Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Molekylær analyse av Endothelial-mesenchymal overgang av omforming vekst faktor-β signalisering

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

En protokoll for i vitro induksjon av endothelial-mesenchymal overgang (EndMT), som er nyttig for å undersøke mobilnettet signalveier involvert i EndMT, er beskrevet. I denne eksperimentelle modellen er EndMT indusert av behandling med TGF-β i MS-1 endotelceller.

Abstract

Fenotypiske plastisitet av endotelceller ligger under kardiovaskulære systemutvikling, kardiovaskulære sykdommer og ulike forhold knyttet til orgel fibrose. I disse forholdene erverve differensiert endotelceller mesenchymal-lignende fenotyper. Denne prosessen kalles endothelial-mesenchymal overgang (EndMT) og er preget av downregulation av endothelial markører, oppregulering av mesenchymal markører og morfologiske endringer. EndMT er indusert av flere signalveier, inkludert omforming vekst faktor (TGF)-β, Wnt og hakk, og regulert av molekylære mekanismer ligner på de av epitelial-mesenchymal overgang (EMT) viktig for gastrulation, vev fibrosis, og kreft metastasering. Forstå mekanismene av EndMT er viktig å utvikle diagnostiske og terapeutiske metoder rettet mot EndMT. Robust induksjon av EndMT i vitro er nyttig å karakterisere felles genuttrykk signaturer, identifisere druggable molekylære mekanismer og skjerm for modulatorer av EndMT. Her beskriver vi en i vitro metode for induksjon av EndMT. MS-1 musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller gjennomgå EndMT etter langvarig eksponering for TGF-β og Vis oppregulering av mesenchymal markører og morfologiske endringer og induksjon av flere inflammatorisk chemokines og cytokiner. Metoder for analyse av microRNA (miRNA) modulering er også inkludert. Disse metodene gir en plattform for å undersøke mekanismene bak EndMT og bidrag av miRNAs til EndMT.

Introduction

Endothelial-mesenchymal overgang (EndMT) er prosessen der en differensiert endothelial celle gjennomgår ulike molekylær endringer, som resulterer i en fibroblast-lignende mesenchymal celle1. EndMT ble først beskrevet som en endothelial celle transformasjon under utviklingen av hjertet2,3. I tidlig heart utvikling består hjertet røret av en indre endocardium og en ytre myokard. Disse to lagene er atskilt av et ekstracellulær matrix kalles cardiac gelé. Embryonale endocardial celler som skaffer endothelial celle markører, transitt i mesenchymal celler, invadere underliggende cardiac gelé og fremme dannelsen av cardiac puter, som er grunnlaget for atrioventrikulær ventiler og septum og semilunar ventiler. Videre har EndMT blitt foreslått for å være kilder til pericytes og vaskulær glatte muskelcellene i andre embryonale vaskulære systemer inkludert koronar fartøy, abdominal aorta og lungearterien4,5,6. I tillegg er EndMT innblandet i fysiologiske angiogenic spirende7.

Samler bevis har foreslått at EndMT er også involvert i flere karsykdommer og andre sykdommer1,8. EndMT-assosiert tilstandene omfatter vaskulær forkalkninger, atherosclerosis, pulmonal arteriell hypertensjon, kavernøse misdannelse, orgel fibrose, vene pode remodeling, allograft dysfunksjon i nyre transplantasjon, og kreft8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en fersk rapport beskrevet at flere molekylære EndMT markører kan være et verktøy for diagnose og prognose prediksjon av nyre pode dysfunksjon i nyre transplantasjon17. Modulering av EndMT-relaterte mobilnettet signalveier har vist seg å forbedre flere sykdom betingelser inkludert cardiac fibrose og vene pode remodeling i dyr modeller8,15. Forstå mekanismene er underliggende EndMT derfor viktig å utvikle diagnostiske og terapeutiske strategier målretting EndMT.

