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Biology

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.

Abstract

Phänotypische Plastizität der Endothelzellen zugrunde liegt, Herz-Kreislauf-System-Entwicklung, Herz-Kreislauf-Krankheiten und verschiedenen Bedingungen im Zusammenhang mit Orgel Fibrose. Unter diesen Bedingungen erwerben differenzierte endotheliale Zellen mesenchymalen-ähnlichen Phänotypen. Diesen Prozess nennt man endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) und zeichnet sich durch Herabregulation der endotheliale Marker, Hochregulation von mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen. EndMT wird durch mehrere Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt und Kerbe, und reguliert durch die molekularen Mechanismen, die für die Gastrulation, Gewebe Fibrose, ähnlich denen der epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT) wichtig und Krebsmetastasen. Verständnis der Mechanismen des EndMT ist wichtig, diagnostische und therapeutische Ansätze für EndMT zu entwickeln. Robuste Induktion der EndMT in Vitro ist nützlich, um gemeinsame Gen Ausdruck Signaturen zu charakterisieren, druggable Molekulare Mechanismen zu identifizieren und Bildschirm für Modulatoren des EndMT. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Methode zur Induktion von EndMT. MS-1 Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen unterliegen EndMT nach längerer Einwirkung von TGF-β und Hochregulation der mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen aber auch Induktion von mehreren entzündlichen Chemokinen und Zytokinen. Methoden für die Analyse von MicroRNA (MiRNA) Modulation sind ebenfalls enthalten. Diese Methoden bieten eine Plattform, um die Mechanismen, die EndMT und der Beitrag der MiRNAs, EndMT zu untersuchen.

Introduction

Endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) ist der Prozess, durch den ein differenzierter Endothelzellen eine Vielzahl von molekularen Veränderungen in einer Fibroblasten-ähnliche Mesenchymale Zellen1erfährt. EndMT wurde ursprünglich als eine Transformation der Endothelzellen während der Entwicklung des Herzens2,3beschrieben. In einem frühen Entwicklungsstadium der Herzen besteht das Herz Rohr aus einer inneren Endokards und einer äußeren Myokard. Diese beiden Schichten sind durch eine Schicht der extrazellulären Matrix genannt das kardiale Gelee getrennt. Die embryonalen endokardialen Zellen, die Endothelzellen Marker erwerben, transit in Mesenchymale Zellen, dringen in das zugrunde liegende kardiale Gelee, und Bildung von kardialen Kissen, bietet die Grundlage für die ventrikulären Ventile und septum und die Semilunar Ventile. Darüber hinaus wurde EndMT vermutet, zu Quellen von perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen in anderen embryonalen Gefäßsysteme einschließlich der Herzkranzgefäße, abdominale Aorta und Lungenarterie4,5,6. Darüber hinaus ist EndMT in physiologischen angiogenen sprießen7verwickelt.

Sammeln Beweise hat vorgeschlagen, dass EndMT auch mehrere Herz-Kreislauf-Krankheiten und anderen Krankheiten1,8beteiligt ist. EndMT verbundenen Bedingungen sind Gefäßverkalkung, Arteriosklerose, pulmonaler arterieller Hypertonie, höhlenartigen Fehlbildung, Orgel Fibrose, Vene Transplantat Umbau, Allograft Dysfunktion im Nieren-Transplantation und Krebs8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschrieben, dass mehrere molekulare Marker der EndMT ein Werkzeug für die Diagnose und Prognose Vorhersage der renal Transplantation Dysfunktion bei Nieren-Transplantation17sein können. Modulation des EndMT bedingte zelluläre Signalwege haben gezeigt, dass mehrere Erkrankungen einschließlich kardialer Fibrose zu verbessern und Vene Transplantat Umbau in Tier8,15Modelle. Daher ist das Verständnis der Mechanismen zugrunde liegenden EndMT wichtig, diagnostische und therapeutische Strategien für EndMT zu entwickeln.

EndMT zeichnet sich durch Verlust der Zell-Zell-Verbindungen, Erhöhung der wandernden Potenzial, Herabregulation der endothelialen-spezifischen Gene wie VE-Cadherin und Hochregulation der mesenchymalen Gene unter anderem α-Glattmuskel Aktin (α-SMA). Darüber hinaus sind EndMT und epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT), ein ähnlicher Prozess, die Epithelzellen in Mesenchymale Zellen konvertiert mit veränderten Produktion verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix, die zur Entwicklung beitragen können von Gewebe Fibrose8,19.

Vor kurzem haben mehrere in-vitro- Studien von EndMT Details der molekularen Mechanismen von EndMT15,20aufgeklärt. EndMT wird durch verschiedene Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt, und1Kerbe. Unter ihnen spielt TGF-β entscheidende Rolle in der Induktion von EMT und EndMT. In EndMT verlängert Exposition gegenüber TGF-β Ergebnisse in EndMT in verschiedenen Endothelzellen, während kurze Belichtungszeiten scheint unzureichend21zu sein. Wir beschrieben hier eine einfache Protokoll für EndMT Induktion, wobei Meile SVEN 1 (MS-1) Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen EndMT in Vitro nach längerer Einwirkung von TGF-β20unterziehen. In diesem Modell können mehreren nachgeschaltete Analysen durchgeführt werden, um die typischen Merkmale des EndMT, einschließlich morphologische Veränderungen, Downregulation endotheliale Marker, Hochregulation der mesenchymalen Marker und entzündlichen Gene, Zellskelett untersuchen Umstellungen und Kollagen gel Kontraktion.

Micro-RNAs (MiRNAs) sind ~ 22 nt kleine regulatorische RNAs, die direkte posttranskritionelle Unterdrückung der verschiedenen mRNA Ziele22,23. Durch Samen, Sequenz-vermittelten Zielerfassung MiRNAs Hunderte von Zielgenen zu unterdrücken und zu modulieren, diverse Zellfunktionen wie Zell-Differenzierung, Proliferation und Motilität. Dies gilt auch für die Verordnung von EMT und EndMT, und verschiedene MiRNAs als Regulatoren der EMT und EndMT24,25gemeldet wurden. In diesem Beitrag vorgestellte EndMT-Modell ist mit MiRNA Modulation Verfahren testen Sie die Rollen von MiRNAs in EndMT kombinierbar. Im Rahmen dieser Untersuchung fasst unsere experimentellen Verfahren zur Untersuchung von TGF-β-induzierte EndMT in MS-1-Zellen und umfasst auch Vergleich der Bedingungen der EndMT Induktion von TGF-β in anderen Endothelzellen.

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Protocol

1. Induktion von EndMT

  1. MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen pflegen und Konfluenz zu vermeiden. Eine Quelle für MS-1-Zellen wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Verwenden Sie für MS-1-Zellen Minimum wesentliches Medium-α (MEM-α) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 50 U/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin.
  2. Waschen MS-1-Zellen auf 10 cm Schüssel mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 1,0 mL Trypsin auf den Teller. 5 min bei 37 ° c inkubieren
  3. Lösen Sie die Zellen mit 9 mL von Nährmedien. Sammeln Sie Zellsuspension in einer 15 mL Tube.
  4. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 – 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und Aussetzen der Zelle Pellet in vorgewärmten Kulturmedien.
  6. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Lösung und eine standard Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
  7. Platte MS-1-Zellen auf unbeschichtete standard Kultur Teller bei 0,5 x 103 Zellen pro cm2 für lange Begriff Kultur. Z. B. Kultur Platte 5.0 x 103 Zellen pro Bohrloch in einem 6 gut Platte. Verwenden Sie die gleiche Kultur Medien einschließlich der gleichen Konzentration von FCS. In MS-1-Zellen induziert TGF-β EndMT in langfristige Kultur (mindestens 48-72 h) mit dem Einsatz des FCS.
  8. Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL) nach 24 h zu stimulieren.
  9. Zellkulturen in einem befeuchteten Inkubator (5 % CO2, 37 ° C). Überwachen Sie Zellen täglich beim Fokussieren morphologischer Veränderungen.
  10. Ersetzen Sie die Medien mit frischen vorgewärmten Nährmedien mit TGF-β2 nach einer Behandlung mit TGF-β in langfristige Kultur 48 h.
  11. Fahren Sie mit den nachfolgenden Analysen. In der Regel Aktin Reorganisation ist nach 24 Stunden nach der Behandlung beobachtet und Herabregulation der endotheliale Marker und Hochregulation der mesenchymalen Marker nach 48-72 h Behandlung mit TGF-β eingehalten werden.

(2) Immunocytochemical Analyse

  1. MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen zu erhalten.
  2. Platte-MS-1-Zellen auf 4 Zelle gut Kultur Kammer Folien bei 1,0 x 103 Zellen pro Bohrloch (1,7 cm-2). Folien sind vorbeschichtete mit Gelatine. Verwendung 0,5 – 1,0 mL der Nährmedien pro Bohrloch.
  3. Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL) nach 24 h zu stimulieren. Bei der Analyse der Beteiligung der ROCK in EndMT fügen Sie einen ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM) 1 h vor TGF-β-Behandlung hinzu. Bei der Beurteilung der Wirkung von TGF-β Signalisierung Hemmung können TGF-β-Rezeptor-Kinase-Inhibitoren verwendet werden.
  4. Zellkulturen in einem befeuchteten Inkubator (5 % CO2, 37 ° C). Aktin Reorganisation ist nach 24 Stunden nach der Behandlung mit TGF-β in MS-1-Zellen beobachtet. Andere Änderungen werden nach 48-72 h der Behandlung deutlich. Ersetzen Sie für 72 h Kultur die Medien mit neuen Medien mit TGF-β nach 48 h Behandlung mit TGF-β.
  5. F-Aktin Färbung
    1. Nach 24 Stunden der TGF-β-Behandlung Entfernen von Medien, Zellen mit 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur zu beheben und spülen Sie Zellen mit 1 X PBS.
    2. Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton x-100 für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.
    4. Inkubieren mit Phalloidin-Tetramethylrhodamine B Herstellung von Amanita Phalloides 150-fach verdünnt mit blockierenden Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.
    5. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.
    6. Färben Sie die Kerne mit Cyanin Nukleinsäure-bindende Farbstoffe für 5 min bei Raumtemperatur.
    7. Spülen-Folien und Mount Deckgläsern verdeckt auf einer Folie mit Folie Montage Medien.
    8. Mit einem confocal Mikroskop beobachten. Verwenden Sie eine 543 nm-Laser und eine Emission Filter von 560 – 615 nm zur Detektion der Fluoreszenz von Phalloidin. Verwenden Sie ein 633 nm-Laser und eine Emission Filter mehr als 650 nm für nukleare Färbung. Bei der Behandlung mit TGF-β würde Bildung von dicken Stress Fasern beobachtet werden.
  6. VE-Cadherin und α-SMA Färbung
    1. Nach 72 h der TGF-β-Behandlung, Entfernen von Medien, Zellen mit kalten 50 % Methanol und 50 % Aceton fix (0,5 – 1,0 mL pro Well) für 5 Minuten.
    2. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS (0,5 – 1,0 mL pro Well).
    3. Brüten Sie mit Primärantikörpern in blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln nach dem Hersteller empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie VE-Cadherin monoklonaler Antikörper (BV13, 1: 100 Verdünnung) und α-SMA Cy3 konjugierten monoklonalen Antikörper (1A4, Verdünnung 1: 200)20.
    4. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.
    5. Inkubieren Sie Zellen mit grünen Farbstoff-konjugierten Sekundärantikörper, VE-Cadherin Antikörper blockieren Puffer für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln nach dem Hersteller empfohlenen Konzentration.
    6. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.
    7. Färben Sie die Kerne mit Cyanin Nukleinsäure-bindende Farbstoffe für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Spülen-Folien und Mount Deckgläsern verdeckt auf einer Folie mit Folie Montage Medien.
    9. Mit einem confocal Mikroskop beobachten. Verwenden Sie eine 543 nm-Laser und eine Emission Filter von 560 – 615 nm für die Erkennung von α-SMA (Cy3). Verwenden Sie eine 488 nm-Laser und eine Emission Filter von 505-550 nm für die Erkennung von VE-Cadherin. In der Regel bei der Behandlung mit TGF-β-Behandlung, Abnahme der VE-Cadherin Signale und Anstieg der α-SMA Signale beobachtet werden würde.

3. dreidimensionale Kollagen Gel Kontraktion Assay

  1. Durchführen Sie Kultur des MS-1-Zellen mit/ohne TGF-β für 72 h vor Kollagen Gel Kontraktion Test.
  2. Vorbereiten den Typ ich Kollagen Gel auf Eis. Mischen Sie kalt Kollagen Lösung, 10-fach konzentriert MEM Medium und Kollagen Verdünnungspuffer mit 0,05 N NaOH, 2,2 % Nahco33und 200 mM HEPES pH 7.4 ein 8:1:1 Verhältnis.
  3. Mischen Sie 200 mL Kontrolle oder TGF-β-behandelten Endothelzellen Suspensionen (1,0 x 106 Zellen/200 μL) und 800 µl der Kollagen-Gel-Lösung. Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen TGF-β2 (1 ng/mL) um die Zellsuspension.
  4. 1,0 mL des Gemisches in jede Vertiefung der Kultur 12-Well-Platten und in den Inkubator bei 37 ° C für 30 – 60 min zu festigen.
  5. Nach Verkleisterung überlagern Sie 1,0 mL der MEM-α mit 10 % FCS, 50 U/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin, das Gel zu schweben. Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen TGF-β2 (1 ng/mL) zu den Medien.
    Hinweis: Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen, TGF-β das Gel und Nährmedien.
  6. Inkubieren Sie die schwimmenden Gele bei 37 ° C für 48 h.
  7. Scannen Sie die Bilder der Gele aus der Unterseite der Platten mit Hilfe eines Scanners. Alternativ, zeichnen Sie die Bilder mit einer digitalen Kamera in einem festen Abstand über die Gele-Gele.
  8. Quantifizieren Sie die Gel-Oberfläche basierend auf der Anzahl der Pixel mit ImageJ. Wählen Sie das Gel eine Freihandauswahl oder Verwandte Auswahlwerkzeuge verwenden, oder wählen Sie das Gel mit "Bild | Anpassen | Farbe Schwelle"Werkzeug, und ermitteln Sie den Bereich der Verwendung von Gel" Analyze | Maßnahme"Befehl.

4. Hemmung der MiRNA Aktivitäten von gesperrt Nukleinsäure-basierte MiRNA Inhibitoren

  1. MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen zu erhalten.
  2. Transfizieren Sie gesperrt Nukleinsäure (LNA) MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten oder SiRNAs (20 oder 50 nM) mit Lipofektion Reagenzien entsprechend Anleitungen des Herstellers. Details und Quellen der LNA MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten und SiRNAs wurden in unsere früheren Berichte26,27beschrieben. In MS-1-Zellen standard Transfektion Verfahren anhand der Anweisungen des Herstellers funktionieren gut für Einführung der LNA MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten oder SiRNAs.
  3. Stimulieren Sie nach 16-48 h Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL).
  4. Fahren Sie mit verschiedenen nachgeschalteten Analysen einschließlich RNA Expressionsanalyse (quantitative RT-PCR und RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) Analysen), Immunocytochemical Analyse und Reporter Assay. Nachgeschaltete Analysen wurden in unsere früheren Berichte20,26,27beschrieben.

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Representative Results

TGF-β ist ein potenter Induktor von EndMT in verschiedenen Endothelzellen. Nach 24 h Behandlung mit TGF-β in MS-1-Zellen zeigt die Färbung für F-Aktin Reorganisation von Aktin Stress Fasern (Abbildung 1A)20. Vorbehandlung mit einem ROCK-Inhibitor Y-27632 hemmt die Induktion von Aktin Reorganisation20. MS-1 Endothelzellen ändern von einer klassischen Pflasterstein-ähnliche Morphologie eine Mesenchymale spindelförmige Morphologie TGF-β-Behandlung (Abbildung 1 b). TGF-β-behandelten Zellen verlieren Zellezelle Kontakt. Nach der Behandlung mit TGF-β für 48-72 h zeigen Immunocytochemical Analysen verminderte Expression von VE-Cadherin und erhöhte Expression von α-SMA (Abbildung 1). TGF-β induziert drastisch die Expression von α-SMA auf mRNA und Protein Ebenen in MS-1-Zellen nach 48-72 h Behandlung (Zahlen 1 und 1E). Säugetier-TGF-β enthält TGF-β1, 2 und 3 Isoformen. Eine frühere Studie mit Maus kultiviert endokardialen Kissen Explantaten hat gezeigt, dass TGF-β2 aber nicht TGF-β3 ist obligatorisch für die Transformation von endokardialen Kissen Zellen28. Auf der anderen Seite haben wir zuvor die Auswirkungen von drei Isoformen auf α-SMA Ausdruck verglichen und bestätigt, dass alle Isoformen ebenso α-SMA Ausdruck in MS-1 Zellen20induziert. Kollagen Gel Kontraktion Assay zeigt verstärkte Kontraktion der Kollagen-Typ, den ich von MS-1-Zellen nach der TGF-β-Behandlung (Abb. 1F) gel. Dieser Effekt schlägt den Erwerb von mesenchymalen Zellen Kapazität, extrazellulären Matrix umzugestalten. Diese Funktionen sind Markenzeichen Merkmale des EndMT20. In unserem vorherigen Bericht20unterdrückt Behandlung mit einem ROCK-Inhibitor Y-27632 stark Induktion von mesenchymalen Marker α-SMA und SM22α ohne gleichzeitige Unterdrückung der Induktion von anderen TGF-β-Zielgenen wie Fibronektin 1 und MMP-2.

EndMT ist ein sehr dynamischer Prozess. In MS-1-Zellen sind die Auswirkungen der TGF-β α-SMA Ausdruck und Morphologie reversibel; nach Entzug der TGF-β erholen α-SMA Ausdruck sinkt auf basalen Ebenen (Abb. 2A) und Zellen eine Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie (Abb. 2 b). Darüber hinaus ist die Induktion von EndMT und EMT mit dynamischen Veränderungen in sekretorischen Funktion von mehreren Chemokinen und Zytokinen. Mehrere entzündliche Chemokinen und Zytokinen einschließlich CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 und Angptl2 durch TGF-β in MS-1-Zellen, die wir zuvor EndMT-assoziierten sekretorischen Phänotyp (EndMT-SP)26 benanntenhervorgerufen. Dieses Modell eignet sich zu untersuchen, die vermeintlichen Regulatoren der EndMT und EndMT-SP. Vorher haben wir die Rollen der verschiedenen MiRNAs in EndMT studiert, durch Förderung oder Hemmung der MiRNA Aktivitäten26,27. In MS-1-Zellen MiRNA Aktivitäten können robust durch MiRNA mimischen Oligonukleotide oder MiRNA LNA-basierten Inhibitoren moduliert werden und mehrere nachgeschaltete Assays, einschließlich Analyse der RNA-Seq problemlos, durchgeführt (Abb. 3). Basierend auf integrative Transkriptom-Analyse, haben wir zuvor konstitutiv aktiv MiR-31 mit EndMT Regulierung im MS-1 Zellen26verknüpft. RNA-Seq Analyse zeigte, dass Hemmung von MiR-31 LNA MiRNA Inhibitor Ergebnisse Dämpfung der Induktion der mesenchymalen Marker (Abbildung 3A) und EndMT-SP-Gene (Abbildung 3), während es Induktion von konventionellen TGF-β-Ziel nicht beeinflusst Genen wie Fibronektin 1, PAI-1 und Smad7 (Abb. 3 b) und Downregulation endotheliale Marker (Abbildung 3D)26. TGF-β und MiR-31 Downregulate Stk40, ein negativer Regulator des NF-κB-Signalweg, fungiert als potenzielle Regulator der EndMT SP. Obwohl TGF-β den Ausdruck von MiR-31 nicht ansteigt, induziert TGF-β alternative Polyadenylation-vermittelten Ausschluss der internen poly(A) Sequenz in Stk40 3' UTR, wodurch Ausrichtung der Stk40 von konstitutiv aktiven MiR-31 und schließlich unterdrücken Stk4026. Darüber hinaus untersuchten wir zuvor die Rollen der TGF-β-induzierbaren MiR 27 b in der EndMT27. Hemmung der MiR-27 unterdrückt Hochregulation der mesenchymalen Marker (Abbildung 3A) während die Effekte auf herkömmliche TGF-β Zielgene, EndMT-SP-Gene und endotheliale Marker waren marginal (Zahlen 3 b, 3 C und 3D)27 .

Figure 1
Abbildung 1 : Induktion von EndMT in MS-1 Zellen durch TGF-β. (A) Aktin Reorganisation in MS-1 Zellen nach 24 h von TGF-β2-Behandlung (1 ng/mL). (B) Morphological ändert sich in MS-1-Zellen nach 72 h der TGF-β2-Behandlung (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analysiert für VE-Cadherin und α-SMA in MS-1-Zellen nach 72 h der TGF-β2-Behandlung (1 ng/mL). (D, E) Veränderungen in der α-SMA, bestimmt durch quantitative RT-PCR Standardanalyse (D) und Western blot Analyse (E). (F) Kollagen gel Kontraktion Assay. Das Verhältnis der Fläche nach 72 h Kultur mit/ohne TGF-β2-Behandlung (1 ng/mL), die ursprüngliche Oberfläche werden angezeigt. Skalieren von Balken = 20 μm (A und C) und 200 μm (B). Zahlen werden von Mihira Et Al. geändert. 20. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Reversible Wirkung von TGF-β in MS-1 Zellen. (A) α-SMA mRNA Expression und (B) Zellmorphologie nach Abzug der TGF-β2 in MS-1-Zellen. Skalieren von Balken = 200 μm. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : RNA-Seq-Analyse in MS-1 Zellen. Nach Einführung der LNA MiRNA-Inhibitoren und Behandlung mit TGF-β2 (72 h) wurde RNA-Seq-Analyse durchgeführt26,27. NC: Negativkontrolle. Veränderungen der repräsentativen Gene werden angezeigt (A, mesenchymalen Marker; B, herkömmliche TGF-β-Zielgene; C, EndMT-SP-Gene; und D, endotheliale Marker). FPKM (Fragmente pro Kilobase Abschrift pro million zugeordneten liest) Werte wurden mit den Werten einer Kontrollprobe (LNA-NC ohne TGF-β2-Behandlung) normalisiert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen.

Zelltyp Zustand der mesenchymalen Marker Induktion Referenz
menschlichen nabelader endothelial Zellen (HUVECS) Induktion von mesenchymalen Differenzierung Medium (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5-21 Tagen. Krenning Et al.
menschlichen kutanen mikrovaskuläre Endothelzellen (HCMEC) Induktion durch TGF-β2 (10 ng/mL), ohne FBS, 2 Tage. Medici Et al.
menschlichen koronaren Endothelzellen (HCEC) Induktion durch TGF-β1 (10 ng/mL), 6 Tage. Hemmung von BMP-7. Zeisberg Et al.
Maus Lunge Endothelzellen (MLEC) Induktion durch TGF-β1 (10 ng/mL), reduzieren auf 2 % FBS, ohne endotheliale Mitogen, 2 Tage. Zeisberg Et Al.
Ratte Gehirn endothelial Zellen (BEC) Induktion durch TGF-β1 (10 ng/mL), 2 Tage. Krizbai Et al.
Bovine Aorten Endothelzellen (BAEC) Induktion durch TGF-β1 (1 ng/mL), 5 Tage. Arciniegas Et al.
verewigt bovine retinalen mikrovaskuläre Endothelzellen (iBREC) Induktion durch TGF-β2 (10 ng/mL), 3 – 6 Tage. Deissler Et al.
Schafe Aortenklappe Endothelzellen Induktion durch TGF-β1 oder 3 (1 ng/mL), 6 Tage. Paranya Et al.
MS-1 Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen Induktion durch TGF-β (10 ng/mL), aktiviert Ras Ausdruck, 1 Tag. Hashimoto Et al.
MS-1 Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen Induktion durch TGF-β2 (1 ng/mL), 2 – 3 Tage. Mihira Et al.

Tabelle 1: Induktion von EndMT durch TGF -β in verschiedenen Endothelzellen. Kulturbedingungen der EndMT Induktion von TGF-β werden zusammengefasst. Änderungen im Kulturbedingungen einschließlich Serum-Konzentration und Hinzufügung oder Entfernung von anderen Wachstumsfaktoren sind ebenfalls vermerkt.

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Discussion

Es wurde berichtet, dass aktivierte Ras und TGF-β Behandlung für 24 h EndMT in MS-1-Zellen, induzierten während TGF-β allein nicht EndMT in diesem kurzen Zeitraum21zu induzieren. Konsequent haben wir beobachtet, dass TGF-β wesentlich EndMT nach längerer Behandlung (48-72 h) in MS-1 Zellen20induziert. EndMT wurde wiederholt beobachtet, nachdem längere Behandlung mit TGF-β (2 – 6 Tage) in verschiedenen Endothelzellen wie menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS), menschliche kutanen mikrovaskuläre Endothelzellen (HCMEC), menschliche koronaren Endothelzellen) HCEC), Maus Lunge Endothelzellen (MLEC), Ratte Gehirn endothelial Zellen (BEC), bovine Aorten Endothelzellen (BAEC), verewigt bovine retinalen mikrovaskuläre Endothelzellen (iBREC) und Schafe Aorten Ventil Endothelzellen8, 18,29,30,31,32,33,34. In Tabelle 1zusammengefasst wir die Bedingungen der mesenchymalen Marker Induktion von TGF-β in verschiedenen Endothelzellen8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Vergleich von diesen Berichten zufolge jede Endothelzellen Linie verschiedene Schwellenwerte für EndMT hat. Unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber TGF-β oder andere Mechanismen kann diverse EndMT-pathologische Erkrankungen in verschiedenen Organen zugrunde liegen. Dies sollte zusammen mit den Ergebnissen von in Vivo Studien berücksichtigt werden.

Die Details der in-vitro- EndMT Induktion Protokoll müssen in verschiedenen Zelllinien angepasst werden: zB., Konzentration von TGF-β, Konzentration von Serum, hinzufügen oder Entfernen von anderen Wachstumsfaktoren und kulturdauer. Zum Beispiel Mediumwechsel reagieren häufig schlecht auf TGF-β und EndMT würde durch Kombination mit anderen Faktoren wie PDGF-BB und entzündliche Reize bzw. Modulation der Serum-Konzentration und anderen mittelkomponenten in eine längere Kultur Einstellung29 verursacht werden , 35. Darüber hinaus Overconfluency die Antworten auf die TGF-β verringern würde.

EndMT ist ein dynamischer Prozess und ein entgegengesetzter Prozess namens mesenchymalen endotheliale Übergang (MEndoT) wurde kürzlich berichtet36. Während der Induktion von mesenchymalen Marker von TGF-β allein in MS-1-Zellen (Abbildung 2) rückgängig gemacht werden kann, es wurde berichtet, dass Downregulation der endotheliale Marker in der MS-1-Zellen mit aktivierter Ras blieb nach Abzug der TGF-β-21. Irreversible EndMT wurde auch in iBREC und Schafe Aortenklappe Endothelzellen33,34berichtet. Darüber hinaus zeigte ein früheren Bericht, dass der EndMT-Prozess nach Abzug der TGF-β durch eine nachhaltige Aktivierung des Ras-GTP und Methylierung des Promotors in menschlichen koronaren Endothelzellen37RASAL1 beibehalten. So kann auch diese Modelle im Vergleich zu verstehen, die regulatorischen Mechanismen der Endothelzellen Plastizität nützlich.

Reaktionsfähigkeit der Endothelzellen, EndMT Induktion scheint wesentlich heterogener38sein. Xiao Et Al. berichteten, dass tumorspezifische endotheliale Zellen aus einem Mamma-Tumor-Modell verschiedene Formen der EndMT als Reaktion auf die TGF-β-Stimulation-38 zeigen. TGF-β-orientierte EndMT ist auch durch andere Signalwege, darunter IL-1β FGF-2 und BMP-735,37,38moduliert. Wir fanden auch, dass TNF-α erhöht die TGF-β-induzierte EndMT und EndMT-SP in MS-126 Zellen. Darüber hinaus ist es bekannt, dass EndMT durch andere Signalwege, darunter Wnt, Kerbe und Hypoxie1induziert wird. Kombination mit anderen reizen in verschiedenen Endothelzellen möglicherweise so wichtig zu verstehen, Heterogenität der EndMT Reaktionsfähigkeit.

Die hier vorgestellten EndMT-Protokoll kann leicht geändert werden, um die Regulatoren der EndMT zu untersuchen. In der Tat haben wir verschiedene Regulatoren der EndMT in MS-1 Zellen20,26,27gekennzeichnet. Ein Guanin-Nukleotid Exchange Faktor Arhgef5 und Myocardin-bezogenen Transkriptionsfaktor-A (MRTF-A) werden durch die Smad Signale induziert, und beide tragen zur α-SMA Hochregulation in MS-1 Zellen20. So, TGF-β-Signalisierung aktiviert beide Rho-Signale und MRTF-A, EndMT zu induzieren. Darüber hinaus fanden wir auch, dass konstitutiv aktiv MiR-31 und TGF-β-induzierbaren MiR-27 b positiv EndMT Induktion26,27regulieren. In MS-1-Zellen ist konstitutiv aktiv MiR-31 auch für TGF-β-induzierte EndMT-SP26notwendig. Alles in allem wäre diese in-vitro- EndMT Induktion Verfahren sinnvoll Verständnis der Biologie von EndMT, EndMT-assoziierten gen Signaturen identifizieren und entwickeln Strategien, um diesen Prozess zu modulieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Zea Borok und Kohei Miyazono für Anregungen bei der Vorbereitung des Manuskripts. H.I.S und m.h. werden unterstützt durch Uehara Memorial Foundation Research Fellowship und H.I.S stützt sich auf die Osamu Hayaishi Memorial Scholarship für Study Abroad. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Takeda Science Foundation (A.S.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung
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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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