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Biology

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Abstract

Plasticidade fenotípica de células endoteliais está subjacente o desenvolvimento do sistema cardiovascular, doenças cardiovasculares e várias condições associadas com fibrose do órgão. Nestas condições, as células endoteliais diferenciadas adquirem fenótipos mesenquimais semelhante. Este processo é chamado de transição endotelial-mesenquimais (EndMT) e é caracterizado por downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de marcadores mesenquimais e alterações morfológicas. EndMT é induzida por várias vias de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe e regulado por mecanismos moleculares semelhantes de transição epitelial-mesenquimal (EMT) importante para gastrulação, fibrose do tecido, e metástase do cancro. Compreender os mecanismos da EndMT é importante para desenvolver abordagens diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT. Indução robusta do EndMT em vitro é útil para caracterizar assinaturas de expressão de gene comum, identificar mecanismos moleculares druggable e tela para moduladores de EndMT. Aqui, descrevemos um método em vitro para indução de EndMT. Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 submetido a EndMT após a exposição prolongada ao TGF-β e mostram upregulation de marcadores mesenquimais e mudanças morfológicas, bem como a indução de múltiplos inflamatórias quimiocinas e citocinas. Métodos de análise de microRNA (miRNA) modulação também estão incluídos. Esses métodos fornecem uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes a EndMT e a contribuição dos miRNAs para EndMT.

Introduction

Endotelial-mesenquimais transição (EndMT) é o processo pelo qual uma célula endotelial diferenciada passa por uma variedade de alterações moleculares, resultando em uma célula mesenquimais do fibroblasto como1. EndMT foi inicialmente descrita como uma transformação de células endoteliais durante o desenvolvimento do coração2,3. No desenvolvimento inicial do coração, o tubo de coração consiste em um interior endocárdio e miocárdio um exterior. Estas duas camadas são separadas por uma camada de matriz extracelular, chamada geleia cardíaca. As células embrionárias endocárdico, que adquirem marcadores de células endoteliais, trânsito em células mesenquimais, invadem a geleia cardíaca subjacente e promovem a formação dos coxins cardíacas, fornecendo a base para as válvulas atrioventricular e septo e as válvulas semilunar. Além disso, foi sugerido para ser fontes de pericitos e células de músculo liso vascular em outros sistemas vasculares embrionários, incluindo vasos coronários, aorta abdominal e artéria pulmonar4,5,6EndMT. Além disso, o EndMT está implicada na fisiológico angiogênico brotando7.

Acumular evidência tem sugerido que o EndMT também está envolvida em várias doenças cardiovasculares e outras doenças1,8. EndMT-associado a condições incluem calcificação vascular, aterosclerose, hipertensão arterial pulmonar, malformação cavernosa, fibrose do órgão, remodelação de enxerto de veia, disfunção do enxerto em transplante renal e câncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. um recente relatório descrito que vários marcadores moleculares de EndMT podem ser uma ferramenta para a previsão do diagnóstico e prognóstico da disfunção do enxerto renal em rim transplante17. Modulação de vias de sinalização celulares EndMT-relacionados foram mostrados para melhorar várias condições de doença, incluindo Fibrose cardíaca e enxerto de veia remodelação no animal modelos8,15. Portanto, compreender os mecanismos subjacente EndMT é importante desenvolver estratégias diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT.

EndMT é caracterizada por perda de junções célula-célula, aumento da capacidade migratória, downregulation de genes específicos endoteliais como VE caderina e upregulation de genes mesenquimais incluindo actina de músculo liso-α (α-SMA). Além disso, EndMT e transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo similar que converte células epiteliais de células mesenquimais, estão associados a produção alterada de vários componentes da matriz extracelular, que pode contribuir para o desenvolvimento de tecido fibrose8,19.

Recentemente, vários estudos em vitro de EndMT tem elucidado detalhes dos mecanismos moleculares de EndMT15,20. EndMT é induzido por vários caminhos de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe1. Entre eles, o TGF-β tem um papel crucial na indução de EMT e EndMT. Em EndMT, uma exposição prolongada aos resultados de TGF-β em EndMT em várias células endoteliais, enquanto exposição curta parece ser insuficiente21. Descrevemos aqui um protocolo simples para indução de EndMT, no qual 1 de SVEN milha (MS-1) células endoteliais microvascular do pâncreas de rato sofrem EndMT em vitro após exposição prolongada ao TGF-β20. Neste modelo, várias análises a jusante podem ser realizadas para investigar características de marca do EndMT, incluindo as alterações morfológicas, downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de genes inflamatórios, do citoesqueleto e mesenquimais marcadores rearranjos e contração do gel de colágeno.

MicroRNAs (miRNAs) são 22 ~ nt pequenos RNAs regulamentares que dirigem a repressão posttranscriptional de mRNA vários alvos22,23. Através do reconhecimento de semente mediada por sequência alvo, miRNAs suprimir centenas de genes-alvo e modulam diversas funções celulares, tais como motilidade, proliferação e diferenciação celular. Este também é o caso de regulamento de EMT e EndMT, e vários miRNAs têm sido relatados como reguladores de EMT e EndMT24,25. O modelo de EndMT apresentado nesta revisão pode ser facilmente combinado com procedimentos de modulação de miRNA para testar as funções de miRNAs em EndMT. A presente revisão resume nossos procedimentos experimentais para investigar EndMT TGF-β-induzida em células de MS-1 e inclui também a comparação das condições de indução de EndMT por TGF-β em outras células endoteliais.

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Protocol

1. indução de EndMT

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão e evitar a confluência. Uma fonte de células de MS-1 é descrita na Tabela de materiais. Para células de MS-1, uso médio mínimo essencial-α (α-MEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 de μg/mL.
  2. Células de lavar MS-1 em 10 cm do prato com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e adicionam 1,0 mL de tripsina na placa. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
  3. Separe as células usando 9 mL do meio de cultura. Recolha a suspensão de células em um tubo de 15 mL.
  4. Centrifugar a suspensão celular de 300 – 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Retire o sobrenadante cuidadosamente e suspender o centrifugado em meios de cultura previamente aquecido.
  6. Contagem de células viáveis usando solução de azul de Trypan e um hemocytometer padrão ou um contador automático de células.
  7. Placa MS-1 células em placas de cultura padrão não revestidos em 0,5 x 103 células por cm2 por muito tempo o termo cultura. Por exemplo, células de3 placa de 5,0 x 10 por bem em um 6 cultura bem placa. Use os mesmos meios de cultura, incluindo a mesma concentração de FCS. Nas células do MS-1, TGF-β induz EndMT na cultura de longo prazo (pelo menos 48-72 h), com o uso do FCS.
  8. Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h.
  9. Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Monitorar as células diariamente quando o foco sobre as alterações morfológicas.
  10. Substitua a mídia fresco pré-aquecido meios de cultura contendo TGF-β2 após 48 h de tratamento com TGF-β na cultura de longo prazo.
  11. Proceda as análises a jusante. Normalmente, reorganização de actina é observada após 24 h de tratamento, e downregulation de marcadores endoteliais e upregulation de marcadores mesenquimais são observados após 48-72 h de tratamento com TGF-β.

2. Immunocytochemical análise

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.
  2. Células da placa MS-1 para 4 células bem slides de câmara de cultura em 1,0 x 103 células por poço (1,7 cm2). Slides estão revestidos com gelatina. Uso de 0,5 m a 1,0 mL de meios de cultura por bem.
  3. Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h. Ao analisar o envolvimento de rocha em EndMT, adicione um antes de 1h ROCK inibidor Y-27632 (10 μM) para tratamento de TGF-β. Ao avaliar o efeito da inibição da sinalização do TGF-β, inibidores de cinase do receptor TGF-β podem ser usados.
  4. Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Reorganização de actina é observada nas células de MS-1 após 24 h de tratamento com TGF-β. Outras alterações tornar-se evidente após 48-72 h de tratamento. Para a cultura de 72 h, substitua a mídia mídia fresca contendo TGF-β após 48 h de tratamento com TGF-β.
  5. F-Actina de coloração
    1. Após 24 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, corrigir células com paraformaldeído 4% em PBS 1x por 20 min em temperatura ambiente e enxágue células com PBS 1x.
    2. Incube com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente.
    3. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    4. Incube com isotiocianato de B faloidina-diversos de Amanita phalloides diluído 150-fold com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
    5. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    6. Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.
    7. Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.
    8. Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção da fluorescência de faloidina. Usar um laser de 633 nm e um filtro de emissão mais de 650 nm para coloração nuclear. Tratamento com TGF-β, formação de fibras grossas estresse seria observada.
  6. VE-caderina e α-SMA coloração
    1. Após 72 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, fixar as células com frio 50% de metanol e acetona 50% (0,5-1,0 mL por bem) por 5 min.
    2. Enxagúe as células três vezes com PBS 1x (0,5-1,0 mL por bem).
    3. Incube com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C, no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante. Use o anticorpo monoclonal de VE-caderina (BV13, diluição de 1: 100) e α-SMA Cy3-conjugado anticorpo monoclonal (1A4, diluição de 1: 200)20.
    4. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    5. Incube as células com um anticorpo secundário conjugada com corante verde para VE-caderina anticorpo em tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante.
    6. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    7. Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.
    9. Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção de α-SMA (Cy3). Use um laser de 488 nm e um filtro de emissão de 505 – 550 nm para a deteção de VE-caderina. Normalmente, após tratamento com tratamento de TGF-β, diminuição de sinais VE caderina e aumento do α-SMA sinais seria observado.

3. ensaio de contração de Gel de colágeno tridimensional

  1. Realize cultura de células de MS-1, com ou sem o TGF-β para 72 h antes do ensaio de contração de gel de colágeno.
  2. Preparar o tipo eu gel de colágeno no gelo. Misturar a solução de colágeno frio, 10x concentrado MEM médio e tampão de diluição de colágeno contendo 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3e 200 mM HEPES pH 7,4 em um 8:1:1 relação.
  3. Misture 200 mL de controle ou suspensões de células endoteliais TGF-β-tratada (1.0 x 106 células/200 μL) e 800 μl da solução de gel de colágeno. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a suspensão de eritrócitos.
  4. Adicionar 1,0 mL da mistura a cada poço das placas de cultura 12-poços e deixar para solidificar na incubadora a 37 ° C por 30 a 60 min.
  5. Após a gelatinização, sobreposição de 1,0 mL de MEM-α contendo 10% FCS, 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 μg/mL para flutuar o gel. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a mídia.
    Nota: Para amostras tratada de TGF-β, adicione TGF-β para o gel e a meios de cultura.
  6. Incube os géis flutuantes a 37 ° C por 48 h.
  7. Digitalizar as imagens de géis de fundo das placas usando um scanner. Alternativamente, grave as imagens de géis usando uma câmera digital em uma distância fixa acima os géis.
  8. Quantificar a área de superfície de gel com base no número de pixel usando o ImageJ. Seleccione o gel usando uma seleção à mão livre ou ferramentas de seleção relacionados ou usando o gel "imagem | Ajustar | Limiar de cor"da ferramenta e em seguida, determinar a área do uso de gel" Analyze | Comando de medida".

4. inibição de miRNA atividades por miRNA trancada do ácido nucleico-baseado inibidores

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.
  2. Transfect miRNA inibidores trancado ácido nucleico (LNA), miRNA sintético duplex ou siRNAs (20 ou 50 nM) usando reagentes lipofection de acordo com as instruções do fabricante. Detalhes e fontes de LNA miRNA inibidores sintéticos miRNA duplex e siRNAs foram descritas em nossos anteriores relatórios26,27. Nas células do MS-1, procedimentos padrão de transfeccao baseados as instruções do fabricante funcionam bem para a introdução dos inibidores de miRNA LNA, miRNA sintético duplex ou siRNAs.
  3. Após 16 – 48 h, estimulam as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL).
  4. Prossiga para várias análises a jusante, incluindo análise da expressão (RT-PCR quantitativo e análises sequenciação do ARN (RNA-seq)) RNA, immunocytochemical análise e ensaio de repórter. Análises a jusante têm sido descritas em nossos anteriores relatórios20,26,27.

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Representative Results

TGF-β é um potente indutor de EndMT em várias células endoteliais. Após o tratamento de 24 h com TGF-β nas células do MS-1, coloração para F-Actina mostra reorganização de actina stress fibras (figura 1A)20. Pré-tratamento com um inibidor ROCK Y-27632 inibe a indução de actina reorganização20. MS-1 células endoteliais alterar de uma morfologia de paralelepípedos, como a clássica para uma morfologia fusiforme mesenquimal tratamento de TGF-β (figura 1B). TGF-β-tratados células perdem contato célula-célula. Após o tratamento com TGF-β para 48-72 h, immunocytochemical análises demonstram diminuição da expressão de VE caderina e expressão aumentada de α-SMA (Figura 1). TGF-β drasticamente induz a expressão de α-SMA nível mRNA e proteína em células de MS-1 após 48-72 h de tratamento (figuras 1 e 1E). TGF-β mamíferos inclui TGF-β1, 2 e 3 isoformas. Um estudo anterior usando explantes de coxim endocárdico rato cultivado tem mostrado que TGF-β2, mas não de TGF-β3 é obrigatória para a transformação de células de coxim endocárdico28. Por outro lado, nós anteriormente comparou os efeitos de três isoformas na expressão de α-SMA e confirmou que todas as isoformas da mesma forma induziram α-SMA expressão em células de MS-120. Ensaio de contração de gel de colágeno mostra contração reforçada do tipo colágeno que eu do gel por células de MS-1 após o tratamento de TGF-β (Figura 1F). Este efeito sugere a aquisição da capacidade de células mesenquimais de remodelar a matriz extracelular. Esses recursos são traços de marca registrada de EndMT20. Em nosso relatório anterior20, tratamento com um inibidor ROCK Y-27632 fortemente suprimida indução de marcadores mesenquimais α-SMA e SM22α sem concomitante supressão da indução de outros genes alvo de TGF-β como fibronectina 1 e MMP-2.

EndMT é um processo altamente dinâmico. Nas células do MS-1, os efeitos da TGF-β na expressão de α-SMA e morfologia são reversíveis; após a privação de TGF-β, α-SMA expressão diminui a níveis basais (Figura 2A) e células recupera uma paralelepípedo, como morfologia (Figura 2B). Além disso, a indução de EndMT e EMT está associada com mudanças dinâmicas na capacidade secretora de várias quimiocinas e citocinas. Múltiplas inflamatórias quimiocinas e citocinas, incluindo CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 e Angptl2 são induzidas por TGF-β nas células do MS-1, que nós anteriormente designado EndMT-associado fenótipo secretor (EndMT-SP)26. Este modelo experimental é útil para investigar os reguladores putativos de EndMT e EndMT-SP. Anteriormente, que estudamos os papéis dos vários miRNAs em EndMT por aumentando ou inibindo a miRNA atividades26,27. Nas células do MS-1, miRNA actividades podem ser robustamente moduladas por miRNA oligonucleotides imitar ou inibidores de miRNA LNA-baseado, e vários ensaios a jusante, incluindo análise de RNA-seq pode ser facilmente executada (Figura 3). Com base na análise do transcriptoma Integrativa, nós têm anteriormente associados constitutivamente ativo miR-31 EndMT regulamento em MS-1 células26. Análise de RNA-seq mostrou que a inibição da miR-31 pelo LNA miRNA inibidor resultados na atenuação da indução de marcadores mesenquimais (Figura 3A) e genes EndMT-SP (Figura 3), enquanto ela não afeta a indução de alvo convencional de TGF-β genes como fibronectina 1, PAI-1 e Smad7 (Figura 3B) e downregulation de marcadores endoteliais (Figura 3D)26. Tanto o TGF-β e miR-31 downregulate Stk40, um regulador negativo da via do NF-κB, que age como um regulador de potencial de EndMT-SP. Apesar de TGF-β não aumenta a expressão de miR-31, TGF-β induz alternativa mediada por poliadenilação exclusão de sequência de poli interno em Stk40 3' UTR, reforçando assim a definião de Stk40 ativo constitutivo do miR-31 e finalmente suprimindo Stk4026. Além disso, examinamos anteriormente os papéis de TGF-β-inducible miR-27b em EndMT27. Inibição da miR-27 suprimida upregulation de marcadores mesenquimais (Figura 3A), enquanto os efeitos de genes-alvo convencionais TGF-β, genes de EndMT-SP, e marcadores endoteliais foram marginais (figuras 3B, 3C e 3D)27 .

Figure 1
Figura 1 : Indução de EndMT em MS-1 células por TGF-β. (A) reorganização de actina em MS-1 células após 24 h de tratamento TGF-β2 (1 ng/mL). Morfológicos (B) alterações nas células do MS-1 após 72 h de tratamento TGF-β2 (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analisa para VE caderina e α-SMA em MS-1 células após 72 h de tratamento TGF-β2 (1 ng/mL). (D, E) Alterações de expressão em α-SMA, determinado pela análise de RT-PCR quantitativo padrão (D) e Western blot análise (E). Ensaio de contração do gel de colágeno (F). A relação entre a área de superfície após cultura de 72 h, com ou sem tratamento de TGF-β2 (1 ng/mL) à superfície original são exibidos. Escala de barras = 20 μm (A e C) e (B) de 200 μm. Figuras são modificadas de Mihira et al 20. barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Efeitos reversíveis de TGF-β nas células do MS-1. Expressão de RNAm de α-SMA (A) e (B) morfologia de células após retirada de TGF-β2 nas células do MS-1. Escala de barras = 200 μm. Barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análise de RNA-seq nas células do MS-1. Após a introdução dos inibidores de miRNA LNA e tratamento com TGF-β2 (72 h), análise de RNA-seq foi realizada26,,27. NC: controle negativo. Alterações de expressão de genes representativas são mostradas (A, marcadores mesenquimais; B, genes-alvo TGF-β convencionais; C, os genes EndMT-SP; e D, marcadores endoteliais). Valores da FPKM (fragmentos por quilobase de transcrição por leituras mapeadas milhões) foram normalizados com os valores de uma amostra de controle (LNA-NC sem tratamento de TGF-β2). Barras de erro representam desvios-padrão.

Tipo de célula Condição de indução de marcador mesenquimal Referência
células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) Indução por meio de diferenciação mesenquimais (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5 – 21 dias. Krenning et al .
humanas células endoteliais microvasculares cutâneas (HCMEC) Indução por TGF-β2 (10 ng/mL), sem FBS, 2 dias. Medici et al .
células endoteliais coronárias humanas (HCEC) Indução por TGF-β1 (10 ng/mL), 6 dias. Inibição por BMP-7. Zeisberg et al .
pilhas endothelial do pulmão do rato (MLEC) Indução por TGF-β1 (10 ng/mL), reduzir a 2% FBS, sem mitógeno endotelial, 2 dias. Zeisberg et al.
células endoteliais do cérebro rato (BEC) Indução por TGF-β1 (10 ng/mL), 2 dias. Et al . Krizbai
células endoteliais aórtica bovina (BAEC) Indução por TGF-β1 (1 ng/mL), 5 dias. Arciniegas et al
imortalizado bovina da retina microvasculares células endoteliais (iBREC) Indução por TGF-β2 (10 ng/mL), 3-6 dias. Deissler et al .
células endoteliais de ovinos da valva aórtica Indução por TGF-β1 ou 3 (1 ng/mL), 6 dias. Paranya et al .
Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 Indução por TGF-β (10 ng/mL), ativou a expressão de Ras, 1 dia. Hashimoto et al
Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 Indução por TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 dias. Mihira et al

Tabela 1: indução de EndMT por TGF -β em várias células endoteliais. Condições de cultura de indução de EndMT por TGF-β são resumidas. Mudanças nas condições de cultura, incluindo a concentração sérica e adição ou remoção de outros fatores de crescimento também são notadas.

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Discussion

Tem sido relatado que ativado tratamento Ras e TGF-β para 24h induzida EndMT nas células do MS-1, enquanto o TGF-β sozinho falhou induzir a EndMT deste curto período,21. Consistentemente, observamos que TGF-β substancialmente induzida EndMT após o tratamento mais tempo (48-72 h) em MS-1 células20. EndMT tem sido repetidamente observado após tratamento prolongado com TGF-β (2-6 dias) em várias células endoteliais como umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC), humanas cutâneas microvasculares células endoteliais (HCMEC), células endoteliais coronária humana ( HCEC), células endoteliais do pulmão do rato (MLEC), células endoteliais do cérebro rato (BEC), células endoteliais aórtica bovina (BAEC), imortalizadas bovina da retina microvasculares células endoteliais (iBREC) e ovinos aórtico válvula células endoteliais8, 18,29,30,31,32,33,34. Na tabela 1, podemos resumiu as condições de indução de marcador mesenquimal por TGF-β em várias células endoteliais8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Comparação destes relatórios sugere que cada linhagem de células endoteliais tem diferentes limites para EndMT. Sensibilidade diferencial para TGF-β ou outros mecanismos pode subjacentes a diversas condições patológicas relacionadas com EndMT em diferentes órgãos. Isto deve ser considerado em conjunto com os resultados dos estudos em vivo .

Os detalhes em vitro protocolo de indução de EndMT precisam ser costurado em linhagens celulares diferentes: por exemplo., concentração, concentração de soro, adição ou remoção de outros fatores de crescimento e período da cultura de TGF-β. Por exemplo, HX frequentemente mal responde a TGF-β e EndMT poderia ser induzida por combinação com outros factores, como PDGF-BB e estímulos inflamatórios e/ou modulação de concentração sérica e outros componentes médios em uma cultura mais configuração29 , 35. Além disso, overconfluency iria atenuar as respostas para TGF-β.

EndMT é um processo dinâmico e um processo oposto chamado transição mesenquimais-endotelial (MEndoT) tem sido recentemente relatado36. Enquanto a indução de marcadores mesenquimais por TGF-β sozinho é reversível nas células do MS-1 (Figura 2), tem sido relatado que downregulation de marcadores endoteliais em MS-1 células com Ras ativado persistiu após retirada de TGF-β21. EndMT irreversível também relatou em iBREC e válvula aórtica de ovinos células endoteliais33,34. Além disso, um relatório anterior mostrou que o processo de EndMT persistente após retirada de TGF-β, devido a uma ativação sustentada de Ras-GTP e metilação do promotor RASAL1 em células endoteliais coronárias humanas37. Assim, a comparação destes modelos pode ser também útil para entender os mecanismos de regulação da plasticidade da célula endotelial.

Capacidade de resposta das células endoteliais para indução de EndMT parece ser substancialmente heterogêneos38. Xiao et al relataram que as células endoteliais específicas do tumor, de um modelo de tumor mamário mostram formas distintas de EndMT em resposta à estimulação de TGF-β38. TGF-β-driven EndMT também é modulada por outras vias de sinalização incluindo FGF-2, IL-1 β e BMP-735,37,38. Também descobrimos que aumenta de TNF-α TGF-β-induzida EndMT e EndMT-SP em MS-1 células26. Além disso, é sabido que EndMT é induzida por outras vias de sinalização incluindo Wnt, entalhe e hipoxia1. Assim, a combinação com outros estímulos em várias células endoteliais pode ser importante compreender a heterogeneidade da capacidade de resposta EndMT.

O protocolo de EndMT apresentado aqui pode ser facilmente modificado para investigar os reguladores de EndMT. Na verdade, nós têm caracterizado vários reguladores de EndMT em células de MS-1 a20,26,27. Um fator de troca do nucleotídeo guanina Arhgef5 e fator de transcrição myocardin-relacionados-(MRTF-A) é induzida por sinais Smad, e ambos contribuem para α-SMA upregulation em MS-1 células20. Assim, a sinalização do TGF-β ativa ambos os sinais de Rho e MRTF-A para induzir EndMT. Além disso, nós também achamos que miR-31 constitutivamente ativo e TGF-β-inducible miR-27b positivamente regulam de26,de indução de EndMT27. Nas células do MS-1, miR-31 constitutivamente ativo também é necessário para TGF-β-induzida EndMT-SP26. Em geral, esses procedimentos de indução de EndMT em vitro seria útil para compreender a biologia do EndMT, identificando assinaturas de gene associada a EndMT e desenvolvendo estratégias para modular a este processo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Zea Borok e Kohei Miyazono sugestões na preparação do manuscrito. H.I.S. e M.H. são compatíveis com o Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, e H.I.S. é suportado pelo Osamu Hayaishi Memorial bolsa de estudo no exterior. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de ciência Takeda (A.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

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References

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Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização
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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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