Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Published: August 3, 2018 doi: 10.3791/57577
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Summary

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Abstract

Fenotypische plasticiteit van endotheliale cellen ten grondslag ligt aan cardiovasculaire systeemontwikkeling, cardiovasculaire aandoeningen en verschillende voorwaarden in verband met orgel fibrose. In deze voorwaarden verwerven gedifferentieerde endotheliale cellen mesenchymale-achtige fenotypen. Dit proces heet endotheel-mesenchymale overgang (EndMT) en wordt gekenmerkt door Downregulatie van endothelial markers, opregulatie van mesenchymale markeringen en morfologische veranderingen. EndMT wordt veroorzaakt door verschillende signaalroutes, met inbegrip van transformeren groeifactor (TGF)-β, Wnt en Notch, en gereglementeerd door in de moleculaire mechanismen die vergelijkbaar zijn met die van epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) belangrijk zijn voor gastrulatie, weefsel fibrose, en uitzaaiing van kanker. Inzicht in de mechanismen van EndMT is belangrijk voor het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische methoden gericht op EndMT. Robuuste inductie van EndMT in vitro is nuttig om de gemeenschappelijke gen expressie handtekeningen karakteriseren, druggable moleculaire mechanismen te identificeren en scherm voor modulatoren van EndMT. Hier beschrijven we een in vitro -methode voor de inductie van EndMT. MS-1 muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen ondergaan EndMT na langdurige blootstelling aan TGF-β en opregulatie van mesenchymale markeringen en morfologische veranderingen als inductie van meerdere inflammatoire chemokines en cytokines tonen. Methoden voor de analyse van microRNA (miRNA) modulatie zijn ook opgenomen. Deze methoden bieden een platform voor het onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EndMT en de bijdrage van miRNAs aan EndMT.

Introduction

Endotheliale-mesenchymale overgang (EndMT) is het proces waarmee een gedifferentieerde endothelial cel een verscheidenheid van moleculaire veranderingen ondergaat, wat resulteert in een fibroblast-achtige mesenchymale cel1. EndMT werd in eerste instantie beschreven als een Celtransformatie endothelial tijdens de ontwikkeling van het hart2,3. In de vroege ontwikkeling van het hart bestaat de hart-buis uit een binnenste endocard en een buitenste myocard. Deze twee lagen zijn gescheiden door een laag van extracellulaire matrix genaamd de cardiale gelei. De embryonale endocardial cellen, die endothelial cel markeringen verwerven, doorvoer in mesenchymale cellen, de onderliggende cardiale gelei binnenvallen en bevordering van de vorming van de cardiale kussens, de Stichting voorziet in de atrioventriculaire kleppen en tussenschot en de halvemaanvormige kleppen. EndMT is bovendien gesuggereerd als bronnen van pericytes en vasculaire zachte spiercellen in andere embryonale vasculaire systemen met inbegrip van de coronaire bloedvaten, abdominale aorta en longslagader4,5,6. Daarnaast is EndMT betrokken bij de fysiologische angiogenic7kiemen.

Vergaren van bewijs heeft voorgesteld dat de EndMT ook bij meerdere cardiovasculaire aandoeningen en andere ziekten1,8 betrokken is. EndMT-geassocieerde voorwaarden omvatten vasculaire verkalking, atherosclerose, pulmonale arteriële hypertensie, cavernous malformatie, orgel fibrose, ader graft remodelleren, allograft dysfunctie in niertransplantatie en kanker8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. een recent rapport beschreven dat verschillende moleculaire merkers van de EndMT een instrument voor diagnose en prognose-voorspelling van graft renale dysfunctie in nier transplantatie17 zijn kunnen. Modulatie van cellulaire signaalroutes EndMT-gerelateerde is aangetoond dat het verbeteren van de verschillende ziekten met inbegrip van cardiale fibrose en8,15ader graft remodelleren in dierlijke modellen. Daarom is inzicht in de mechanismen onderliggende EndMT belangrijk voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën gericht op EndMT.

EndMT wordt gekenmerkt door verlies van cel-cel kruispunten, toename van de trekkende potentieel, Downregulatie van endotheel-specifieke genen zoals VE-cadherine en opregulatie van mesenchymale genen met inbegrip van α-gladde spier actine (α-SMA). Bovendien, EndMT en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT), een soortgelijk proces dat epitheliale cellen naar mesenchymale cellen converteert, worden geassocieerd met gewijzigde productie van verschillende componenten van de extracellulaire matrix, die tot de ontwikkeling bijdragen kan van weefsel fibrose8,19.

Onlangs, hebben verscheidene in vitro studies van EndMT details van moleculaire mechanismen van EndMT15,20toegelicht. EndMT wordt veroorzaakt door verschillende signaalroutes inclusief transformeren groeifactor (TGF)-β, Wnt, en Notch1. Onder hen speelt TGF-β cruciaal rollen in de inductie van zowel de EMT en de EndMT. In EndMT, langdurige blootstelling aan TGF-β resultaten in EndMT in verschillende endotheliale cellen, terwijl korte blootstelling lijkt onvoldoende21. We beschreven hier een eenvoudig protocol voor EndMT inductie, waar mijl SVEN 1 (MS-1) muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen ondergaan EndMT in vitro na langdurige blootstelling aan TGF-β20. In dit model kunnen meerdere stroomafwaartse analyses worden uitgevoerd om te onderzoeken van hallmark kenmerken van EndMT, met inbegrip van morfologische veranderingen, Downregulatie van endothelial markers, opregulatie van mesenchymale merkers en inflammatoire genen, cytoskeletal herschikkingen en collageen gel contractie.

MicroRNAs (miRNAs) zijn ~ 22 nt kleine regelgevende RNAs dat posttranscriptional onderdrukking van verschillende mRNA-doelstellingen-22,23 directe. Door zaad sequentie-gemedieerde doel erkenning, miRNAs onderdrukken van honderden doelgenen en moduleren van diverse cellulaire functies zoals celdifferentiatie, proliferatie en beweeglijkheid. Dit geldt ook voor de verordening van de EMT en EndMT en verschillende miRNAs zijn gemeld als regelgevers van EMT en EndMT24,25. Het model van de EndMT gepresenteerd in dit overzicht kan gemakkelijk worden gecombineerd met miRNA modulatie procedures voor het testen van de rol van miRNAs in EndMT. De huidige herziening bevat een overzicht van onze experimentele procedures om te onderzoeken TGF-β-geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen en omvat ook een vergelijking van de voorwaarden van EndMT inductie door TGF-β in andere endotheliale cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. EndMT-inductie

  1. MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven en Vermijd confluentie. Een bron van cellen van de MS-1 wordt beschreven in de Tabel van materialen. Voor MS-1 cellen, gebruikt u Minimum essentiële Medium-α (MEM-α) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 50 U/mL penicilline en 50 μg/mL streptomycine.
  2. Wassen MS-1 cellen op 10 cm schotel met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1,0 mL trypsine toevoegen aan de plaat. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  3. Loskoppelen van de cellen met behulp van 9 mL van voedingsbodems. Verzamelen celsuspensie in een tube van 15 mL.
  4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 – 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in voorverwarmde voedingsbodems.
  6. Levensvatbare cellen tellen met Trypan blauw oplossing en een standaard hemocytometer of een automatische cel teller.
  7. Plaat MS-1 cellen op ongecoate standaard cultuur platen op 0,5 x 103 cellen per cm,2 voor de lange termijn cultuur. Bijvoorbeeld, cultuur plaat 5.0 x 103 cellen per putje in een 6 goed plaat. Gebruik dezelfde cultuur media met inbegrip van dezelfde concentratie van FCS. In MS-1 cellen induceert TGF-β EndMT in lange termijn cultuur (ten minste 48-72 uur) met het gebruik van FCS.
  8. Stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL) na 24 h.
  9. De cellen van de cultuur in een bevochtigde incubator (5% CO2, 37 ° C). Cellen worden dagelijks controleren bij het scherpstellen op morfologische veranderingen.
  10. De media vervangen door verse voorverwarmde voedingsbodems met TGF-β2 na 48u van behandeling met TGF-β in lange termijn cultuur.
  11. Ga naar de downstream analyses. Doorgaans actine reorganisatie wordt waargenomen na 24 h behandeling en Downregulatie van endothelial markers en opregulatie van mesenchymale markers worden waargenomen na 48-72 uur van een behandeling met TGF-β.

2. immunocytochemische analyse

  1. MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven.
  2. Plaat MS-1 cellen op 4 cel goed cultuur kamer dia's op 1.0 x 103 cellen per putje (1,7 cm2). Dia's zijn vooraf gecoat met gelatine. Gebruik 0.5 – 1.0 van voedingsbodems per putje mL.
  3. Stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL) na 24 h. Bij het analyseren van de betrokkenheid van ROCK in EndMT, voeg toe een ROCK-remmer Y-27632 (10 μM) 1 h voorafgaande aan TGF-β behandeling. Bij de beoordeling van het effect van TGF-β signalering remming, kunnen TGF-β receptor kinase-remmers worden gebruikt.
  4. De cellen van de cultuur in een bevochtigde incubator (5% CO2, 37 ° C). Actin reorganisatie wordt waargenomen in MS-1 cellen na 24 h behandeling met TGF-β. Andere veranderingen duidelijk geworden na 48-72 uur behandeling. Voor 72 h cultuur, door de media te vervangen door verse medium met TGF-β na 48u van behandeling met TGF-β.
  5. F-actine kleuring
    1. Na 24u van TGF-β behandeling, media verwijderen, herstellen van cellen met 4% paraformaldehyde in 1 x PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en spoel de cellen met 1 x PBS.
    2. Incubeer met 0,2% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.
    4. Incubeer met phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanaat van Amanita phalloides 150-fold verdund met een blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    5. Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.
    6. Vlek de kernen met cyanine nucleïnezuur bindende kleurstoffen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Spoelen dia's en mount coverslips naar beneden op een dia met behulp van dia montage media.
    8. Observeren met een confocal microscoop. Gebruik een 543 nm laser en een filter van de emissie van 560-615 nm voor detectie van fluorescentie van phalloidin. Gebruik een 633 nm laser en een emissie filter meer dan 650 nm voor nucleaire kleuring. Bij behandeling met TGF-β, wordt vorming van dik stress vezels geobserveerd.
  6. VE-cadherine en α-SMA kleuring
    1. Na 72 uur van TGF-β behandeling media verwijderen, herstellen van cellen met koude 50% methanol en 50% aceton (0,5-1,0 mL per putje) gedurende 5 minuten.
    2. Spoel driemaal met PBS 1 x cellen (0,5-1,0 mL per putje).
    3. Incubeer met primaire antilichamen in blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C in het donker volgens de fabrikant aanbevolen concentratie. Gebruik VE-cadherine monoklonaal antilichaam (BV13, 1:100 verdunning) en α-SMA Cy3-geconjugeerde monoklonaal antilichaam (1A4, 1:200 verdunning)20.
    4. Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.
    5. Incubeer de cellen met een groene kleurstof-geconjugeerde secundair antilichaam aan antilichaam van de VE-cadherine in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker volgens de fabrikant aanbevolen concentratie.
    6. Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.
    7. Vlek de kernen met cyanine nucleïnezuur bindende kleurstoffen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Spoelen dia's en mount coverslips naar beneden op een dia met behulp van dia montage media.
    9. Observeren met een confocal microscoop. Gebruik een 543 nm laser en een filter van de emissie van 560-615 nm voor detectie van α-SMA (Cy3). Gebruik een 488 nm laser en een filter van de emissie van 505 – 550 nm voor detectie van VE-cadherine. Meestal op een behandeling met TGF-β behandeling, afname VE-cadherine signalen en toename van de α-SMA signalen zou worden waargenomen.

3. drie-dimensionale collageen Gel contractie Assay

  1. Cultuur van MS-1 cellen met/zonder TGF-β voor 72 uur vóór collageen gel contractie assay uitvoeren.
  2. Voorbereiden van het type I collageen gel op ijs. Meng koude collageen oplossing, 10 x geconcentreerd MEM gemiddeld en collageen verdunning buffer met 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3en 200 mM HEPES pH 7.4 een 8:1:1 verhouding.
  3. Meng 200 mL van besturingselement of endothelial cel TGF-β-testgroep schorsingen (1.0 x 106 cellen/200 μl) en 800 μl van de collageen gel oplossing. Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β2 toevoegen (1 ng/mL) aan de celsuspensie.
  4. 1,0 mL van het mengsel toevoegen aan elk putje van 12-well cultuur platen en laat stollen in de incubator bij 37 ° C gedurende 30-60 minuten.
  5. Na gelatinization, overlay 1,0 mL MEM-α met 10% FCS, 50 U/mL penicilline en 50 μg/mL streptomycine te zweven van de gel. Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β2 toevoegen (1 ng/mL) tot de media.
    Opmerking: Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β toevoegen aan zowel de gel en de voedingsbodems.
  6. Incubeer de zwevende gels bij 37 ° C gedurende 48 uur.
  7. De afbeeldingen van gelen vanaf de onderkant van de platen met behulp van een scanner scannen. U kunt ook de beelden van gelen met behulp van een digitale camera op een vaste afstand boven de gels registreren.
  8. De oppervlakte van gel op basis van het aantal pixels met behulp van ImageJ te kwantificeren. Selecteer de gel met een freehand selectie of verwante selectiegereedschappen, of met behulp van de gel "afbeelding | Aanpassen | Kleur drempel"tool, en controleer op het gebied van het gebruik van de gel" Analyze | Maatregel"commando.

4. de remming van de miRNA activiteiten door op basis van nucleïnezuur vergrendeld miRNA remmers

  1. MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven.
  2. Transfect vergrendeld Nucleic Acid (LNA) miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen of siRNAs (20 of 50 nM) met behulp van lipofection reagentia volgens de instructie van de fabrikant. Details en bronnen van LNA miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen, en siRNAs werden beschreven in onze eerdere verslagen26,27. In MS-1 cellen, standaard transfectie procedures gebaseerd op instructie van de fabrikant werken goed voor invoering van LNA miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen of siRNAs.
  3. Na 16 – 48 h, stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL).
  4. Ga naar verschillende downstream analyses, met inbegrip van RNA expressie analyse (kwantitatieve RT-PCR en RNA-sequencing (RNA-seq) analyses), immunocytochemische, en verslaggever assay. Stroomafwaarts analyses zijn beschreven in onze eerdere verslagen20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β is een potente inductor van EndMT in verschillende endotheliale cellen. Na 24 h behandeling met TGF-β in MS-1 cellen toont kleuring voor F-actine reorganisatie van actine stress vezels (figuur 1A)20. Voorbehandeling met een ROCK-remmer Y-27632 remt de inductie van actine reorganisatie20. MS-1 endotheliale cellen veranderen van een klassieke geplaveide-achtige morfologie naar een mesenchymale spindel-vormig morfologie bij TGF-β behandeling (figuur 1B). TGF-β-testgroep cellen verliezen cel contact. Na behandeling met TGF-β gedurende 48-72 uur tonen immunocytochemische analyses verminderde expressie van VE-cadherine en verhoogde expressie van α-SMA (Figuur 1 c). TGF-β induceert drastisch het uiten van de α-SMA op zowel eiwitten als mRNA niveaus in MS-1 cellen na 48-72 uur behandeling (cijfers 1 d en 1E). Zoogdieren TGF-β omvat TGF-β1, 2 en 3 isoforms. Een eerdere studie met behulp van de muis gekweekte endocardial kussen explantaten heeft aangetoond dat TGF-β2 maar niet TGF-β3 verplicht voor transformatie van endocardial kussen cellen28is. Aan de andere kant, we eerder ten opzichte van de gevolgen van drie isoforms voor α-SMA expressie en bevestigd dat alle isoforms α-SMA expressie in MS-1 cellen20op dezelfde manier opgewekt. Collageen gel contractie assay toont verbeterde contractie van het collageen type dat ik gel door MS-1 cellen na TGF-β behandeling (figuur 1F). Dit effect suggereert het verwerven van mesenchymale cel capaciteit aan het remodelleren van de extracellulaire matrix. Deze functies zijn waarmerk kenmerken van EndMT20. In ons vorige verslag20onderdrukt behandeling met een ROCK-remmer Y-27632 sterk inductie van mesenchymale markeringen α-SMA en SM22α zonder daarmee gepaard gaande onderdrukking van inductie van andere TGF-β doelgenen zoals fibronectine 1 en MMP-2.

EndMT is een uiterst dynamisch proces. In de cellen van de MS-1 zijn de gevolgen van TGF-β voor α-SMA expressie en morfologie omkeerbaar; na TGF-β ontbering opnieuw α-SMA expressie dalingen aan basale niveaus (figuur 2A), en de cellen een geplaveide-achtige morfologie (figuur 2B). Inductie van EndMT en EMT wordt bovendien geassocieerd met dynamische veranderingen in secretoire capaciteit van meerdere chemokines en cytokinen. Meerdere inflammatoire chemokines en cytokinen zoals CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6, en Angptl2 zijn geïnduceerd door TGF-β in MS-1 cellen, die we eerder EndMT-geassocieerde secretoire fenotype (EndMT-SP)26 aangewezen. Deze experimentele model is handig te onderzoeken van de vermeende regulatoren van EndMT en EndMT-SP. Wij hebben eerder de rol van de verschillende miRNAs in de EndMT bestudeerd door verbetering of remming van miRNA activiteiten26,27. MiRNA activiteiten krachtig kunnen worden gedifferentieerd door miRNA mimic oligonucleotides of LNA gebaseerde miRNA remmers in MS-1 de cellen, en meerdere stroomafwaartse assays inclusief RNA-seq analyse kan gemakkelijk worden uitgevoerd (Figuur 3). Op basis van integratieve transcriptome analyse, hebben wij eerder constitutively actieve miR-31 gekoppeld aan EndMT verordening in MS-1 cellen26. RNA-seq analyse toonde aan dat remming van miR-31 door LNA miRNA remmer resultaten op demping van inductie van mesenchymale markeringen (Figuur 3 bis) en EndMT-SP genen (Figuur 3 c), terwijl het heeft geen invloed op inductie van conventionele TGF-β target genen zoals fibronectine 1, PAI-1 en Smad7 (figuur 3B) en Downregulatie van endothelial markeringen (figuur 3D)26. Zowel TGF-β en miR-31 downregulate Stk40, een negatieve regulator van NF-recombination traject, die als een potentiële regulator van EndMT-SP. fungeert Hoewel TGF-β de expressie van miR-31 niet toeneemt, induceert TGF-β alternatieve polyadenylatie-gemedieerde uitsluiting voor interne poly(A) sequence in Stk40 3' UTR, daarmee verbeteren doelgerichtheid van Stk40 door de constitutieve actieve miR-31 en ten slotte onderdrukken Stk4026. Bovendien, onderzocht we eerder de rol van TGF-β-afleidbare miR-27b in EndMT27. Remming van de miR-27 onderdrukt opregulatie van mesenchymale markers (figuur 3A) terwijl de gevolgen voor de conventionele TGF-β doelgenen, EndMT-SP genen, en endotheel markeringen waren marginale (cijfers 3B 3 C en 3D)27 .

Figure 1
Figuur 1 : Inductie van EndMT in MS-1 cellen door TGF-β. (A) actine reorganisatie in MS-1 cellen na 24 h van TGF-β2 behandeling (1 ng/mL). (B) morfologische veranderingen in de cellen van de MS-1 na 72 uur van TGF-β2 behandeling (1 ng/mL). (C) immunocytochemische analyseert voor VE-cadherine en α-SMA in MS-1 cellen na 72 uur van TGF-β2 behandeling (1 ng/mL). (D, E) Expressie veranderingen in α-SMA, bepaald door de kwantitatieve RT-PCR standaardanalyse (D) en Western blot analyse (E). (F) collageen gel contractie assay. De verhouding tussen de oppervlakte na 72 h cultuur met/zonder TGF-β2 behandeling (1 ng/mL) naar de oorspronkelijke oppervlakte worden weergegeven. Schaal bars = 20 μm (A en C), en 200 μm (B). Cijfers zijn aangepast ten opzichte van Mihira et al. 20. foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Omkeerbare effecten van TGF-β in cellen van de MS-1. (A) α-SMA mRNA uitdrukking en (B) cel morfologie na intrekking van TGF-β2 in MS-1 cellen. Schaal bars = 200 μm. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : RNA-seq analyse in cellen van de MS-1. Na invoering van LNA miRNA remmers en behandeling met TGF-β2 (72 h) werd RNA-seq analyse uitgevoerd26,27. NC: negatieve controle. Wijzigingen van de expressie van representatieve genen worden weergegeven (A, mesenchymale merkers; B, conventionele TGF-β doelgenen; C, EndMT-SP genen; en D, endotheel markeringen). FPKM (fragmenten per kilobase van afschrift per miljoen toegewezen leest) waarden zijn genormaliseerd met de waarden van een controlemonster (LNA-NC zonder TGF-β2-behandeling). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties.

Celtype Voorwaarde van mesenchymale marker inductie Referentie
menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC) Inductie door mesenchymale differentiatie medium (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5 – 21 dagen. Krenning et al.
menselijke cutane microvasculaire endotheliale cellen (HCMEC) Inductie door TGF-β2 (10 ng/mL), zonder FBS, 2 dagen. Medici et al.
menselijke coronaire endotheliale cellen (HCEC) Inductie door TGF-β1 (10 ng/mL), 6 dagen. Remming door BMP-7. Zeisberg et al.
muis Long endotheliale cellen (MLEC) Inductie door TGF-β1 (10 ng/mL), verlagen tot 2% FBS, zonder endothelial mitogeen, 2 dagen. Zeisberg et al.
rat hersenen endotheliale cellen (BEC) Inductie door TGF-β1 (10 ng/mL), 2 dagen. Krizbai et al.
boviene aorta endotheliale cellen (BAEC) Inductie door TGF-β1 (1 ng/mL), 5 dagen. Arciniegas et al.
vereeuwigd boviene retinale microvasculaire endotheliale cellen (iBREC) Inductie door TGF-β2 (10 ng/mL), 3-6 dagen. Deissler et al.
schapen aortaklep endotheliale cellen Inductie door TGF-β1 of 3 (1 ng/mL), 6 dagen. Paranya et al.
MS-1 muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen Inductie door TGF-β (10 ng/mL), geactiveerd Ras expressie, 1 dag. Hashimoto et al.
MS-1 muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen Inductie door TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 dagen. Mihira et al.

Tabel 1: inductie van EndMT door TGF -β in verschillende endotheliale cellen. Cultuur voorwaarden van EndMT inductie door TGF-β zijn samengevat. Veranderingen in cultuuromstandigheden waaronder serumconcentratie en toevoeging of verwijdering van andere factoren die de groei worden ook vermeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er werd gemeld dat geactiveerde Ras en TGF-β behandeling gedurende 24 uur EndMT in cellen van de MS-1, geïnduceerde terwijl TGF-β alleen mislukte voor het opwekken van EndMT in deze korte periode21. Consequent, vastgesteld we hebben dat TGF-β aanzienlijk EndMT na langere behandeling (48-72 uur) in MS-1 cellen20 geïnduceerde. EndMT herhaaldelijk geconstateerd na langdurige behandeling met TGF-β (2-6 dagen) in verschillende endotheliale cellen zoals menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), menselijke cutane microvasculaire endotheliale cellen (HCMEC), menselijke coronaire endotheliale cellen) HCEC), muis Long endotheliale cellen (MLEC), rat hersenen endotheliale cellen (BEC), runderen aorta endotheliale cellen (BAEC), vereeuwigd boviene retinale microvasculaire endotheliale cellen (iBREC) en schapen aorta klep endotheliale cellen8, 18,29,30,31,32,33,34. In tabel 1samengevat we de gebruiksvoorwaarden mesenchymale marker inductie door TGF-β in verschillende endotheliale cellen8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Vergelijking van deze verslagen blijkt dat elke regel endothelial cel verschillende drempels voor EndMT heeft. Differentiële gevoeligheid voor TGF-β of andere mechanismen kan ten grondslag liggen aan diverse EndMT-gerelateerde pathologische condities in verschillende organen. Dit moet worden beschouwd samen met de resultaten van in vivo onderzoeken.

De details van de in vitro EndMT inductie protocol moeten worden aangepast in verschillende cellijnen: bv., concentratie van TGF-β, concentratie van serum, toevoeging of verwijdering van andere factoren die de groei en de periode van de cultuur. Bijvoorbeeld, HUVECs vaak slecht reageren op TGF-β en EndMT zou worden veroorzaakt door de combinatie met andere factoren, zoals PDGF-BB en inflammatoire stimuli en/of modulatie van de serumconcentratie en andere middellange onderdelen in een langere cultuur29 instellen , 35. Voorts overconfluency zou het verzachten van de reacties op TGF-β.

EndMT is een dynamisch proces en een omgekeerde proces genaamd mesenchymale-endothelial overgang (MEndoT) is onlangs gemelde36. Terwijl de inductie van mesenchymale markeerders door TGF-β alleen is omkeerbaar in MS-1 cellen (Figuur 2), er werd gemeld dat Downregulatie van endothelial markers in MS-1 cellen met geactiveerde Ras bleef na intrekking van TGF-β21. Onomkeerbare EndMT is ook gemeld in de iBREC en schapen aortaklep endotheliale cellen33,34. Daarnaast toonde een vorige verslag aan dat het EndMT-proces bleef na intrekking van TGF-β als gevolg van een aanhoudende activering van Ras-GTP en methylering van de promotor van de RASAL1 in menselijke coronaire endotheliale cellen37. Dus wellicht vergelijking van deze modellen ook nuttig om te begrijpen van de regelgevende mechanismen van endothelial cel plasticiteit.

Responsiviteit van endotheliale cellen EndMT inductie lijkt aanzienlijk heterogene38. Xiao et al. rapporteerde dat endotheliale cellen van de tumor-specifieke van een borstklier tumor model verschillende vormen van EndMT in reactie op TGF-β stimulatie38weergeven. TGF-β-gedreven EndMT is ook door andere signaalroutes inclusief FGF-2, BMP-7 en IL-1β35,37,38gemoduleerd. We vonden ook dat TNF-α TGF-β-geïnduceerde EndMT verbetert en EndMT-SP in MS-126 cellen. Het is bovendien bekend dat EndMT wordt veroorzaakt door andere signaalroutes met inbegrip van de Wnt, Inkeping en hypoxie1. Combinatie met andere stimuli in verschillende endotheliale cellen kan dus worden belangrijk om te begrijpen van de heterogeniteit van EndMT responsiviteit.

Het protocol van de EndMT hier gepresenteerd kan eenvoudig worden aangepast om te onderzoeken van de regelgevers van de EndMT. In feite, hebben we verschillende regelgevers van de EndMT in MS-1 cellen20,26,27gekenmerkt. Een guanine nucleotide uitwisseling factor Arhgef5 en myocardin-gerelateerde transcriptiefactor-MRTF-A zijn geïnduceerd door Smad signalen, en beide bijdragen aan α-SMA opregulatie in MS-1 cellen20. Dus de signalen van beide Rho TGF-β signalering activeert en MRTF-A voor het opwekken van EndMT. Daarnaast vonden we ook dat constitutively actieve miR-31 en TGF-β-afleidbare miR-27b positief EndMT inductie26,27 regelen. In MS-1 cellen is constitutively actieve miR-31 ook noodzakelijk voor TGF-β-geïnduceerde EndMT-SP26. Over het geheel genomen zou deze in vitro -procedures van het EndMT-inductie nuttig zijn voor het begrip van de biologie van EndMT, EndMT-geassocieerde gene handtekeningen identificeren en ontwikkelen van strategieën om dit proces te moduleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Zea Borok en Kohei Miyazono voor suggesties ter voorbereiding van manuscript. H.I.S. en M.H. worden ondersteund door de Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, en H.I.S. wordt ondersteund door de Osamu Hayaishi Memorial Scholarship voor studie in het buitenland. Dit werk werd gesteund door een subsidie van Takeda Science Foundation (A.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).

Tags

Biologie kwestie 138 endotheliale-mesenchymale EndMT endotheel overgangscel TGF-β α-SMA collageen microRNA
Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira,… More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter