modulering av EndMT-relaterade cellulära signalvägar har visat sig lindra flera sjukdomstillstånd inklusive hjärtfibros och ven transplantat remodeling i djur modeller8,15. Därför är förstå mekanismerna underliggande EndMT viktigt att utveckla diagnostiska och terapeutiska strategier inriktade EndMT.
EndMT kännetecknas av förlust av cell-cell korsningar, flyttande potentiella ökningen, nedreglering av endothelial-specifika gener som VE-cadherin och uppreglering av mesenkymala gener inklusive α-smooth muscle aktin (α-SMA). Dessutom är EndMT och epitelial-mesenkymala övergång (EMT), en liknande process som konverterar epitelceller till mesenkymala celler, associerade med förändrad produktion av olika extracellulär matrix komponenter, som kan bidra till utvecklingen av vävnad fibros8,19.
Flera in vitro- studier av EndMT har nyligen klarlagts Detaljer av molekylära mekanismer av EndMT15,20. EndMT framkallas av olika signalvägar inklusive omvandla tillväxtfaktor (TGF)-β, Wnt, och Notch1. Bland dem spelar TGF-β avgörande roller i induktion av både EMT och EndMT. I EndMT, långvarig exponering för TGF-β resultat i EndMT i olika endotelceller, medan kort exponering tycks vara otillräckliga21. Vi beskrivit här ett enkelt protokoll för EndMT induktion, där MILE SVEN 1 (MS-1) mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller genomgår EndMT in vitro- efter långvarig exponering för TGF-β20. I denna modell, kan flera efterföljande analyser utföras för att undersöka hallmark funktioner i EndMT, inklusive morfologiska förändringar, nedreglering av endothelial markörer, uppreglering av mesenkymala markörer och inflammatoriska gener, cytoskeletal omflyttningar och kollagen gel kontraktion.
MikroRNA (Mirna) är ~ 22 nt små reglerande RNAs att direkt från förtryck av olika mRNA mål22,23. Genom utsäde sekvens-medierad prismalås, MicroRNA undertrycka hundratals målgener och modulera olika cellulära funktioner såsom celldifferentiering, spridning och motilitet. Detta är också fallet för förordning av EMT och EndMT, och flera MicroRNA har rapporterats som tillsynsmyndigheter EMT och EndMT24,25. Den EndMT modellen presenteras i denna översyn kan enkelt kombineras med miRNA modulering förfaranden att testa MicroRNA roller i EndMT. Denna översyn summerar våra experimentella rutiner för att undersöka TGF-β-inducerad EndMT i MS-1 celler och även innehåller jämförelse av villkorar av EndMT induktion av TGF-β i andra endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. induktion av EndMT
- Upprätthålla MS-1 celler i standard odlingsbetingelser och undvika konfluens. En källa till MS-1 celler beskrivs i Tabell för material. För MS-1 celler, använder du minst viktigt Medium-α (MEM-α) med 10% fetalt kalvserum (FCS), 50 U/mL penicillin och 50 μg/mL streptomycin.
- Tvätta MS-1 celler på 10 cm skålen med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 1,0 mL av trypsin till plattan. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Lossa cellerna med 9 mL odlingssubstrat. Samla cellsuspension i en 15 mL tub.
- Centrifugera cellsuspension på 300 – 400 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Försiktigt avlägsna supernatanten och centrifugerade cell i förväg värmde kultur media.
- Räkna viabla celler med Trypan blå lösning och en standard hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
- Plattan MS-1 celler på obestruket standard kultur plattor på 0,5 x 103 celler per cm2 för lång sikt kultur. Till exempel kultur plattan 5.0 x 103 celler per brunn i en 6 väl plattan. Använd samma kultur media inklusive samma koncentration av FCS. I MS-1 celler inducerar TGF-β EndMT i lång sikt kultur (minst 48-72 h) med användning av FCS.
- Stimulera endotelceller med TGF-β2 (en slutlig koncentration på 1 ng/mL) efter 24 h.
- Kultur celler i en fuktad inkubator (5% CO2, 37 ° C). Övervaka celler dagligen när man fokuserar på morfologiska förändringar.
- Byt ut materialet med färska pre värmde kultur media som innehåller TGF-β2 efter 48 h behandling med TGF-β i lång sikt kultur.
- Gå vidare till de efterföljande analyserna. Normalt aktin omorganisation observeras efter 24 h behandling och nedreglering av endothelial markörer och uppreglering av mesenkymala markörer observeras efter 48-72 h behandling med TGF-β.
2. Immunocytochemical analys
- Upprätthålla MS-1 celler i standard odlingsbetingelser.
- Plattan MS-1 celler på 4 cell väl kultur avdelningen bilder på 1,0 x 103 celler per brunn (1,7 cm2). Diabilder är pre belagda med gelatin. Använd 0,5 – 1,0 mL av kultur media per brunn.
- Stimulera endotelceller med TGF-β2 (en slutlig koncentration på 1 ng/mL) efter 24 h. När man analyserar medverkan av ROCK i EndMT, lägga till TGF-β behandling en ROCK hämmare Y-27632 (10 μM) 1 h tidigare. Vid bedömningen av effekten av TGF-β signalering hämning, kan TGF-β receptor kinashämmare användas.
- Kultur celler i en fuktad inkubator (5% CO2, 37 ° C). Aktin omorganisation observeras i MS-1 celler efter 24 h behandling med TGF-β. Andra förändringar blivit uppenbart efter 48-72 h behandling. För 72 h kultur, ersätta mediet med färska media som innehåller TGF-β efter 48 h behandling med TGF-β.
-
F-aktin färgning
- Efter 24 h TGF-β behandling, ta bort media, fixa celler med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS i 20 min i rumstemperatur och skölj celler med 1 x PBS.
- Inkubera med 0,2% Triton x-100 för 5 min i rumstemperatur.
- Skölj celler tre gånger med 1 x PBS.
- Inkubera med phalloidin-tetrametylrodamin B isotiocyanat från Amanita phalloides utspädd 150-fold med blockerande buffert för 1 h i rumstemperatur.
- Skölj celler tre gånger med 1 x PBS.
- Fläcken atomkärnor med cyanin nukleinsyra bindande färgämnen för 5 min i rumstemperatur.
- Skölj diabilder och mount coverslips med framsidan nedåt i en bild genom att använda reglaget montering media.
- Observera med confocal Mikroskop. Använd en 543 nm laser och ett utsläpp filter 560 – 615 Nm för detektion av fluorescens av phalloidin. Använd en 633 nm laser och ett utsläpp filter längre än 650 nm för nukleär färgning. Vid behandling med TGF-β, skulle bildandet av tjock stress fibrer observeras.
-
VE-cadherin och α-SMA färgning
- Efter 72 h TGF-β behandling, ta bort media, fixa celler med kall 50% metanol och 50% aceton (0,5 – 1,0 mL per brunn) för 5 min.
- Skölj celler tre gånger med 1 x PBS (0,5 – 1,0 mL per brunn).
- Inkubera med primära antikroppar i blockerande buffert övernattning på 4 ° C i mörker enligt tillverkarens rekommenderade koncentrationen. Använd VE-cadherin monoklonal antikropp (BV13, 1: 100 utspädning) och Cy3-konjugerad α-SMA monoklonal antikropp (1A4, 1: 200 utspädning)20.
- Skölj celler tre gånger med 1 x PBS.
- Inkubera cellerna med en grön dye-konjugerad sekundär antikropp till VE-cadherin antikropp i blockerande buffert för 1 h i rumstemperatur i mörkret enligt tillverkarens rekommenderade koncentrationen.
- Skölj celler tre gånger med 1 x PBS.
- Fläcken atomkärnor med cyanin nukleinsyra bindande färgämnen för 5 min i rumstemperatur.
- Skölj diabilder och mount coverslips med framsidan nedåt i en bild genom att använda reglaget montering media.
- Observera med confocal Mikroskop. Använd en 543 nm laser och ett utsläpp filter 560 – 615 Nm för detektion av α-SMA (Cy3). Använd en 488 nm laser och ett utsläpp filter 505 – 550 Nm för detektion av VE-cadherin. Vanligtvis vid behandling med TGF-β behandling, minskning av VE-cadherin signaler och ökning av α-SMA signaler skulle iakttas.
3. tredimensionella kollagen Gel kontraktion Assay
- Utföra kultur av MS-1 celler med/utan TGF-β för 72 h före kollagen gel kontraktion assay.
- Förbereda typ I kollagen gel på is. Blanda kall kollagen lösning, 10 x koncentrerad MEM medium och kollagen förtunningsbuffert innehållande 0,05 N NaOH och 2,2% NaHCO3200 mM HEPES pH 7,4 på en 8:1:1 baserat.
- Blanda 200 mL kontroll eller TGF-β-behandlade endotelceller suspensioner (1,0 x 106 celler/200 μL) och 800 μl av kollagen gellösningen. För TGF-β behandlade prover, lägga till TGF-β2 (1 ng/mL) till cellsuspension.
- Tillsätt 1,0 mL av blandningen till varje brunn av 12-väl kultur plattor och låt stelna i inkubatorn vid 37 ° C i 30 – 60 min.
- Efter gelatinization, overlay 1,0 mL av MEM-α som innehåller 10% FCS, 50 U/mL penicillin och 50 μg/mL streptomycin flyta gelen. För TGF-β behandlade prover, lägga till TGF-β2 (1 ng/mL) till media.
Obs: För TGF-β behandlade prover, lägga till TGF-β till både gel och kultur media. - Inkubera flytande gelerna vid 37 ° C för 48 h.
- Skanna bilderna av geler från botten av plattorna med en skanner. Alternativt kan spela in bilder av geler med en digitalkamera på ett fast avstånd ovanför gelerna.
- Kvantifiera gel yta baserat på PIXELet numrerar med ImageJ. Välj gelen med en freehand markering eller relaterade markeringsverktygen eller Välj gel med ”bild | Justera | Färg tröskel ”-verktyg, och sedan bestämma gel med hjälp av” analysera | Åtgärd ”kommandot.
4. hämning av miRNA aktiviteter av låst-nukleinsyrebaserade miRNA hämmare
- Upprätthålla MS-1 celler i standard odlingsbetingelser.
- Transfect låst nukleinsyra (LNA) miRNA hämmare, syntetiska miRNA duplex eller siRNAs (20 eller 50 nM) med lipofection reagens enligt tillverkarens anvisning. Detaljer och källor av LNA miRNA-hämmare, syntetiska miRNA duplex och siRNAs beskrevs i våra tidigare rapporter26,27. I MS-1 celler, standard transfection förfaranden som grundas på tillverkarens anvisning fungerar bra för införandet av LNA miRNA hämmare, syntetiska miRNA duplex eller siRNAs.
- Efter 16-48 h, stimulera endotelceller med TGF-β2 (en slutlig koncentration på 1 ng/mL).
- Gå vidare till efterföljande analyser inklusive RNA uttryck analys (kvantitativ RT-PCR och RNA-sekvensering (RNA-seq) analyser), immunocytochemical analys och reporter assay. Nedströms analyser har beskrivits i våra tidigare rapporter20,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TGF-β är en potent inducerare av EndMT i olika endotelceller. Efter 24 h behandling med TGF-β i MS-1 celler visar färgning för F-aktin omorganiseringen av aktin stress fibrer (figur 1A)20. Förbehandling med en ROCK-hämmare Y-27632 hämmar induktion av aktin omorganisation20. MS-1 endotelceller ändra från en klassisk kullersten morfologi till en mesenkymala spolformad morfologi vid TGF-β behandling (figur 1B). TGF-β-behandlade celler förlorar cell cell kontakt. Efter behandling med TGF-β för 48-72 h visat immunocytochemical analyser minskat uttryck av VE-cadherin och ökat uttryck av α-SMA (figur 1 c). TGF-β inducerar drastiskt uttryckt av α-SMA på både mRNA och protein nivåer i MS-1 celler efter 48-72 h behandling (siffrorna 1 d och 1E). Däggdjur TGF-β inkluderar TGF-β1, 2 och 3 isoformer. En tidigare studie som använder mus odlade endokardiella kudde bladsticklingar har visat att TGF-β2 men inte TGF-β3 är obligatorisk för omvandling av endokardiella kudde celler28. Däremot, vi tidigare jämfört effekterna av tre isoformer på α-SMA uttryck och bekräftade att alla isoformer likaså inducerad α-SMA uttryck i MS-1 celler20. Kollagen gel kontraktion analys visar förbättrad kontraktion av kollagen typ jag gel av MS-1 celler efter TGF-β behandling (figur 1F). Denna effekt föreslår förvärv av mesenkymala cell kapacitet att renovera extracellulärmatrix. Dessa funktioner är kännetecknande drag av EndMT20. I vår tidigare rapport20undertryckta behandling med en ROCK-hämmare Y-27632 starkt induktion av mesenkymala markörer α-SMA och SM22α utan samtidig hämning av induktion av andra TGF-β målgener som Fibronektin 1 och MMP-2.
EndMT är en mycket dynamisk process. I MS-1 celler är effekterna av TGF-β på α-SMA uttryck och morfologi reversibla; efter TGF-β deprivation återhämta α-SMA uttryck minskar till basala nivåer (figur 2A) och cellerna en kullersten-liknande morfologi (figur 2B). Induktion av EndMT och EMT är dessutom associerade med dynamiska förändringar i sekretoriska kapacitet av flera chemokiner och cytokiner. Flera inflammatoriska chemokiner och cytokiner inklusive CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 och Angptl2 induceras av TGF-β i MS-1 celler, som vi tidigare utsedda EndMT-associerade sekretoriska fenotyp (EndMT-SP)26. Här experimentella modellen är användbar för att undersöka de förmodade regulatorerna av EndMT och EndMT-SP. Vi har tidigare studerat flera MicroRNA i EndMT roller genom att förbättra eller hämma miRNA aktiviteter26,27. MiRNA aktiviteter kan moduleras kraftfullt av miRNA härma oligonukleotider eller LNA-baserade miRNA-hämmare i MS-1 celler, och flera efterföljande analyser inklusive RNA-seq analys kan enkelt utföras (figur 3). Baserat på integrativ transkriptom analys, har vi tidigare kopplade konstitutivt aktiv miR-31 till EndMT förordning i MS-1 celler26. RNA-seq analys visade att hämning av miR-31 av LNA miRNA hämmare resulterar i dämpning av induktion av mesenkymala markörer (figur 3A) och EndMT-SP gener (figur 3 c), medan det inte påverkar induktion av konventionella TGF-β mål gener som Fibronektin 1, PAI-1 och Smad7 (figur 3B) och nedreglering av endothelial markörer (figur 3D)26. Både TGF-β och miR-31 downregulate Stk40, en negativ regulator av NF-κB väg, som fungerar som en potentiell regulator av EndMT-SP. Även om TGF-β inte ökar uttrycket av miR-31, inducerar TGF-β alternativa polyadenylation-medierad uteslutandet av interna poly(A) sekvens i Stk40 3' UTR, därigenom förbättra inriktningen av Stk40 genom konstituerande aktiva miR-31 och slutligen undertrycka Stk4026. Dessutom undersökte vi tidigare rollerna av TGF-β-inducerbara miR-27b i EndMT27. Hämning av miR-27 undertryckta uppreglering av mesenkymala markörer (figur 3A) medan effekterna på konventionella TGF-β målgener, EndMT-SP gener, och endotel markörer var marginella (siffror 3B, 3 C och 3D)27 .
Figur 1 : Induktion av EndMT i MS-1 celler av TGF-β. (A) aktin omorganisation i MS-1 celler efter 24 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (B) morfologisk förändringar i MS-1 celler efter 72 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analyseras för VE-cadherin och α-SMA i MS-1 celler efter 72 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (D, E) Uttryck förändringar i α-SMA, bestäms av standard kvantitativ RT-PCR-analys (D) och Western blot analys (E). (F) kollagen gel kontraktion assay. Förhållandet mellan yta efter 72 h kultur med/utan TGF-β2 behandling (1 ng/mL) till den ursprungliga ytan visas. Skala barer = 20 μm (A och C) och 200 μm (B). Siffrorna ändras från Mihira o.a. 20. felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Reversibla effekter av TGF-β i MS-1 celler. (A) α-SMA mRNA uttryck och (B) cellmorfologi efter uttag av TGF-β2 i MS-1 celler. Skala barer = 200 μm. Felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : RNA-seq analys i MS-1 celler. Efter införandet av LNA miRNA hämmare och behandling med TGF-β2 (72 h) var RNA-seq analys utförs26,27. NC: negativ kontroll. Uttryck visas av representativa gener (A, mesenkymala markörer; B, konventionella TGF-β målgener; C, EndMT-SP gener; och D, endothelial markörer). FPKM (fragment per kilobase av avskrift per miljon mappade läsningar) värden var normaliserade med värdena för ett kontrollprov (LNA-NC utan TGF-β2 behandling). Felstaplar representera standardavvikelser.
| Celltyp | Villkora av mesenkymala markör induktion | Referens |
| mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC) | Induktion av mesenkymala differentiering medium (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL) 5-21 dagar. | Krenning et al. |
| mänskliga kutan mikrovaskulära endotelceller (HCMEC) | Induktion av TGF-β2 (10 ng/mL), utan FBS, 2 dagar. | Medici o.a. |
| mänskliga koronar endotelceller (HCEC) | Induktion av TGF-β1 (10 ng/mL), 6 dagar. Hämning av BMP-7. | Zeisberg et al. |
| mus lung endotelceller (MLEC) | Induktion av TGF-β1 (10 ng/mL), minska till 2% FBS, utan endothelial mitogen, 2 dagar. | Zeisberg et al. |
| rat hjärnan endotelceller (BEC) | Induktion av TGF-β1 (10 ng/mL), 2 dagar. | Krizbai et al. |
| bovin aorta endotelceller (BEAC) | Induktion av TGF-β1 (1 ng/mL), 5 dagar. | Arciniegas et al. |
| förevigade nötkreatur retinal mikrovaskulära endotelceller (iBREC) | Induktion av TGF-β2 (10 ng/mL), 3 – 6 dagar. | Deissler et al. |
| får aortaklaffen endotelceller | Induktion av TGF-β1 eller 3 (1 ng/mL), 6 dagar. | Paranya et al. |
| MS-1 mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller | Induktion av TGF-β (10 ng/mL), aktiveras Ras uttryck, 1 dag. | Hashimoto o.a. |
| MS-1 mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller | Induktion av TGF-β2 (1 ng/mL), 2 – 3 dagar. | Mihira o.a. |
Tabell 1: induktion av EndMT av TGF -β i olika endotelceller. Odlingsbetingelser EndMT induktion av TGF-β sammanfattas. Förändringar i kultur villkor inklusive serumkoncentration och tillägg eller borttagning av andra tillväxtfaktorer noteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har rapporterats att aktiverade Ras och TGF-β behandling för 24 h inducerad EndMT i MS-1 celler, medan TGF-β ensam misslyckades att framkalla EndMT i denna korta period21. Konsekvent, observerade vi att TGF-β väsentligen inducerad EndMT efter längre behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT har observerats flera gånger efter långvarig behandling med TGF-β (2 – 6 dagar) i olika endothelial celler såsom mänskliga umbilical ven endotelceller (HUVEC), mänskliga kutan mikrovaskulära endotelceller (HCMEC), () mänskliga koronar endotelceller HCEC), mus lung endotelceller (MLEC), råtta hjärnan endotelceller (BEC), nötkreatur aorta endotelceller (BEAC), förevigade nötkreatur retinal mikrovaskulära endotelceller (iBREC) och får aorta ventil endotelceller8, 18,29,30,31,32,33,34. I tabell 1sammanfattat vi villkor av mesenkymala markör induktion av TGF-β i olika endotelceller8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Jämförelse av dessa rapporter tyder på att varje endotelceller rad har olika tröskelvärden för EndMT. Differentiell känslighet för TGF-β eller andra mekanismer kan ligga bakom olika EndMT-relaterade sjukdomstillstånd i olika organ. Detta bör beaktas tillsammans med resultaten av in-vivo studier.
Detaljerna i in vitro- EndMT induktion protokoll måste anpassas i olika cellinjer: t.ex., koncentration av TGF-β, koncentrationen av serum, tillägg eller borttagning av andra tillväxtfaktorer, och kultur period. Exempelvis HUVECs svarar ofta dåligt på TGF-β och EndMT skulle induceras av kombination med andra faktorer såsom PDGF-BB och inflammatoriska stimuli eller modulering av koncentrationen i serum och andra medelstora komponenter i en längre kultur inställning29 , 35. Dessutom overconfluency skulle mildra Svaren till TGF-β.
EndMT är en dynamisk process och en motsatt process som kallas mesenkymala-endothelial övergången (MEndoT) har varit nyligen rapporterade36. Induktion av mesenkymala markörer av TGF-β ensam är vändbar i MS-1 celler (figur 2), det har rapporterats att nedreglering av endothelial markörer i MS-1 celler med aktiverade Ras kvarstod efter uttag av TGF-β21. Irreversibel EndMT har också rapporterats i iBREC och får aortaklaffen endotelceller33,34. Dessutom visade en tidigare rapport att EndMT processen kvarstod efter uttag av TGF-β på grund av en ihållande aktivering av Ras-GTP och metylering av promotorn RASAL1 i mänskliga koronar endotelceller37. Jämförelse av dessa modeller kan således också användbart för att förstå regleringsmekanismer av endotelceller plasticitet.
Lyhördhet av endotelceller till induktion med EndMT verkar vara väsentligen heterogena38. Xiao et al. rapporterade att tumör-specifika endotelceller från mjölkkörtlar tumör modell visar olika former av EndMT svar på TGF-β stimulering38. TGF-β-driven EndMT moduleras också av andra signalvägar inklusive FGF-2, BMP-7 och IL-1β35,37,38. Vi fann också att TNF-α förbättrar TGF-β-inducerad EndMT och EndMT-SP i MS-1 celler26. Det är dessutom väl känt att EndMT framkallas av andra signalvägar inklusive Wnt, Notch och hypoxi1. Kombination med andra stimuli i olika endotelceller kan således vara viktigt att förstå heterogenitet EndMT lyhördhet.
Protokollet EndMT presenteras här kan enkelt modifieras för att undersöka tillsynsmyndigheterna för EndMT. Vi i själva verket har präglat olika regulatorer av EndMT i MS-1 celler20,26,27. En guanin nukleotid exchange faktor Arhgef5 och myocardin-relaterade transkriptionsfaktor-en (MRTF-A) induceras av Smad signaler, och både bidra till α-SMA uppreglering i MS-1 celler20. Således, TGF-β signalering aktiveras båda Rho-signaler och MRTF-A att framkalla EndMT. Dessutom hittade vi också att konstitutivt aktiv miR-31 och TGF-β-inducerbara miR-27b positivt reglerar EndMT induktion26,27. I MS-1 celler krävs konstitutivt aktiv miR-31 också för TGF-β-inducerad EndMT-SP26. Sammantaget skulle dessa in vitro- EndMT induktion förfaranden vara användbar för att förstå biologin av EndMT, att identifiera EndMT-associerad gen signaturer och utveckla strategier för att modulera denna process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Zea Borok och Kohei Miyazono för förslag i beredning av manuskriptet. H.I.S. och M.H. stöds av den Uehara Memorial Foundation Research Fellowship och H.I.S. stöds av Osamu Hayaishi Memorial stipendium för studier utomlands. Detta arbete stöds av ett bidrag från Takeda Science Foundation (A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).