EndMT er preget av tap av celle-celle veikryss, økning i vandrende potensial, downregulation av endothelial-spesifikke gener som VE-cadherin og oppregulering av mesenchymal gener inkludert α-glatt muskel utgangen (α-SMA). I tillegg er EndMT og epithelial-mesenchymal overgang (EMT), en tilsvarende prosess som konverterer epitelceller mesenchymal celler, forbundet med meditativ produksjon av ulike ekstracellulær matrix komponenter som kan bidra til utvikling vev fibrose8,19.

Flere i vitro studier av EndMT har nylig belyst detaljer om molekylære mekanismer EndMT15,20. EndMT er indusert av ulike signalveier inkludert omforming vekst faktor (TGF)-β, Wnt, og hakk1. Blant dem spiller TGF-β viktige roller i induksjon av både EMT og EndMT. I EndMT, langvarig eksponering for TGF-β resultater i EndMT i forskjellige endotelceller, mens kort eksponering synes å være utilstrekkelige21. Vi her har beskrevet en enkel protokoll for EndMT induksjon, i hvilken MILE SVEN 1 (MS-1) musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller gjennomgå EndMT i vitro etter langvarig eksponering for TGF-β20. I denne modellen, kan flere nedstrøms analyser utføres for å undersøke hallmark funksjoner i EndMT, inkludert morfologiske endringer, downregulation av endothelial markører, oppregulering av mesenchymal markører og provoserende gener, cellen cytoskjelett rearrangements og kollagen gel sammentrekning.

MicroRNAs (miRNAs) er ~ 22 nt liten regulatoriske RNAs som direkte posttranscriptional undertrykkelse av ulike mRNA mål22,23. Gjennom frø sekvens-mediert målet anerkjennelse, miRNAs undertrykke hundrevis av målet gener og modulere mangfoldig cellular funksjonene som celledifferensiering, spredning og motilitet. Dette er også tilfelle for regulering av EMT og EndMT, og flere miRNAs har blitt rapportert som regulatorer av EMT og EndMT24,25. EndMT modellen presentert i denne gjennomgangen kan lett kombineres med miRNA modulering prosedyrer å teste rollene som miRNAs i EndMT. Stede gjennomgangen oppsummerer våre eksperimentelle prosedyrer for å undersøke TGF-β-indusert EndMT i MS-1 celler og inneholder sammenligning av betingelser for EndMT induksjon av TGF-β i andre endotelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. induksjon av EndMT

  1. Opprettholde MS-1 celler i standard oppdrettsforholdene og unngå confluency. En kilde til MS-1 celler er beskrevet i Tabellen for materiale. For MS-1 celler, kan du bruke Minimum nødvendig Medium-α (MEM-α) med 10% fosterets kalv serum (FCS), 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin.
  2. Vask MS-1 celler på 10 cm rett med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) og tilsett 1,0 mL av trypsin til platen. Inkuber i 5 min på 37 ° C.
  3. Koble celler med 9 mL kultur medier. Samle celle suspensjon i en 15 mL tube.
  4. Sentrifuge celle suspensjon 300-400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Nøye fjerne nedbryting og avbryte celle pellet forvarmes kultur medier.
  6. Antall levedyktige cellers Trypan blå løsning og en standard hemocytometer eller en automatisk celle teller.
  7. Plate MS-1 celler på ubestrøket standard kultur plater på 0,5 x 103 celler per cm2 for lang sikt kultur. For eksempel kultur plate 5.0 x 103 celler per brønn i en 6 vel plate. Bruk den samme kultur mediet inkludert samme konsentrasjonen av FCS. I MS-1 celler induserer TGF-β EndMT i langsiktig kultur (minst 48-72 h) med bruk av FCS.
  8. Stimulere endotelceller med TGF-β2 (en siste konsentrasjon av 1 ng/mL) etter 24 timer.
  9. Kultur celler i en fuktet inkubator (5% CO2, 37 ° C). Overvåke celler daglig når fokuserer på morfologiske endringer.
  10. Erstatt media med fersk forvarmes kultur medier som inneholder TGF-β2 etter 48 h behandling med TGF-β i langsiktig kultur.
  11. Videre til nedstrøms analysene. Vanligvis begrepsordbok omorganisering er observert etter 24 timer for behandling, og downregulation av endothelial markører og oppregulering av mesenchymal markører er observert etter 48-72 h behandling med TGF-β.

2. Immunocytochemical analyse

  1. Opprettholde MS-1 celler i standard oppdrettsforholdene.
  2. Plate MS-1 celler på 4 celle vel kultur kammer lysbilder til 1,0 x 103 celler per brønn (1,7 cm2). Lysbilder er pre-belagt med gelatin. Bruk 0,5 til 1,0 mL kultur medier per brønn.
  3. Stimulere endotelceller med TGF-β2 (en siste konsentrasjon av 1 ng/mL) etter 24 timer. Når analysere involvering av ROCK i EndMT, legge en ROCK hemmer Y-27632 (10 μM) 1 time før TGF-β behandling. Når vurdere effekten av TGF-β signalnettverk hemming, kan TGF-β reseptor kinase hemmere brukes.
  4. Kultur celler i en fuktet inkubator (5% CO2, 37 ° C). Utgangen omorganisering er observert i MS-1 celler etter 24 h behandling med TGF-β. Andre endringer blir tydelig etter 48-72 timer med behandling. For 72 h kultur, erstatte media med fersk mediet som inneholder TGF-β etter 48 h behandling med TGF-β.
  5. F-utgangen flekker
    1. Etter 24 h TGF-β behandling, fjerne media, fikse celler med 4% paraformaldehyde i 1 x PBS for 20 min ved romtemperatur og skyll celler med 1 x PBS.
    2. Inkuber med 0,2% Triton X-100 i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Skyll celler tre ganger med 1 x PBS.
    4. Inkuber med phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate fra fluesopp fortynnet 150-fold med blokkering buffer 1t ved romtemperatur.
    5. Skyll celler tre ganger med 1 x PBS.
    6. Stain kjerner med cyanine nukleinsyre bindende fargestoffer i 5 minutter ved romtemperatur.
    7. Skyll lysbilder og mount coverslips ansiktet i et lysbilde med lysbildet montering media.
    8. Observere med AC confocal mikroskop. Bruk en 543 nm laser og et utslipp filter av 560-615 nm for påvisning av fluorescens av phalloidin. Bruk en 633 nm laser og en utslipp filter lengre enn 650 nm for kjernefysisk flekker. Ved behandling med TGF-β, ville dannelsen av tykk stress fiber være observert.
  6. VE-cadherin og α-SMA flekker
    1. Etter 72 h TGF-β behandling, fjerne media, fastsette celler med kaldt 50% metanol og 50% aceton (0,5 til 1,0 mL per brønn) i 5 min.
    2. Skyll celler tre ganger med 1 x PBS (0,5 til 1,0 mL per brønn).
    3. Inkuber med primære antistoffer blokkere buffer overnatting på 4 ° C i mørket etter produsentens anbefalte konsentrasjon. Bruk VE-cadherin monoklonalt antistoff (BV13, 1: 100 fortynning) og Cy3-konjugerte α-SMA monoklonalt antistoff (1A4, 1:200 fortynning)20.
    4. Skyll celler tre ganger med 1 x PBS.
    5. Inkuber celler med en grønn farge-konjugerte sekundære antistoffer mot VE-cadherin antistoffer blokkere buffer 1t ved romtemperatur i mørket etter produsentens anbefalte konsentrasjon.
    6. Skyll celler tre ganger med 1 x PBS.
    7. Stain kjerner med cyanine nukleinsyre bindende fargestoffer i 5 minutter ved romtemperatur.
    8. Skyll lysbilder og mount coverslips ansiktet i et lysbilde med lysbildet montering media.
    9. Observere med AC confocal mikroskop. Bruk en 543 nm laser og et utslipp filter av 560-615 nm for påvisning av α-SMA (Cy3). Bruk en 488 nm laser og et utslipp filter av 505-550 nm for påvisning av VE-cadherin. Vanligvis på behandling med TGF-β behandling, nedgang i VE-cadherin signaler og økning i α-SMA signaler ville være observert.

3. tredimensjonale kollagen Gel sammentrekning analysen

  1. Utføre kultur av MS-1 celler med/uten TGF-β 72 h før kollagen gel sammentrekning analysen.
  2. Forberede type jeg kollagen gel på isen. Bland kaldt kollagen løsning, 10 x konsentrert MEM medium og kollagen fortynning buffer inneholder 0,05 N NaOH, 2.2% NaHCO3og 200 mM HEPES pH 7.4 på en 8:1:1 ratio.
  3. Bland 200 mL kontroll eller TGF-β-behandlet endothelial celle suspensjoner (1.0 x 106 celler/200 μL) og 800 µL kollagen gel løsningen. TGF-β behandlet prøver, legge TGF-β2 (1 ng/mL) til celle suspensjon.
  4. Tilsett 1,0 mL av blandingen i hver brønn av 12-brønnen plater og la stivne i kuvøse på 37 ° C i 30-60 minutter.
  5. Etter gelatinization, overlappe 1,0 mL av MEM-α inneholder 10% FCS, 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin flyte gel. TGF-β behandlet prøver, legge TGF-β2 (1 ng/mL) til media.
    Merk: For TGF-β behandlet prøver, legge TGF-β både gel og kultur medier.
  6. Inkuber flytende geléer ved 37 ° C i 48 timer.
  7. Skanne bilder av gels fra bunnen av plater ved hjelp av en skanner. Eventuelt registrere bilder av gels bruker et digitalt kamera i en fast avstand over geléer.
  8. Kvantifisere gel arealet basert på antallet piksler med ImageJ. Velg gel bruker et Frihånd utvalg eller relaterte verktøy, eller velg gel med "bilde | Justere | Color terskelen"verktøyet, og kontroller deretter området gel bruker" analyser | Tiltak"-kommandoen.

4. hemming av miRNA aktiviteter av låst Nucleic Acid-baserte miRNA hemmere

  1. Opprettholde MS-1 celler i standard oppdrettsforholdene.
  2. Transfect låst Nucleic Acid (LNA) miRNA hemmere, syntetiske miRNA duplexes eller siRNAs (20 eller 50 nM) bruker lipofection reagenser i henhold til produsentens instruksjoner. Detaljer og kilder LNA miRNA hemmere, syntetiske miRNA duplexes og siRNAs ble beskrevet i våre tidligere rapporter26,27. I MS-1 celler, standard hva prosedyrer basert på produsentens instruksjoner fungerer bra for innføring av LNA miRNA hemmere, syntetiske miRNA duplexes eller siRNAs.
  3. Etter 16 – 48 h, stimulere endotelceller med TGF-β2 (en siste konsentrasjon av 1 ng/mL).
  4. Videre til ulike nedstrøms analyser inkludert RNA uttrykk analyse (kvantitative RT PCR og RNA-sekvenser (RNA-seq) analyser), immunocytochemical analyse og reporter analysen. Nedstrøms analyser er beskrevet i våre tidligere rapporter20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β er en potent induser av EndMT i forskjellige endotelceller. Etter 24 timer behandling med TGF-β i MS-1 celler viser flekker for F-utgangen omorganisering av utgangen stress fiber (figur 1A)20. Forbehandling med en ROCK hemmer Y-27632 hemmer induksjon av utgangen omorganisering20. MS-1 endotelceller endres fra en klassisk brosteinsbelagte-lignende morfologi til en mesenchymal spindel-formet morfologi på TGF-β behandling (figur 1B). TGF-β-behandlet cellene mister celle-celle kontakt. Etter behandling med TGF-β 48-72 h viser immunocytochemical analyser redusert uttrykk for VE-cadherin og økt uttrykk for α-SMA (figur 1 c). TGF-β induserer drastisk uttrykk for α-SMA på både mRNA og protein i MS-1 celler etter 48-72 timer med behandling (tall 1 d og 1E). Pattedyr TGF-β inkluderer TGF-β1, 2 og 3 isoformene. En tidligere studie med musen kultivert endocardial pute explants har vist at TGF-β2 men ikke TGF-β3 er obligatorisk for transformasjonen av endocardial pute celler28. På den annen side, vi tidligere sammenlignet effekten av tre isoformene på α-SMA uttrykk og bekreftet at alle isoformene tilsvarende indusert α-SMA uttrykk i MS-1 celler20. Kollagen gel sammentrekning analysen viser forbedret sammentrekning av kollagen type jeg gel av MS-1 cellene etter TGF-β behandling (figur 1F). Dette antyder oppkjøpet av mesenchymal celle remodel ekstracellulær matrix. Disse funksjonene er kjennemerket trekk ved EndMT20. I vår forrige rapport20undertrykt behandling med en ROCK hemmer Y-27632 sterkt induksjon av mesenchymal markører α-SMA og SM22α uten samtidig undertrykkelse av induksjon av andre TGF-β målet gener som Fibronectin 1 og MMP-2.

EndMT er en svært dynamisk prosess. MS-1 celler er effekten av TGF-β på α-SMA uttrykk og morfologi reversibel; etter TGF-β deprivasjon gjenopprette α-SMA uttrykk synker til basale nivåer (figur 2A) og celler en brosteinsbelagt-lignende morfologi (figur 2B). I tillegg er induksjon av EndMT og EMT tilknyttet dynamiske endringer i sekretoriske kapasitet av flere chemokines og cytokiner. Flere inflammatorisk chemokines og cytokiner inkludert CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6, og Angptl2 er indusert av TGF-β i MS-1 celler, som vi tidligere utpekt EndMT-assosiert sekretoriske fenotypen (EndMT-SP)26. Denne eksperimentell modell er nyttig å undersøke mulige regulatorer av EndMT og EndMT-SP. Vi har tidligere studert rollene til flere miRNAs i EndMT ved å forbedre eller hemme miRNA aktiviteter26,27. MiRNA aktiviteter kan være robust modulert av miRNA etterligne oligonucleotides eller LNA-baserte miRNA hemmere MS-1 celler, og flere nedstrøms analyser inkludert RNA-seq analyse kan være lett utført (Figur 3). Basert på integrerende transcriptome analyse, har vi tidligere koblet constitutively aktive miR-31 til EndMT regulering i MS-1 celler26. RNA-seq analyse viste at hemming av miR-31 av LNA miRNA hemmer resultater i demping av induksjon av mesenchymal markører (figur 3A) og EndMT-SP gener (Figur 3 c), mens den ikke påvirker induksjon av konvensjonelle TGF-β mål gener som Fibronectin 1, PAI-1 og Smad7 (figur 3B) og downregulation endothelial markører (figur 3D)26. Både TGF-β og miR-31 downregulate Stk40, en negativ regulator av NF-κB veien, som fungerer som en potensiell regulator EndMT-SP Selv om TGF-β ikke øker uttrykket av miR-31, induserer TGF-β alternativ polyadenylation-mediert utelukkelse av interne poly(A) rekkefølgen Stk40 3' UTR, og dermed bedre målretting av Stk40 av grunnleggende aktive miR-31 og endelig undertrykke Stk4026. Dessuten, undersøkte vi tidligere rollene TGF-β-induserbart miR-27b i EndMT27. Hemming av miR-27 undertrykt oppregulering av mesenchymal markører (figur 3A) mens effekten på konvensjonelle TGF-β målet gener, EndMT-SP gener, og endothelial markører var marginale (tall 3B, 3 C og 3D)27 .

Figure 1
Figur 1 : Induksjon av EndMT i MS-1 celler av TGF-β. (A) utgangen omorganisering i MS-1 celler etter 24 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (B) Morphological endringer i MS-1 celler etter 72 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analyserer VE-cadherin og α-SMA i MS-1 celler etter 72 h TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (D, E) Uttrykket endringer i α-SMA, bestemmes av standard kvantitative RT PCR analyse (D) og Western blot analyse (E). (F) kollagen gel sammentrekning analysen. Forholdet mellom arealet etter 72 h kultur med/uten TGF-β2 behandling (1 ng/mL) til opprinnelige overflaten vises. Skalere barer = 20 μm (A og C) og 200 μm (B). Tall er endret fra Mihira et al. 20. feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Reversibel virkningene av TGF-β i MS-1 celler. (A) α-SMA mRNA uttrykk og (B) celle morfologi etter tilbaketrekning av TGF-β2 i MS-1 celler. Skalere barer = 200 μm. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : RNA-seq analyse i MS-1 celler. Etter innføringen av LNA miRNA hemmere og behandling med TGF-β2 (72 h) var RNA-seq analyse utført26,27. NC: negativ kontroll. Uttrykket endringer av representant gener vises (A, mesenchymal markører; B, konvensjonelle TGF-β målet gener; CEndMT-SP gener; og D, endothelial markører). FPKM (fragmenter per kilobase av transkripsjon per million tilordnet leser) verdier var normalisert av verdiene til en kontroll prøven (LNA-NC uten TGF-β2 behandling). Feilfelt representerer standardavvik.

Celle type Tilstand av mesenchymal markør induksjon Referanse
menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC) Induksjon av mesenchymal differensiering medium (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5 – 21 dager. Krenning et al.
menneskelige kutan mikrovaskulær endotelceller (HCMEC) Induksjon av TGF-β2 (10 ng/mL), uten FBS, 2 dager. Medici et al.
menneskelige koronar endotelceller (HCEC) Induksjon av TGF-β1 (10 ng/mL), 6 dager. Hemming av BMP-7. Zeisberg et al.
musen lunge endotelceller (MLEC) Induksjon av TGF-β1 (10 ng/mL), redusere til 2% FBS, uten endotelial mitogen, 2 dager. Zeisberg et al.
rotte hjernen endotelceller (BEC) Induksjon av TGF-β1 (10 ng/mL), 2 dager. Krizbai et al.
storfe aorta endotelceller (BAEC) Induksjon av TGF-β1 (1 ng/mL), 5 dager. Arciniegas et al.
udødeliggjort bovin retinal mikrovaskulær endotelceller (iBREC) Induksjon av TGF-β2 (10 ng/mL), 3 – 6 dager. Deissler et al.
ovine Aortaklaff endotelceller Induksjon av TGF-β1 eller 3 (1 ng/mL), 6 dager. Paranya et al.
MS-1 musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller Induksjon av TGF-β (10 ng/mL), aktivert Ras uttrykk, 1 dag. Hashimoto et al.
MS-1 musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller Induksjon av TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 dager. Mihira et al.

Tabell 1: induksjon av EndMT av TGF -β i forskjellige endotelceller. Oppdrettsforholdene av EndMT induksjon av TGF-β oppsummeres. Endringer i kultur betingelser inkludert serum konsentrasjonen og tillegging eller fjerning av andre vekst faktorer er også bemerket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har blitt rapportert at aktivert Ras og TGF-β behandling for 24 h indusert EndMT i MS-1 celler, mens TGF-β alene mislyktes å indusere EndMT i denne korte perioden21. Konsekvent, observerte vi at TGF-β vesentlig indusert EndMT etter lengre behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT er observert flere ganger etter langvarig behandling med TGF-β (2 – 6 dager) i forskjellige endotelceller som menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), menneskelige kutan mikrovaskulær endotelceller (HCMEC), menneskelige koronar endotelceller ( HCEC), mus lunge endotelceller (MLEC), rotte hjernen endotelceller (BEC), storfe aorta endotelceller (BAEC), udødeliggjort bovin retinal mikrovaskulær endotelceller (iBREC) og ovine aorta ventil endotelceller8, 18,29,30,31,32,33,34. I tabell 1oppsummert vi forholdene på mesenchymal markør induksjon av TGF-β i forskjellige endotelceller8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Sammenligning av disse rapportene tyder på at hver endothelial celle linje har forskjellige terskler for EndMT. Differensial følsomhet TGF-β eller andre mekanismer kan populasjonsgjennomsnittet varierte EndMT patologiske forhold i ulike organer. Dette bør vurderes sammen med resultatene av studier i vivo .

Detaljer om i vitro EndMT induksjon protokollen måtte skreddersys i ulike linjer: f.eks., konsentrasjonen av TGF-β, konsentrasjonen av serum, tillegg eller fjerning av andre vekstfaktorer og kultur periode. For eksempel HUVECs ofte dårlig svare TGF-β og EndMT ville bli overtalt kombinasjon med andre faktorer som PDGF-BB og provoserende stimuli og/eller modulering av serum konsentrasjonen og andre mellomstore komponenter i en lengre kulturen innstillingen29 , 35. I tillegg overconfluency vil redusere svar TGF-β.

EndMT er en dynamisk prosess og en motsatt prosess kalt mesenchymal-endothelial overgang (MEndoT) har vært nylig rapportert36. Mens induksjon av mesenchymal markører av TGF-β alene er reversibel i MS-1 celler (figur 2), det har blitt rapportert at downregulation av endothelial markører i MS-1 celler med aktivert Ras vedvarte etter tilbaketrekning av TGF-β21. Hvor EndMT er også rapportert i iBREC og ovine Aortaklaff endotelceller33,34. I tillegg viste en tidligere rapport at EndMT prosessen vedvarte etter tilbaketrekning av TGF-β en vedvarende aktivering av Ras-GTP og metylering RASAL1 formidler i menneskelig koronar endotelceller37. Dermed kan sammenligning av disse modellene være også nyttig å forstå de regulatoriske mekanismene av endothelial celle plastisitet.

Responsen til endotelceller til EndMT induksjon synes å være vesentlig heterogene38. Xiao et al. rapportert at svulsten-spesifikke endotelceller fra mammary svulst modell viser forskjellige former for EndMT svar på TGF-β stimulering38. TGF-β-drevet EndMT er også modulert av andre signalveier inkludert FGF-2, BMP-7 og IL-1β35,37,38. Vi fant også at TNF-α forbedrer TGF-β-indusert EndMT og EndMT-SP MS-1 cellene26. Videre er det kjent at EndMT er indusert av andre signalveier inkludert Wnt hakk og hypoksi1. Dermed, sammen med andre stimuli i forskjellige endotelceller kan være viktig å forstå heterogenitet EndMT respons.

EndMT protokollen presenteres her kan enkelt endres for å undersøke regulatorer av EndMT. Faktisk har vi preget ulike regulatorer av EndMT i MS-1 celler20,26,27. En guanine nukleotid utveksling faktor Arhgef5 og myocardin-relaterte transkripsjon-en (MRTF-A) er forårsaket av Smad signaler, og både bidra til α-SMA oppregulering i MS-1 celler20. Dermed TGF-β signalering aktiverer både Rho signaler og MRTF-A å indusere EndMT. Dessuten, fant vi også at constitutively aktive miR-31 og TGF-β-induserbart miR-27b positivt regulere EndMT induksjon26,27. I MS-1 celler er constitutively aktive miR-31 også nødvendig for TGF-β-indusert EndMT-SP26. Samlet vil disse i vitro EndMT induksjon-prosedyrer være nyttig for forstå EndMT biologi, identifisere EndMT-assosiert genet signaturer og utvikle strategier for å modulere denne prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Zea Borok og Kohei Miyazono for forslag i utarbeidelsen av manuskriptet. H.I.S. og M.H. støttes av forskningsstipend for Uehara Memorial Foundation, og H.I.S. er støttet av Osamu Hayaishi Memorial stipend for studier i utlandet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Takeda Science Foundation (AS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42, (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77, (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80, (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12, (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35, (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13, (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125, (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129, (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131, (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498, (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225, (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6, (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67, (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18, (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151, (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43, (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88, (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149, (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9, (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109, (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21, (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161, (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248, (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29, (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437, (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10, (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103, (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18, (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159, (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218, (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514, (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105, (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75, (7), 1244-1254 (2015).
Molekylær analyse av Endothelial-mesenchymal overgang av omforming vekst faktor-β signalisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter