Summary
在这里, 我们提出了一个全细胞电化学实验的协议, 以研究质子传输的贡献, 通过外膜细胞色素复合体在希瓦氏菌 oneidensis MR-1 的细胞外电子转运率。
Abstract
在细菌外膜中嵌入的c型细胞色素复合物的直接电化学检测 (外膜c型细胞色素复合物;OM c-青旅) 最近出现作为一种新的全细胞分析方法来表征细菌电子运输从呼吸道链到细胞外部, 称为细胞外电子转运 (EET)。研究了 EET 反应过程中电子流的途径和动力学, 研究了与 EET 相关的阳离子输送的影响的全细胞电化学方法尚未建立。在本研究中, 本文介绍了通过 OM c-中青旅使用模型微生物 (希瓦氏菌 oneidensis MR-1) 检测 EET 上氘动力学同位素效应 (绢) 的生物化学技术的例子。如果 EET 通过 OM c-青旅作为微生物电流生产中的速率限制步骤, 则可以获得 EET 过程的绢。为此, 在添加 D2O 之前, 将上清液替换为含有足够数量的电子捐献者的新鲜介质, 以支持上游代谢反应的速率, 并从统一的浮游细胞中移除工作电极上的单层生物膜。此外, 还介绍了通过 OM c-青旅法确定微生物电流生产中 EET 速率限制步骤的替代方法。研究质子转运动力学的全细胞电化学检测技术可应用于其它活性微生物菌株。
Introduction
在一个完整的细菌细胞中, 直接表征氧化还原蛋白的电化学技术最近出现, 自从发现了金属还原微生物菌株, 如S. oneidensis MR-1 或地杆菌能 sulfurreducens PCA,其中有外膜 c 型细胞色素复合体 (OM c-青旅) 暴露于细胞外部1,2,3,4,5。OM c-青旅介导从呼吸道链到位于 extracellularly 的固体基底的电子传输。此传输称为胞外电子传输 (EET)1,6 , 是新兴生物技术 (如微生物燃料电池6) 的关键过程。因此, 为了了解潜在的 EET 动力学和机制, 以及它与微生物生理学的联系, OM c-中青旅已使用全细胞电化学47, 结合显微术进行了研究。8,9, 光谱学10,11, 分子生物学2,4。相比之下, 研究 EET 相关的阳离子传输 (例如,质子) 对活细胞中 EET 动力学的影响的方法几乎没有建立, 尽管质子在细菌膜中的转运具有关键作用, 在信号、稳态和能源生产12,13,14。在本研究中, 我们描述了一个技术, 以检查质子传输对 EET 动力学的影响, 在S. oneidensis MR-1 细胞使用全细胞电化学测量, 这需要确定的速率限制步骤在微生物电流生产15。
一个直接的方法来评估质子传输对相关 EET 的贡献是氘动能同位素效应 (绢)。绢是可观察的作为电子转移动力学的变化在替换质子与氘离子, 代表质子传输对电子转移动力学的影响16。绢本身的理论已得到很好的建立使用电化学测量与纯化酶17。但是, 由于oneidensis中的当前生产 MR-1 来自多个、不同和波动的进程18, 因此不能简单地将 EET 标识为速率限制过程。为了观察质子传输过程与 EET 耦合的绢, 我们需要确认微生物电流的产生是通过 OM c-中青旅对电极的电子传输来限制的。为此, 在绢测量前, 我们在最佳 pH 值和温度条件下, 用含有高浓度乳酸的新鲜培养基取代上清液;这个替换服务两个角色: (1) 它提高了上游代谢过程的速率与 EET 相比, (2) 省略了在工作电极上从S. oneidensis MR-1 的单层生物膜上释放的上清液中的游泳细胞 (铟锡掺杂氧化物 (ITO) 电极)。所提供的详细协议旨在帮助新的从业者保持并确认 EET 过程是速率确定步骤。
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Protocol
1. 在 ITO 电极上形成oneidensis MR-1 的单层生物膜 (图 1)
注: 为了防止电化学反应器与其他微生物的污染, 电化学反应器的所有介质、装置和元件应预先消毒。当使用oneidensis MR-1 单元格并构造电化学反应器时, 所有程序都应在干净的工作台上进行。
- oneidensis MR-1 细胞的培养
注: 在以前报告的4的条件下, 在 ITO 电极上形成了一个oneidensis MR-1 的单层生物膜。- 要增长oneidensis MR-1 单元格, 请添加一个 s 的殖民地. oneidensis MR-1 在含有 Luria Bertani (磅) (20 克/升) 和 bacto 琼脂 (15 克/升) 的琼脂盘上生长, 在有氧条件下为30摄氏度的15毫升的 LB 培养基 (20 克/升), 在小时内以 24 rpm 摇晃。
- 离心细胞悬浮在 6000 x g为10分钟, 并并用重悬在15毫升的被定义的培养基 (pH 7.8) 的结果细胞颗粒 (DM: NaHCO3 [2.5 克/升], CaCl2· 2H2O [0.08 克/升], NH4Cl [1.0 克/升], 氯化镁2·6H2O [0.2 克/升], 氯化钠 [10 克/升], 和 2-[4-(2-羟乙基) 1-哌嗪基] 磺酸 [HEPES; 7.2 克/升]), 辅以10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物作为碳源,以及 S . oneidensis 的跟踪元素 MR-1分别。
- 进一步培养细胞悬浮有氧在30°c 为 12 h 与震动在 160 rpm 和离心机再在 6000 x g 为10分钟. 用 DM 介质将所合成的细胞颗粒洗净两次, 然后在 10 x g 的电化学前进行离心处理. 实验。
- 三电极电化学反应器的构造 (图 1)
- 在反应器底部放置一个 ITO 基体作为工作电极。
- 随后, 插入一个玻璃圆筒 (直径2厘米) 和聚四氟乙烯 (PTFE) 盖子。然后将银/AgCl (氯化钾饱和) 和铂丝插入反应器中, 分别作为参考和反电极。
注: 为防止空气和溶液泄漏, 请在各组件之间插入丁基橡胶板。 - 添加4.0 毫升 DM 补充10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物进入电化学反应器。
- 在确认电化学反应器没有泄漏的情况下, 将氮气流入电化学反应器中20分钟, 以维持电化学反应器内的厌氧条件。
注: 为防止其他微生物污染, 应在气体流入电化学反应器之前对其进行过滤。 - 将电化学反应器连接到恒电位仪, 并将 +0.4 V (与标准氢电极, 她) 应用于 ITO 电极, 使用外部水循环系统将电化学反应器的温度保持在30摄氏度。
注: 为了防止外部电场的影响, 电化学反应器应放置在法拉第笼中。
- oneidensis MR-1 单元格的电化学培养 (图 1和图 2)
- 将步骤1.1 中获得的悬浮液的细胞密度调整为1.43 在 600 nm (OD600) 的光密度, 用 DM 补充10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物。
注意: 要获得正确的 od600, 请在调整 od600至1.43 之前, 将 od600 ≤0.8 的单元格悬浮应用于紫外-可见光光谱仪。 - 使用注射器将0.3 毫升的电池悬浮液注入电化学反应器中: 反应器中的外径600变为0.1。
注意: 增加0.3 毫升细胞悬浮与 od600 = 1.43 入电化学反应器包含 4.0 mL 媒介结果4.3 毫升解答与 od600 = 0.1。当使用不同体积的其他反应器时, 需要计算细胞密度。 - 继续潜在的应用在 +0.4 V (与她) 到 ITO 电极25小时。
注: 为在 ITO 电极上形成单层生物膜, 请确保所产生的电流与图 2中的偏差小于50%。
- 将步骤1.1 中获得的悬浮液的细胞密度调整为1.43 在 600 nm (OD600) 的光密度, 用 DM 补充10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物。
2. 用新鲜 DM 培养基替换上清液, 10 毫米乳酸 (图 3)
- 停止潜在的应用, 并断开电化学反应器从恒电位仪和水循环系统。
- 新鲜 DM 培养基替换上清液10毫米乳酸
- 将氮气放入含有10毫米乳酸的 DM 的瓶子中, 从培养基中除去氧气。
- 用注射器缓慢地将电化学反应器内的所有上清液取出, 在流动的氮气下 (图 3a, b)。
注: 为了避免氮气对 ITO 电极上的生物膜进行破坏, 气体应在液体表面上方流动。 - 使用注射器添加4.0 毫升含有10毫米乳酸的新鲜 DM (图 3c)。
注意: 为了避免破坏 ITO 电极上的生物膜, 慢慢地将介质沿电化学反应器的壁上注入。为了保持生物膜湿润, 应在清除清液后立即添加培养基。在清除清液后1分钟内注射, 不会影响来自oneidensis MR-1 生物膜的当前生产。 - 倾斜电化学反应器, 以除去附着在电化学反应器壁上的所有上清液。
- 重复步骤 2.2. 2-2. 2.4 三次共计。
- 停止气体流动, 再将电化学反应器连接到恒电位仪, 在 303 K 上应用 +0.4 V (vs 她) 到 ITO 电极上。
3. 增加氘水来测量 EET 过程中的绢 (图 4)
- 确认来自oneidensis MR-1 的单层生物膜的当前生产是稳定的, 不会迅速增加。如果电流急剧增加, 请等到电流稳定在5% 以内, 增加10分钟。
注: 在 ito 电极上形成单层生物膜, 不受其他微生物菌株的污染, 经 rDNA 序列和 ITO 电极上生物膜的扫描电子显微图像证实, 如前所述4。为确定 EET 过程的速率限制, 监测添加穿梭电子介质的效果, 如100µM anthraquinone-1-sulfonate (α AQS)。有关详细信息, 请参阅代表结果和参考15一节。 - 使用注射器将40µL 缺氧 50% (v/v) d2o 添加到电化学反应器中, 这样在反应器中浓度为 0.5% (v/v) d2o。
注: 为了防止 d2o 添加对生物膜的损坏, 请插入 d2o。 - 等待当前稳定, 然后将 D2O 增加到 4.0% (v/v)。
注意: 要获取绢值 (在 D2o 和 H2o 的存在下当前生产的比率), 请检查同一容量的 H2O 加法对当前生产的影响。
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Representative Results
25 h 的潜在应用在 +0.4 V (对她), 在 ITO 玻璃的工作电极上形成单层生物膜, 以前是通过扫描电子显微镜或共聚焦显微镜4确认的。在单层生物膜形成过程中, 从oneidensis MR-1 的当前生产的代表性时间过程显示在图 2中。尽管电流在每次测量中都有改变, 但如果单层生物膜均匀形成, 则产生的电流不会从图 2中的值中显示出偏差超过50%。
在替换上清与10毫米乳酸的新鲜 DM, 以最大化新陈代谢过程的速度和洗涤单层生物膜 (图 3), 一个稳定的阳极电流 (大约5% 增加10分钟) 可以观察在 +0.4 V 之下 (与她) 应用程序 (图 4a)。如果阳极电流急剧增加, 请等到电流稳定。很有可能2节所述的清液置换程序可能会破坏生物膜, 并且可能发生重建。
图 4a中的实线是 D2O 加法引起的微生物电流变化的代表结果。添加 1.0% (v/v) D2O 显著降低了十年代内的微生物电流, 而在增加 H2O (图 4a)15中的点线时, 观察到几乎没有电流下降。同样的趋势在至少四个单独的实验中重现。在最终浓度范围从0.5% 到 2.0% (v/v) 的连续添加 D2O 在当前生产 (图 4a)15中清楚地显示了强烈的抑制。由于微生物的电流生产逐渐恢复可能由于生理效应19,20, 绢应分配到当前下降后不久, 增加了 D2O。在上一个报告中, 在添加 D2O 之后, 我们收集了当前生产的大约10分钟, 以计算绢15的值。
通过使用两种方法, 我们确认由 D2O 加法所观察到的电流减少是由于 EET 上的绢, 通过 OM c-青旅综合体。首先, 我们增加了1µM 核黄素 (RF) 或黄素单核苷酸 (FMN) 到电化学反应器在 D 2 O 加法之前和之后, 可用于研究 EET 在 S. oneidensis MR-1。对于 oneidensis MR-1, flavins 特别加快 EET 进程, 方法是在几秒钟内与 OM c(青旅) 绑定, 因为 flavins 函数为非共价键绑定辅助因子 21, 22,23. 因此, 黄素添加的瞬时阳极电流增加表示通过 OM c-中青旅 (图 5) EET 过程的速率限制。进一步证实了穿梭电子介质对绢的影响。小氧化还原分子,例如, anthraquinone-1-sulfonate (α AQS), 通过从微生物电子传输链扩散到电极而终止 EET 过程, 而不是通过 OM c-青旅15直接电子传输,24. 在这里, 添加100µM α AQS 增强了目前的产量超过5倍 (图 4b), 这表明代谢反应的动力学是足够快, 使 EET 进程的速率限制步骤。一贯地, 由α AQS 介导的当前生产仍然不受 d2O 加法 (图 4b) 的影响, 表明 d2O 的新陈代谢反应的潜在延迟不会导致图4a 中观察到的大绢。.
这两种观察绢的方法结合 OM c-青旅是该报告的关键点, 特别是, 穿梭电子调解人可以适用于其他活性生物膜。此外, 一旦我们确认当前的变化被分配给 EET 进程, 我们可以评估一个部分删除突变的 om c-中青旅或与 OM c相关的黄素的影响, 通过比较绢在质子转移动力学两种情况下都为15。当在 FMN 绑定与 OM c-青旅中添加了 D2O 时, 当前的减少减少了, 使其小于没有 FMN 的值, 表明 FMN 的绑定改变了质子传输通路及其动力学 (图4c)15。
图 1: 本研究中使用的电化学反应器.构造前 (a) 和构造后的电化学电池的照片 (b)。(c) 电化学反应器在 +0.4 V 与她的电化学接种25小时后的示意图说明。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 代表性的当前生产从oneidensis MR-1 在 ITO 电极上的单层生物膜形成期间.箭头指示将电池悬浮添加到电化学反应器中的时间。同样的倾向在至少五个单独实验被复制了。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用10毫米乳酸替换上清到新鲜定义培养基 (DM).(a) 氮气在液体表面上方流动。(b) 从电化学反应器中清除上清液。(c) 增加4.0 毫升含10毫米乳酸的新鲜 DM。在介质添加后, 反应器应倾斜以去除附着在反应器壁上的上清液。执行这些过程 (ac) 总计三次。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 从S. oneidensis MR-1 的单层生物膜中添加的 D2O 对当前生产的影响.在含有10毫米乳酸 (a)、另外100µM anthraquinone-1-sulfonate (αAQS) (b) 或另外2µM 的电化学系统中, 对oneidensis MR-1 的单层生物膜进行时间与电流的生产。黄素单核苷酸 (FMN) (c).同样的倾向在至少四个单独实验被复制了。箭头指示添加 D2o (实线) 或 H2o (虚线) 的时间。在实体行数据中添加 D2O 之前, 与虚线对应的数据被规范化为数据点。指出了电化学反应器中 D2O 的浓度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: oneidensis MR-1 的单层生物膜对当前生产中的速率确定步骤的评估 flavins.时间与当前生产从一个单层生物膜的S. oneidensis MR-1 在存在10毫米乳酸 (固体线), 1.0 毫米乳酸 (虚线) 和0.1 毫米乳酸 (虚线)。箭头指示将1µM 黄素单核苷酸 (FMN) 添加到电化学反应器中的时间点。在10毫米乳酸的存在下, FMN 的加入大大增加了目前的产量, 表明细胞外电子传输 (EET) 通过c型细胞色素复合物嵌入细菌外膜 (OM c-中青旅) 是率决定。电化学反应器中乳酸浓度的降低导致了 FMN 增加的电流增强, 表明从上游代谢反应到 OM c的电子供应量逐渐比 EET 率慢。同样的趋势在至少两个个体实验中重现。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
与蛋白质电化学相比, 我们的全细胞电化学检测具有多种技术优势。蛋白质纯化需要多步骤的耗时程序, 但我们的全细胞方法在细胞培养后需要一天的自组织生物膜形成。为了实现 OM c-青旅和电极之间的稳定交互, 我们只需要对电极表面进行杀菌和清洗;它不需要电极修改来组织蛋白质的方向4,例如, S. oneidensis MR-1 本质上附着在电极上, 同时将 OM c-青旅定向到同一方向25,26,27. 相反, 蛋白质的电化学反应受到蛋白质和电极中氧化还原部位之间的距离的敏感影响;因此, 纯化的蛋白质必须小心地面向28,29。更重要的是, 全细胞电化学检测直接表征 om c-中青旅复合物嵌入脂膜与其他膜蛋白可能的相互作用, 因此反映了本机质子管理在 OM c-青旅 (这通常很难模仿使用纯化的蛋白质)。
然而, 我们的技术对 d2o 的高度浓度 d2ø的浓度有限制, 可能减慢新陈代谢过程和生长19;因此, 我们使用在本协议中小于 4% (v/v) 的 D2O 浓度进行了实验。此外, 由于微生物中基因表达的调控是复杂的, 小条件差异可能会强烈影响微生物表型, 甚至电子输运动力学。特别是, 在当前生产过程中, 乳酸浓度从oneidensis MR-1 生物膜中减少;因此, 在限速过程转移到上游代谢反应之前进行绢实验是很重要的。
成功获得绢的最关键的一点是澄清并确认通过 OM c-青旅电子传输的条件限制了全细胞电化学检测监测的当前生产速率。在本议定书中, 我们解释了如何确认 EET 的速率, 并反映了微生物的电流生产。我们介绍了两种方法的结合;观察当前变化由黄素加法23和 D2O 加法在扩散电子调解人的存在,例如, α-AQS15 (图 4和图 5)。如果不能使 EET 过程限速, 最可能的原因是单层生物膜的不完全形成或物理剥离, 或其他微生物的污染。我们强烈建议通过扫描电子显微镜或共聚焦显微镜确认单层生物膜的形成。介质置换过程很可能损害生物膜;因此, 介质的去除和注入应缓慢进行, 氮气应在液面上方流动 (图 3)。如果一个统一的单层生物膜不使 EET 过程速率限制, 最好重新检查介质成分和测量条件,例如, 补充乳酸在较高浓度超过10毫米, 进一步加速上游代谢过程。这些因素在其他类型的 EET 微生物中也很重要。电子调解人可以明确地用来确认 EET 过程是在其他类型的 EET 微生物中的速率限制, 包括细菌菌株的混合物;因此, 我们认为这个协议是一个一般的方法来研究质子对直接电子传输的细菌/电极界面的动力学影响。考虑到 EET 在其他微生物菌株和联营集团中的观察, 就 EET 过程的速率限制而言, 本协议适用于研究厌氧铁腐蚀和甲烷氧化过程中的微生物呼吸, 以及微生物燃料电池30,31。
我们的oneidensis MR-1 单层生物膜系统的速率限制过程 EET 通过 OM c-中青旅不仅可以用于绢实验, 也可用于 OM c-青旅的生化特性。例如, 将不同浓度的 flavins 作为辅助因子绑定到 OM c-青旅, 将允许对离解常数 (K d ~ 10 µM) 的电化学量化, 以形成黄素约束 OM c- 青旅复合体32,33,34。此外, 我们最近的工作表明, 通过 OM c-青旅的逆向电子回流过程可以通过阴极电流生产33,34来表征。已经提出, 电子回流与质子导入在 OM 上作为 chemiosmotic ATP 合成的来源35;因此, 研究质子对 OM c-青旅中电子回流动力学的影响是很有兴趣的。
最后, 我们开发了通过 OM c-中青旅使用活的oneidensis MR-1 检查 EET 上的氘绢的技术。该技术可用于 OM c-中青旅及绢观察, 并有可能适用于其他 electrogenic 微生物。我们认为, 这种方法可以是一种一般的技术, 直接通过 OM c-中青旅体内来调查 EET。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作在财政上得到了资助, 为特别促进研究从日本促进科学学会 (jsp) KAKENHI 授予数字 24000010, 17H04969 和 JP17J02602, 美国海军研究全球办公室 (N62909-17-1-2038)。Y.T. 是一个 jsp 研究研究员, 并通过该项目的领导研究生学校 (功绩) 支持的 jsp。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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