Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتجارب كامل الخلية الكهروكيميائية لدراسة مساهمة النقل بروتون لمعدل النقل الإلكترون خارج الخلية عن طريق cytochromes الغشاء الخارجي المعقدة في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1.

Abstract

المباشر الكهروكيميائية كشف ج-اكتب مجمعات الفسفرة جزءا لا يتجزأ من الغشاء الخارجي البكتيرية (الغشاء الخارجي ج-اكتب مجمعات الفسفرة؛ أوم ج-سيتس) مؤخرا ظهرت كأسلوب تحليلي كامل الخلية رواية لتوصيف نقل الإلكترون البكتيرية من سلسلة التنفس للخارج الخلية، ويشار إليه بنقل الإلكترون خارج الخلية (EET). في حين تم التحقيق بالمسار وحركية من تدفق الإلكترونات أثناء التفاعل EET، أسلوب كامل الخلية الكهروكيميائية لدراسة تأثير الأيونات الموجبة النقل المقترنة EET لم تنشأ بعد. في هذه الدراسة، مثال على تقنية البيوكيميائية لدراسة تأثير النظائر الحركية الديوتريوم (كيي) على EET خلال أوم ج-سيتس استخدام ميكروب نموذج، السيد أونيدينسيس شيوانيلا -1، وصف. يمكن الحصول على كيي في عملية EET إذا EET خلال أوم ج-سيتس بمثابة خطوة الحد من معدل الإنتاج الحالي الميكروبية. تحقيقا لهذه الغاية، قبل إضافة د2س، استعيض عن الحل طافية مع وسائط جديدة تحتوي على كمية كافية من الجهة المانحة الإلكترون لدعم معدل التفاعلات الأيضية المنبع، وإزالة الخلايا العوالق من زي موحد بيوفيلم أحادي الطبقة على مسرى العامل. الأساليب البديلة للتأكد من الحد من المعدل خطوة في الإنتاج الحالي الميكروبية ك EET خلال أوم ج-سيتس موصوفة أيضا. يمكن تطبيق لدينا تقنية مقايسة كامل الخلية الكهروكيميائية للتحقيق في حركية النقل بروتون للسلالات الجرثومية الأخرى اليكترواكتيفي.

Introduction

التقنيات الكهروكيميائية لتميز مباشرة بروتين الأكسدة والاختزال في إحدى خلايا بكتيرية سليمة ظهرت مؤخرا منذ اكتشاف السلالات الجرثومية الحد من المعادن، مثل السيد س. أونيدينسيس -1 أو سولفوريدوسينس جيوباكتير محكمة التحكيم الدائمة، التي لديها مجمعات السيتوكروم ج-نوع الغشاء الخارجي (أوم ج-سيتس) يتعرض إلى الخلية الخارجي1،2،3،،من45. أوم ج-سيتس التوسط النقل إلكترون من السلسلة التنفسية على ركائز متينة الموقع اكستراسيلولارلي. هذا النقل يشار إلى خارج الخلية الإلكترون النقل (EET)1،6 ، وهي عملية حاسمة للتكنولوجيات الحيوية الناشئة، مثل خلايا الوقود الميكروبية6. ولذلك، فهم حركية EET الكامنة، والآليات، وعلاقته فسيولوجيا الميكروبات، أوم ج-سيتس تم التحقيق باستخدام كامل الخلية كهربية4،7، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري 8 , 9والتحليل الطيفي10،11، والبيولوجيا الجزيئية2،4. وفي المقابل، أساليب للتحقيق أثر النقل المرتبطة EET الأيونات الموجبة، مثلاً، البروتونات، في حركية EET في الخلايا الحية نادراً ما أنشئت، رغم بروتون النقل عبر الأغشية البكتيرية التي لها دور حاسم في إشارات، والتوازن، والطاقة إنتاج12،،من1314. في هذه الدراسة، ويصف لنا تقنية لدراسة تأثير النقل بروتون في حركية EET في الخلية MR-1 أونيدينسيس س. باستخدام القياسات الكهروكيميائية كامل الخلية، الأمر الذي يتطلب تحديد الخطوة في الحد من معدل الميكروبية الإنتاج الحالي15.

هو إحدى الطرق المباشرة لتقييم مساهمة النقل بروتون على EET المرتبطة تأثير النظائر الحركية الديوتريوم (كيي). هو كي يمكن ملاحظتها كالتغيير في حركية نقل الإلكترون عند استبدال البروتونات مع أيونات الديوتريوم، الذي يمثل تأثير النقل بروتون على إلكترون نقل حركية16. تم إنشاء نظرية كيي نفسها جيدا باستخدام القياسات الكهروكيميائية بتنقية الإنزيمات17. بيد أن الإنتاج الحالي في السيد س. أونيدينسيس -1 النتائج من العمليات المتنوعة، وتقلبات متعددة،18، واحد لا يمكن ببساطة تحديد EET كعملية الحد من معدل. لمراقبة كيي في عمليات النقل بروتون يقترن EET، نحن بحاجة إلى التأكد من أن الإنتاج الحالي للميكروبات يقتصر النقل الإلكترون عبر أوم ج-سيتس لمسرى. ولهذا الغرض، قمنا باستبدال الحل طافية بالمتوسطة الطازجة التي تحتوي على تركيزات عالية من لاكتات كجهة مانحة إلكترون في الرقم الهيدروجيني الأمثل وظروف الحرارة قبل كيي القياس؛ خدم هذا الاستبدال دورين: (1) تعزيز معدل العمليات الأيضية المنبع مقارنة EET، و (2) تم حذف الخلايا السباحة في المادة طافية الإفراج عن بيوفيلم أحادي الطبقة السيد س. أونيدينسيس -1 بشأن (القطب العامل إنديوم ثلاثي أكسيد القصدير يخدر (إيتو) الكهربائي). قدم البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة الممارسين الجديدة الحفاظ على والتأكد من أن عملية EET خطوة تحديد معدل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تشكيل "بيوفيلم أحادي الطبقة" السيد س. أونيدينسيس -1 بشأن القطب إيتو (الشكل 1)

ملاحظة: لمنع تلوث المفاعلات الكهروكيميائية بالميكروبات الأخرى، جميع وسائل الإعلام، وتنفذ، ومكونات المفاعلات الكهروكيميائية ينبغي تعقيم مقدما. عند استخدام الخلايا السيد س. أونيدينسيس -1 وبناء المفاعلات الكهروكيميائية، ينبغي إجراء جميع الإجراءات على مقاعد البدلاء نظيفة.

  1. زراعة الخلايا MR-1 أونيدينسيس س.
    ملاحظة: تم تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة للسيد س. أونيدينسيس -1 في إيتو القطب الشروط التالية ذكرت سابقا4.
    1. أن تنمو خلايا 1 السيد س. أونيدينسيس ، أضف مستعمرة واحدة من السيد س. أونيدينسيس -1 نمت على صفيحة أجار تضم بيرتاني لوريا (رطل) (20 غرام/لتر) وبكتو أجار (15 جرام/لتر) في 15 مل متوسطة رطل (20 غرام/لتر) عند 30 درجة مئوية عن 24 ساعة في الظروف الهوائية مع الهز 160 لفة في الدقيقة.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية في 6,000 × ز لمدة 10 دقائق، وريسوسبيند بيليه الخلية الناتجة في 15 مل من المعرفة المتوسطة (pH 7.8) (مارك ألماني: ناكو3 [2.5 g/L]، كاكل2·2H2س [0.08 جرام/لتر], NH4Cl [1.0 غرام/لتر]، مجكل2· 6 ح2س [0.2 جرام/لتر], [10 غرام/لتر]، كلوريد الصوديوم و 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] حمض اثانيسولفونيك [هيبيس؛ 7.2 غرام/لتر])، وتستكمل مع لاكتات 10 ملم و 0.5 غرام/لتر مستخرج الخميرة كمصدر للكربون، والعناصر النزرة للسيد س. أونيدينسيس -1 ، على التوالي.
    3. كذلك زراعة تعليق خلية هوائيا في 30 درجة مئوية ح 12 مع الهز 160 لفة في الدقيقة والطرد المركزي مرة أخرى على 6,000 × ز للغسيل 10 دقيقة بيليه الخلية الناتجة مرتين مع المتوسطة مارك ألماني بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 6,000 ز × قبل الكهروكيميائية التجربة.
  2. بناء مفاعل الكهروكيميائية ثلاثة قطب كهربائي (الشكل 1)
    1. وضع الركازة إيتو كمسري العمل في الجزء السفلي من المفاعل.
    2. وفي وقت لاحق، إدراج اسطوانة زجاجية (قطرها 2 سم) وغطاء تترافلوروايثيلين (PTFE). ثم إدراج Ag/AgCl (بوكل المشبعة) وسلك البلاتين في المفاعل كأقطاب المرجعية والعداد، على التوالي.
      ملاحظة: لمنع تسرب الهواء والحل، إدراج ورقة بوتيل مطاط بين كل مكون.
    3. إضافة مل 4.0 مارك ألماني وتستكمل مع لاكتات 10 ملم واستخراج الخميرة 0.5 غرام/لتر في المفاعل الكهروكيميائية.
    4. بعد التأكد من أنه لا يوجد أي تسرب من المفاعل الكهروكيميائية، تدفق غاز النيتروجين في المفاعل الكهروكيميائية ما يزيد على 20 دقيقة للحفاظ على الظروف اللاهوائية داخل المفاعل الكهروكيميائية.
      ملاحظة: لمنع التلوث بالميكروبات الأخرى، الغاز ينبغي أن تتم تصفيته قبل أن يتدفق إلى المفاعل الكهروكيميائية.
    5. الاتصال المفاعل الكهروكيميائية بوتينتيوستات وتطبيق +0.4 الخامس (مقابل قطب الهيدروجين القياسي، وقالت أنها) إلى مسرى إيتو، الحفاظ على درجة حرارة المفاعل الكهروكيميائية في 30 درجة مئوية باستخدام نظام تداول مياه خارجية.
      ملاحظة: لمنع تأثير المجال الكهربائي الخارجي، يجب وضع المفاعل الكهروكيميائية في قفص فاراداي.
  3. الكهروكيميائية زراعة الخلايا 1 السيد س. أونيدينسيس (الشكل 1 و الشكل 2)
    1. ضبط كثافة الخلية تعليق تم الحصول عليها في الخطوة 1، 1 إلى بكثافة بصرية من 1.43 في 600 استخراج نانومتر (OD600) مع مارك ألماني تكملها الخميرة 10 ملم لاكتات و 0.5 غرام/لتر.
      ملاحظة: للحصول على التطوير التنظيمي الصحيح600، تطبيق تعليق خلية OD600 ≤ 0.8 إلى مطياف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة قبل ضبط OD600 إلى 1.43.
    2. أضف 0.3 مل تعليق خلية في المفاعل الكهروكيميائية عبر منفذ الحقن باستخدام حقنه: OD600 في المفاعل يتغير إلى 0.1.
      ملاحظة: إضافة تعليق خلية 0.3 مل مع OD600 = 1.43 في المفاعلات الكهروكيميائية التي تحتوي على نتائج متوسطة مل 4.0 4.3 مل الحل مع OD600 = 0.1. عند استخدام مفاعلات أخرى بأحجام مختلفة، مطلوب حساب كثافة الخلية.
    3. مواصلة التطبيق المحتملة في +0.4 الخامس (مقابل) لمسرى إيتو ح 25.
      ملاحظة: لتشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة في قطب إيتو، التأكد من أن يسلك الحالية المنتجة الانحراف أقل من 50 في المائة من الرقم 2.

2-استبدال المادة طافية مع الطازجة المتوسطة مارك ألماني مع لاكتات 10 ملم (الشكل 3)

  1. إيقاف التطبيق المحتملة وقطع المفاعل الكهروكيميائية بوتينتيوستات، ونظام توزيع المياه.
  2. لاكتات الاستعاضة عن المادة طافية مع الطازجة المتوسطة مارك ألماني مع 10 ملم
    1. تدفق غاز النيتروجين في زجاجة تحتوي على مارك ألماني مع 10 ملم لاكتات أكثر من 20 دقيقة لإزالة الأكسجين من الوسط.
    2. ببطء إزالة جميع المادة طافية داخل المفاعل الكهروكيميائية استخدام المحاقن، ظل تدفق غاز النيتروجين (الشكل 3 أ، ب).
      ملاحظة: لتجنب كسر في بيوفيلم على مسرى إيتو بغاز النيتروجين، يجب أن تدفق الغاز فوق سطح السائل.
    3. إضافة مل 4.0 مارك ألماني الطازجة التي تحتوي على 10 ملم لاكتات استخدام المحاقن (الشكل 3 ج).
      ملاحظة: لتجنب كسر في بيوفيلم على مسرى إيتو، ببطء حقن المتوسطة على طول جدار المفاعلات الكهروكيميائية. للحفاظ على بيوفيلم الرطب، تضاف المتوسط فورا بعد إزالة المادة طافية. حقن تصل متوسطة 1 دقيقة بعد إزالة المادة طافية لا يؤثر الإنتاج الحالي من بيوفيلم السيد س. أونيدينسيس -1.
    4. انحدار للمفاعل الكهروكيميائية لإزالة كل من المادة طافية تعلق على الحائط للمفاعل الكهروكيميائية.
    5. كرر 2.2.2-2.2.4 خطوات ثلاث مرات في المجموع.
  3. وقف تدفق الغاز وربط المفاعل الكهروكيميائية بوتينتيوستات مرة أخرى، تطبيق +0.4 الخامس (مقابل) على مسرى إيتو في 303 ك.

3-إضافة الماء الديوتريوم لقياس كيي في عملية EET (الشكل 4)

  1. وتؤكد أن الإنتاج الحالي من بيوفيلم أحادي الطبقة للسيد س. أونيدينسيس -1 هو مستقر ولا يزداد بسرعة. إذا كانت الزيادات الحالية انخفاضا حادا، الانتظار حتى تستقر الحالية داخل زيادة بنسبة 5% أكثر من 10 دقيقة.
    ملاحظة: تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة على مسرى إيتو دون تلوث أخرى السلالات الجرثومية وأكد متواليات المتاشب ومسح صورة مجهرية إلكترون من بيوفيلم على قطب إيتو، كما ذكرت سابقا4. تأكيدا لمعدل القيد بعملية EET، رصد تأثير إضافة مكوكية إلكترون الوسطاء مثل 100 ميكرومتر انثراكينون-1-فلورو أوكتان المشبع (α-AQS). راجع المقطع من نتائج الممثل ومرجع15 للحصول على مزيد من التفاصيل.
  2. إضافة 40 ميليلتر من وصول 50% (v/v) د2س في المفاعل الكهروكيميائية استخدام المحاقن يكون التركيز 0.5% (v/v) د2س في المفاعل.
    ملاحظة: لمنع الأضرار بيوفيلم بإضافة2س د، حقن د2س دروبويسي.
  3. انتظر الحالية لتحقيق الاستقرار، وبعد ذلك أضف د2س يصل إلى 4.0% (v/v).
    ملاحظة: للحصول على قيمة كيي (نسبة الإنتاج الحالي حضور د2س وح2س)، التحقق من تأثير نفس الحجم من الإضافة2س ح في الإنتاج الحالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد 25 ساعة من إمكانية تطبيقها في +0.4 الخامس (مقابل)، تم تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة على مسرى العامل من الزجاج إيتو، الذي أكده سابقا الميكروسكوب الإلكتروني مسح أو الفحص المجهري [كنفوكل]4. يتم عرض مسار الإنتاج الحالي من السيد س. أونيدينسيس -1 أثناء تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة الوقت الممثل في الشكل 2. على الرغم من أن يغير الحالية في كل قياس، لا يحمل الحالية المنتجة انحراف أكثر من 50% من القيمة الموجودة في الشكل 2 إذا تم تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة شكل موحد.

بعد استبدال المادة طافية مع مارك ألماني جديدة مع لاكتات 10 ملم زيادة معدل العمليات الأيضية وتغسل بيوفيلم أحادي الطبقة (الشكل 3)، ويمكن ملاحظة حالية انوديك مستقرة (حوالي 5 في المائة زيادة في 10 دقيقة) تحت +0.4 الخامس (مقابل أنها ) التطبيق (الشكل 4 أ). إذا كانت الزيادات الحالية انوديك حادا، انتظر حتى تستقر الحالية. من الممكن جداً أن الإجراءات المتعلقة باستبدال طافية المبينة في القسم 2 يمكن أن تلحق الضرر بيوفيلم ويمكن أن يحدث إعادة الإعمار.

خط متصل في الشكل 4a هو نتيجة الممثل للتغيير الحالي الميكروبية التي يتسبب فيها بإضافة2س د. إضافة 1، 0% (v/v) د2س انخفضت انخفاضا حادا الحالية الميكروبية داخل 10 ق، في حين لوحظ تقريبا لا الانخفاض الحالي بإضافة ح2س (الخط المنقط في الشكل 4a)15. واستنسخ نفس الاتجاه في تجارب منفصلة أربعة على الأقل. إضافة متسلسلة من د2س في النهائي تركيزات تتراوح بين 0.5% إلى 2، 0% (v/v) وضوح معارضها قمع قوي في الإنتاج (الشكل 4 أ) الحالي15. لأن الإنتاج الحالي للميكروبات تدريجيا استردادها يرجح أن سبب19،الأثر الفسيولوجي20، كيي ينبغي أن تسند إلى الانخفاض الحالي قريبا بعد إضافة د2o. في تقرير سابق، جمعنا الإنتاج الحالي في حوالي 10 دقيقة بعد إضافة د2س لحساب قيمة كيي15.

استخدام أسلوبين، أكدنا أن لوحظ الانخفاض الحالي بإضافة2س د يعزى إلى كيي على EET عن طريق أوم ج-سيتس المعقدة. أولاً، أضفنا 1 ميكرومتر والريبوفلافين (RF) أو فلافين مونونوكليوتيدي (فمن) في المفاعل الكهروكيميائية قبل وبعد إضافة2س د، التي يمكن استخدامها لدراسة EET في السيد س. أونيدينسيس -1. وفي حالة السيد س. أونيدينسيس -1، فلافينس على وجه التحديد التعجيل بعملية EET ملزمة مع أوم ج-سيتس في بضع ثوان، نظراً فلافينس تعمل بوصفها ملزمة غير التساهمية العوامل المساعدة21،22، 23. ولذلك يشير إلى أن زيادة الحالية انوديك فورية بإضافة فلافين معدل القيد قبل عملية EET عبر أوم ج-سيتس (الشكل 5). وأكدت أننا كذلك أثر جولات مكوكية الوسطاء إلكترون في كيي. الجزيئات الصغيرة الأكسدة، مثلاً، انثراكينون-1-فلورو أوكتان المشبع (α-AQS)، إنهاء عملية EET بنشرها من سلسلة نقل الإلكترون الميكروبية على مسرى، بدلاً من نقل الإلكترون مباشرة عبر أوم ج-سيتس15 , 24-إضافة 100 ميكرومتر α-AQS هنا، تعزيز الإنتاج الحالي بأكثر من إضعاف (الشكل 4 باء)، مما يشير إلى أن حركية التفاعلات الأيضية سريعة بما يكفي لجعل EET عملية الخطوة الحد من معدل. الدوام، ظل الإنتاج الحالي توسط α-AQS لم يتأثر بإضافة2س د (الشكل 4 باء)، مما يدل على أن التأخير المحتمل في التفاعلات الأيضية د2س لا يسبب كيي الكبيرة التي لوحظت في الشكل 4a .

أن الجمع بين هذين النهجين لمراقبة كيي في نقل الإلكترون مع أوم ج-سيتس النقطة الحرجة لهذا التقرير، وعلى وجه التحديد، جولات مكوكية إلكترون الوسطاء يمكن أن تنطبق على سائر الأغشية الحيوية اليكترواكتيفي. وبالإضافة إلى ذلك، عندما أكدنا أن التغيير الحالي تم تعيينه إلى عملية EET، نحن يمكن أن تقييم أثر متحولة الحذف الجزئي أوم ج-سيتس أو من فلافين المرتبطة باوم جنقل-سيتس على البروتون الحركية بمقارنة كيي في كل الحالات15. عندما تمت إضافة د2س حضور FMN ملزمة باوم ج-سيتس، الانخفاض الحالي تم تخفيض مثل أنه كان أصغر من أنه بدون فمن، مشيراً إلى أن ربط FMN غيرت مسار النقل بروتون ولها حركية (الشكل ج 4)15.

Figure 1
رقم 1: المفاعلات الكهروكيميائية المستخدمة في هذه الدراسة. صورة لخلية كهروكيميائية قبل البناء () وبعد البناء (ب). (ج) توضيح التخطيطي للمفاعل الكهروكيميائية بعد 25 ساعة تطعيم الكهروكيميائية في +0.4 الخامس مقابل أنها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الإنتاج الحالي الممثل من السيد س. أونيدينسيس -1 أثناء تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة في قطب إيتو. يشير سهم إلى الوقت لإضافة تعليق خلية في المفاعل الكهروكيميائية. واستنسخ نفس الاتجاه في خمسة على الأقل من التجارب الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: استبدال المادة طافية إلى متوسط المعرفة الطازجة (مارك ألماني) مع 10 ملم لاكتات. () غاز النيتروجين تدفق فوق سطح السائل. (ب) إزالة المادة طافية من المفاعل الكهروكيميائية. (ج) إضافة لمل 4.0 مارك ألماني جديدة تتضمن 10 ملم لاكتات. بعد إضافة المتوسط، ينبغي أن يميل المفاعل لإزالة المادة طافية تعلق على الحائط للمفاعل. إجراء هذه الإجراءات (ج) ثلاث مرات في المجموع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تأثير إضافة2س د على الإنتاج الحالي من بيوفيلم أحادي الطبقة للسيد س. أونيدينسيس -1- الوقت مقابل الإنتاج الحالي بيوفيلم أحادي الطبقة السيد س. أونيدينسيس -1 في نظام الكهروكيميائية التي تحتوي على 10 ملم لاكتات ()، إضافية 100 ميكرومتر انثراكينون-1-فلورو أوكتان المشبع (α-AQS) (ب)، أو مكم 2 إضافية مونونوكليوتيدي فلافين (FMN) (ج). نفس الاتجاه المستنسخ في مالا يقل عن أربع تجارب فردية. تشير الأسهم إلى وقت إضافة د2س (خط متصل) أو ح2س (الخط المنقط). تم تطبيع البيانات المقابلة لخط منقط لنقطة البيانات قبل إضافة د2س في بيانات خط متصل. يشار إلى أن تركيز د2س في المفاعل الكهروكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التقييم تحديد المعدل خطوة في الإنتاج الحالي من بيوفيلم أحادي الطبقة من س. أونيدينسيس السيد-1 بإضافة فلافينس- الوقت مقابل الإنتاج الحالي من بيوفيلم أحادي الطبقة للسيد س. أونيدينسيس -1 حضور لاكتات 10 ملم (خط متصل) و 1.0 مم لاكتات (خط متقطع) لاكتات 0.1 ملم (الخط المنقط). يشير سهم إلى نقطة الوقت في أي 1 ميكرومتر أضيفت فلافين مونونوكليوتيدي (فمن) في المفاعلات الكهروكيميائية. حضور 10 ملم لاكتات، إضافة FMN جذريا زيادة الإنتاج الحالي، مما يدل على أن نقل الإلكترون خارج الخلية (EET) عن طريق ج-اكتب مجمعات الفسفرة جزءا لا يتجزأ من الغشاء الخارجي البكتيرية (OM ج -سيتس) هو تحديد معدل. أقل لاكتات التركز في المفاعل الكهروكيميائية الناجمة عن عملية تعزيز الحالية أصغر إضافة FMN، مما يدل على أن إمدادات إلكترون من التفاعلات الأيضية المنبع أوم ج-سيتس تدريجيا وأصبح أبطأ من معدل EET. واستنسخ نفس الاتجاه في اثنين على الأقل من التجارب الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لدينا تحليل كامل الخلية الكهروكيميائية له العديد من المزايا التقنية مقارنة مع البروتين كهربية. بينما يتطلب تنقية البروتين متعدد خطوة إجراءات تستغرق وقتاً طويلاً، لدينا أسلوب كامل الخلية يأخذ يوم واحد لتشكيل بيوفيلم المنظمة ذاتيا بعد زراعة الخلايا. لتحقيق تفاعل مستقرة بين أوم ج-سيتس ومسرى، نحن بحاجة فقط تعقيم وتنظيف سطح القطب؛ أنها لا تتطلب التعديل الكهربائي لتنظيم توجه البروتينات4، مثلاً، السيد س. أونيدينسيس -1 ارتباطاً وثيقا وتعلق على مسرى، بينما توجه أوم ج-سيتس في الاتجاه نفسه25 , 26 , 27-على النقيض من ذلك، تتأثر التفاعلات الكهروكيميائية للبروتينات حس مرهف بالمسافة بين مواقع الأكسدة والاختزال في البروتين والكهربائي؛ وبالتالي، يجب أن تكون البروتينات المنقاة موجهة بعناية28،29. الأهم من ذلك، فحص كامل الخلية الكهروكيميائية مباشرة يميز أوم ج-سيتس المجمعات جزءا لا يتجزأ من غشاء دهني مع التفاعلات الممكنة مع غيرها من البروتينات الغشاء، ويعكس ذلك البروتون الأصلي الإدارة في OM ج -سيتس (هذا غالباً ما يصعب على تقليد استخدام البروتينات المنقاة).

ومع ذلك، لدينا تقنية قد القيد فيما يتعلق بتركيز عالية O. تركيزات د2س يحتمل أن تبطئ عمليات الأيض والنمو19؛ د2 ولذلك، أجرينا تجارب استخدام تركيزات2س د التي كانت أقل من 4% (v/v) في هذا البروتوكول. وباﻹضافة إلى ذلك، سبب ينظم التعبير الجيني في الميكروبات بطريقة معقدة، الاختلافات الشرطي الصغيرة قد بقوة تؤثر على النمط الظاهري للميكروبات وحتى حركية الإلكترون النقل. على وجه الخصوص، ينخفض تركيز لاكتات أثناء الإنتاج الحالي من بيوفيلم 1-السيد س. أونيدينسيس ؛ ولذلك، من المهم إجراء التجارب كيي قبل عملية الحد من معدل التحول للتفاعلات الأيضية المنبع.

أهم نقطة حرجة بنجاح الحصول على كيي هو توضيح وتأكيد الشرط الذي نقل الإلكترون عن طريق أوم ج-سيتس حدود معدل الإنتاج الحالي تخضع للتحليل الكهروكيميائية كامل الخلية. في هذا البروتوكول، ونشرح كيفية التأكد من أن معدل EET يحد، ويعكس الإنتاج الحالي الميكروبية. قدمنا مجموعة من الأساليب اثنين؛ مراقبة التغيير الحالية ب إضافة فلافين23، وإضافة2س د حضور نشرها إلكترون وسيط، مثلاً، α-AQS15 (الشكل 4 و الشكل 5). إذا كان أحد لا يمكن جعل EET عملية الحد من معدل، سيكون السبب الأكثر احتمالاً تشكيل غير مكتملة أو مفرزة المادية بيوفيلم أحادي الطبقة، أو التلوث بالميكروبات الأخرى. نوصي بشدة بتأكيد تشكيل بيوفيلم أحادي الطبقة عن طريق فحص المجهر الإلكتروني أو مجهرية [كنفوكل]. فمن الممكن جداً أن عملية الاستبدال متوسطة الأضرار بيوفيلم؛ ولذلك، إزالة وحقن للمتوسط ينبغي أن تجري ببطء، وأن تدفق غاز النيتروجين فوق سطح السائل (الشكل 3). إذا جعل بيوفيلم أحادي الطبقة موحدة لا EET عملية الحد من معدل، فمن الأفضل لإعادة فحص المكونات المتوسطة وظروف القياس، مثلاً، مكملات لاكتات بتركيز أعلى من 10 ملم، لزيادة التعجيل في العمليات الأيضية المنبع. هذه الاعتبارات مهمة أيضا في أنواع أخرى من الميكروبات قادرة على EET. يمكن استخدام الوسطاء الإلكترون على وجه التحديد لتأكيد أن عملية EET الحد من معدل في أنواع أخرى من الميكروبات قادرة على EET بما في ذلك خلائط سلالات البكتيرية؛ وهكذا، نعتبر هذا البروتوكول كوسيلة عامة للتحقيق في تأثير البروتونات على نقل الإلكترون مباشرة في واجهة البكتيريا/قطب الحركية. النظر في أن يلاحظ EET في غيرها من السلالات الجرثومية واتحادات، وبقدر ما عملية EET الحد من معدل، هذا البروتوكول لا ينطبق على دراسة تنفس الميكروبية في تآكل الحديد اللاهوائية وعمليات أكسدة الميثان وكذلك في خلايا الوقود الميكروبية30،31.

نظامنا من السيد س. أونيدينسيس -1 أحادي الطبقة بيوفيلم مع عملية الحد من معدل EET عبر أوم ج-سيتس يمكن استخدامها ليس فقط للتجارب كيي بل أيضا لوصف البيوكيميائية أوم ج-سيتس. على سبيل المثال، إضافة تركيزات مختلفة من فلافينس التي تربط كالعوامل المساعدة أوم ج-سيتس تسمح الكهروكيميائية التحديد الكمي لثابت التفكك (كد ~ 10 ميكرون) لتشكيل فلافين زمنياً أوم ج- سيتس مجمعات32،،من3334. وعلاوة على ذلك، أظهرت عملنا مؤخرا أن عملية الدفق إلكترون معكوس عبر أوم ج-سيتس يمكن أن تتميز من خلال33،الإنتاج الحالي الكاثودية34. وقد اقترح أن الدفق إلكترون مرتبط باستيراد بروتون عبر OM كمصدر ل توليف ATP تشيميوسموتيك35؛ ولذلك، أنها ذات أهمية كبيرة لدراسة تأثير البروتونات في حركية الدفق الإلكترونات في أوم ج-سيتس.

وفي الختام، قمنا بتطوير تقنيات لدراسة الديوتريوم كيي على EET عن طريق أوم ج-سيتس استخدام يعيش السيد س. أونيدينسيس -1. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتوصيف أوم ج-سيتس، فضلا عن المراقبة كيي، والتي يمكن تطبيقها للميكروبات وآﻻت أخرى. ونحن نعتقد أن هذه المنهجية يمكن أن تكون تقنية عامة للتحقيق EET مباشرة عن طريق أوم ج-سيتس في فيفو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل ماليا معونات لتشجيع البحوث خصيصا من "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم 24000010، ح 17 04969، و JP17J02602، "لنا مكتب البحرية البحوث العالمية" (N62909-17-1-2038). Y.T. وهو زميل أبحاث JSPS وتدعمها JSPS من خلال البرنامج لقيادة خريج المدارس (بالجدارة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 134، كهربية كامل الخلية، cytochromes، معدنية الحد من البكتيريا، نقل بروتون، فلافين، بيويليكتروكهيميستري، وخلايا الوقود الميكروبية، بيوفيلم اليكترواكتيفي
الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في <em>أونيدينسيس شيوانيلا</em> السيد-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, More

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter