Summary
Hier presenteren we een protocol van geheel-cel elektrochemische experimenten te bestuderen van de bijdrage van proton vervoer aan het tarief van extracellulaire elektronentransport via de buitenmembraan cytochromes complex in Shewanella oneidensis heer-1.
Abstract
Directe elektrochemische detectie van c-type cytochroom complexen ingebed in de bacteriële buitenmembraan (buitenmembraan c-Typ cytochroom complexen; OM c- Cyts) heeft onlangs naar voren gekomen als een roman geheel-cel analysemethode te karakteriseren de bacteriële elektronentransport uit de luchtwegen keten aan de buitenkant van de cel, hierna aangeduid als de extracellulaire elektronentransport (EET). Terwijl het traject en de kinetiek van de stroom van elektronen tijdens de EET-reactie zijn onderzocht, is een elektrochemische geheel-cell, methode te onderzoeken van de effecten van het vervoer van de catie gekoppeld EET nog niet vastgesteld. In de huidige studie, een voorbeeld van een biochemische techniek te onderzoeken het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE) op EET t/m OM c- Cyts met behulp van een model-microbe, Shewanella oneidensis heer-1, wordt beschreven. De KIE op het EET-proces kan worden verkregen als de EET t/m OM c- Cyts als de snelheidslimieten stap in de microbiële huidige productie fungeert. Te dien einde, vóór de toevoeging van D2O, werd de bovenstaande oplossing vervangen door verse medium met een voldoende hoeveelheid van de elektronendonor ter ondersteuning van het tempo van de upstream metabole reacties, en te verwijderen van de planktonische cellen van een uniform enkelgelaagde biofilm op de elektrode werken. Alternatieve methoden te bevestigen de snelheidslimieten-stap in microbiële huidige productie als EET t/m OM c- Cyts ook worden beschreven. Onze techniek van een geheel-cel elektrochemische assay voor het onderzoeken van proton vervoer kinetiek kan worden toegepast op andere microbiële stammen van electroactive.
Introduction
Elektrochemische technieken te karakteriseren direct een redox-eiwit in een intact bacteriële cel onlangs naar voren zijn gekomen sinds de ontdekking van metaal-reducerende microbiële stammen, zoals S. oneidensis heer-1 of Geobacter sulfurreducens partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst, die hebben de buitenmembraan cytochroom c-type complexen (OM c-Cyts) blootgesteld aan de cel exterieur1,2,3,4,5. De OM- c- Cyts bemiddelen elektronentransport uit de luchtwegen keten aan vaste substraten gelegen extracellularly. Dit vervoer wordt hierna aangeduid als extracellulaire elektronentransport (EET)1,6 en is een kritiek proces voor opkomende biotechnologie, zoals microbiële brandstofcellen6. Daarom, om te begrijpen van de onderliggende EET-kinetiek en mechanismen, en haar link naar microbiële fysiologie, OM c -Cyts zijn onderzocht met behulp van geheel-cel elektrochemie4,7, gecombineerd met microscopie 8 , 9, spectroscopie10,11, en moleculaire biologie2,4. In tegenstelling, zijn methoden voor het onderzoeken van de effecten van het EET-geassocieerde catie vervoer, bijvoorbeeld protonen, op EET kinetiek in levende cellen nauwelijks vastgesteld, ondanks proton vervoer over bacteriële membranen hebben een cruciale rol signalering, homeostase en energie productie12,13,14. In de huidige studie, beschrijven we een techniek om de onderzoeken van het effect van het proton vervoer op EET kinetiek in de S. oneidensis heer-1 cel met behulp van geheel-cel Electrochemische metingen, waarvoor de identificatie van de snelheidslimieten stap in microbiële huidige productie15.
Een directe manier om de bijdrage van het proton vervoer op de bijbehorende EET is het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE). De KIE is waarneembaar als de verandering in de elektronen overdracht kinetiek op de vervanging van protonen met deuterium ionen, die de impact van het proton vervoer op elektron overdracht kinetiek16aangeeft. De theorie van KIE zelf is goed opgezet Electrochemische metingen met gezuiverde enzymen17. Echter, aangezien huidige productie in S. oneidensis heer-1 wordt veroorzaakt door meerdere, divers, en schommelende processen18, niet één EET gewoon identificeren als de snelheidslimieten proces. Om te zien hoe de KIE op proton transportprocessen EET wordt gekoppeld, moeten we om te bevestigen dat de microbiële huidige productie wordt beperkt door elektronentransport via OM c- Cyts op de elektrode. Voor dit doel vervangen wij het supernatant oplossing met verse opslagmedium met een hoge concentratie van lactaat als een elektrondonor tegen de optimale pH en temperatuurvoorwaarden voor KIE meting; deze vervanging diende twee rollen: (1) het verbeterd het tarief van de upstream metabole processen ten opzichte van de EET, en (2) de cellen van het zwemmen in het supernatant vrijgelaten uit de biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 op de werkende elektrode (weggelaten indium tin-doped oxide (ITO) elektrode). De gepresenteerde gedetailleerd protocol is bedoeld om te helpen nieuwe beoefenaars handhaven en bevestigen dat het proces EET de tarief-bepalen stap is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de vorming van een Biofilm Monolayer van S. oneidensis heer-1 op een ITO elektrode (Figuur 1)
Opmerking: Om te voorkomen dat de besmetting van de elektrochemische reactor met andere microben, alle media, werktuigen, en onderdelen van de elektrochemische reactor moeten worden gesteriliseerd bij voorbaat. Wanneer cuvetten van S. oneidensis heer-1 en de bouw van de elektrochemische reactoren, alle procedures moeten worden uitgevoerd op een schone bankje.
- Teelt van S. oneidensis heer-1 cellen
Opmerking: Een enkelgelaagde biofilm van S. oneidensis heer-1 ontstond op een ITO elektrode de volgendevoorwaarden gemeld eerder4.- Toevoegen om te groeien S. oneidensis heer-1 cellen, een kolonie van S. oneidensis heer-1 geteeld op een bestaande uit Luria Bertani (LB) (20 g/L) en bacto agar (15 g/L) in 15 mL van LB medium (20 g/L) bij 30 ° C gedurende 24 uur in aërobe omstandigheden met schudden bij 160 rpm agarplaat.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 6.000 × g gedurende 10 min, en resuspendeer de pellet van de resulterende cel in 15 mL beschreven medium (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L], en 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic zuur [HEPES; 7.2 g/L]), aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gistextract als de bron van koolstof, en sporenelementen voor S. oneidensis heer-1 , respectievelijk.
- Verder cultiveren van de celsuspensie aëroob bij 30 ° C gedurende 12 h met schudden bij 160 t/min en Centrifugeer nogmaals bij 6.000 × g voor 10 min. Wash de resulterende cel pellet tweemaal met DM medium door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 6.000 × g vóór de elektrochemische experiment.
- Bouw van een drie-elektrode elektrochemische reactor (Figuur 1)
- Zet een ITO substraat als de werkende elektrode aan de onderkant van de reactor.
- Een glazen cilinder (diameter van 2 cm) en een cover van polytetrafluorethyleen (PTFE) vervolgens invoegen. Vervolgens invoegen Ag/AgCl (KCl verzadigd) en een platina-draad in de reactor als de referentie- en teller elektroden, respectievelijk.
Opmerking: Om te voorkomen dat de lekkage van lucht en oplossing, plaatst u een vel butyl rubber tussen elk onderdeel. - Voeg 4,0 mL DM aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gistextract in de elektrochemische reactor.
- Nadat u hebt bevestigd dat er geen lekkage van de elektrochemische reactor is, vloeien de stikstofgas in de elektrochemische reactor meer dan 20 min anaërobe voorwaarden binnen de elektrochemische reactor te handhaven.
Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting met andere microben, het gas moet worden gefilterd voordat hij mondt uit in de elektrochemische reactor. - De elektrochemische reactor verbinden met een potentiostaat en toepassing van de +0.4 V (ten opzichte van de standaard-waterstofelektrode, ze) naar de ITO-elektrode, houden de temperatuur van de elektrochemische reactor bij 30 ° C met behulp van een externe watersysteem in het verkeer.
Opmerking: Om te voorkomen dat het effect van een extern elektrisch veld, de elektrochemische reactor moet worden geplaatst in een kooi van Faraday.
- Elektrochemische teelt van S. oneidensis heer-1 cellen (Figuur 1 en Figuur 2)
- Aanpassen van de celdichtheid van de schorsing verkregen in stap 1.1 aan een optische dichtheid van 1,43 op 600 nm (OD600) met DM aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gist extract.
Opmerking: Voor het verkrijgen van de juiste OD600, toepassen op de celsuspensie van OD600 ≤ 0.8 een UV-vis-spectrometer voorafgaand aan de aanpassing van de OD600 tot 1,43. - Voeg 0.3 mL van de celsuspensie in de elektrochemische reactor via de poort van de injectie met behulp van een injectiespuit: de OD600 in de reactor verandert tot 0,1.
Opmerking: De toevoeging van 0,3 mL celsuspensie met OD600 = 1,43 in elektrochemische reactor met 4,0 mL middellange resultaten in 4.3 mL van oplossing met een OD600 = 0,1. Als u andere reactoren met verschillende volumes, is de berekening van de celdichtheid vereist. - De potentiële toepassing op +0.4 V (in tegenstelling tot zij) naar de ITO-elektrode voor 25 h worden voortgezet.
Opmerking: Voor de vorming van een biofilm enkelgelaagde op een ITO-elektrode, zorgen dat de geproduceerde stroom een afwijking van minder dan 50% uit Figuur 2 vertoont.
- Aanpassen van de celdichtheid van de schorsing verkregen in stap 1.1 aan een optische dichtheid van 1,43 op 600 nm (OD600) met DM aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gist extract.
2. vervanging van het supernatans dat met verse DM Medium met 10 mM lactaat (Figuur 3)
- De potentiële toepassing stoppen en de elektrochemische reactor verbreken met de potentiostaat en het watersysteem van de omloop.
- Vervanging van het supernatans dat met verse DM medium met 10 mM lactaat
- Stroom het stikstofgas in een fles met DM met 10 mM lactaat meer dan 20 min om zuurstof van het medium.
- Verwijder alle het supernatant binnen de elektrochemische reactor met behulp van een injectiespuit, onder stroomt langzaam stikstofgas (Figuur 3a, b).
Opmerking: Om te voorkomen breken de biofilm op de ITO-elektrode door stikstofgas, moet het gas boven het vloeistofoppervlak stromen. - Voeg 4,0 mL verse DM met 10 mM lactaat met behulp van een injectiespuit (Figuur 3 c).
Opmerking: Om te voorkomen breken de biofilm op de ITO-elektrode, injecteren langzaam het medium langs de muur van de elektrochemische reactor. Om te houden de biofilm NAT, moet het medium worden toegevoegd onmiddellijk na de verwijdering van de bovendrijvende substantie. Injectie van de middellange upto 1 min na de verwijdering van supernatant beïnvloedt niet de huidige productie van de biofilm van S. oneidensis heer-1. - Hellen de elektrochemische reactor om alle van het supernatans dat is gekoppeld aan de muur van de elektrochemische reactor te verwijderen.
- Herhaal de stappen 2.2.2-2.2.4 drie keer in totaal.
- Sluit de gasstroom en de elektrochemische reactor verbinden met de potentiostaat weer, +0.4 V (in tegenstelling tot zij) toe te passen op de elektrode ITO op 303 K.
3. de toevoeging van Deuterium Water voor het meten van het KIE op het EET-proces (Figuur 4)
- Bevestigen dat de huidige productie van een biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 stabiel is en niet snel toeneemt. Als de huidige steil stijgt, wachten totdat de huidige binnen een stijging van 5% meer dan 10 min stabiliseert.
Opmerking: De vorming van een biofilm enkelgelaagde op een elektrode ITO zonder besmetting van andere microbiële stammen werd bevestigd door rDNA sequenties en een scanning elektronen microscopische opname van de biofilm op een ITO-elektrode, zoals gemeld eerder4. Bevestiging van de tarief-beperking door het proces van EET, worden gecontroleerd door het effect van het toevoegen van pendelen elektron bemiddelaars zoals 100 µM Anthrachinon-1-sulfonaat (α-AQS). Zie de sectie Vertegenwoordiger resultaten en verwijst naar15 voor verdere details. - Voeg 40 µL van zuurstofvrije 50% (v/v) D2O in de elektrochemische reactor met behulp van een injectiespuit zodanig zijn dat de concentratie 0,5% (v/v) D2O in de reactor is.
Opmerking: Om te voorkomen dat schade aan de biofilm door D2O toevoeging, injecteren de D2O drop-wise. - Wacht tot de huidige te stabiliseren en de D2O alsnog tot 4,0% (v/v).
Opmerking: Voor het verkrijgen van de KIE-waarde (de verhouding tussen de huidige productie in aanwezigheid van D2O en H2O), het effect van de dezelfde hoeveelheid H2O toevoeging op de huidige productie controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 25 h van potentiële toepassing op +0.4 V (in tegenstelling tot ze) ontstond een enkelgelaagde biofilm op de elektrode van de werken van ITO glas, die eerder door een scanning elektronen microscopie of een confocale microscopie4werd bevestigd. De representatieve tijdsverloop van de huidige productie van de S. oneidensis heer-1 tijdens de vorming van een biofilm enkelgelaagde is afgebeeld in Figuur 2. Hoewel de huidige in elke meting verandert, doet de geproduceerde stroom niet vertonen een afwijking van meer dan 50% van de waarde in Figuur 2 als een enkelgelaagde biofilm gelijkmatig wordt gevormd.
Na vervanging van de bovendrijvende substantie met verse DM met 10 mM lactaat te maximaliseren van het aantal stofwisselingsprocessen en wassen van de enkelgelaagde biofilm (Figuur 3), kan een stabiele anodic stroom (ongeveer 5% toename in 10 min) worden waargenomen onder +0.4 V (in tegenstelling tot ze ) toepassing (figuur 4a). Als de huidige anodic steil stijgt, wachten totdat de huidige stabiliseert. Het is zeer mogelijk dat de procedures voor het supernatant vervanging beschreven in paragraaf 2 de biofilm beschadigen kunnen en wederopbouw kan optreden.
De ononderbroken lijn in figuur 4a is het representatief resultaat voor de microbiële huidige verandering geïnduceerd door de toevoeging van de2O D. De toevoeging van 1,0% (v/v) D2O scherp daalden de microbiële huidige binnen 10 s, terwijl bijna geen huidige daling werd waargenomen door de toevoeging van H2O (gestippelde lijn in figuur 4a)15. De dezelfde tendens werd gereproduceerd in ten minste vier afzonderlijke experimenten. De sequentiële toevoeging van D2O op eindconcentraties variërend van 0,5% tot 2,0% (v/v) duidelijk tentoongesteld sterke onderdrukking in de huidige productie (figuur 4a)15. Omdat de microbiële huidige productie geleidelijk hersteld waarschijnlijk als gevolg van de fysiologische effect19,20, moet KIE worden toegewezen aan de huidige daling kort na de toevoeging van D2O. In een vorig rapport verzameld we de huidige productie van ongeveer 10 min na toevoeging van D2O voor het berekenen van de waarde van KIE15.
Met behulp van twee methoden bevestigd we dat de waargenomen daling van de huidige door de toevoeging van de2O D te wijten is aan het KIE op de EET door het OM c- Cyts complex. Ten eerste, we toegevoegd 1 µM Riboflavine (RF) of flavine mononucleotide (FMN) aan de elektrochemische reactor vóór en na de D2O toevoeging, die kan worden gebruikt om te studeren EET in S. oneidensis heer-1. In het geval van S. oneidensis heer-1, flavins specifiek versnellen EET door binding met OM c- Cyts in een paar seconden, omdat het flavins als niet-covalente binding cofactoren21,22, functioneren 23. daarom een instant anodic huidige verhoging door flavin toevoeging tarief beperking geeft door het EET proces via OM c- Cyts (Figuur 5). Verder hebben bevestigd die wij het effect van het elektron bemiddelaars op KIE pendelen. Kleine redox moleculen, bijvoorbeeldAnthrachinon-1-sulfonaat (α-AQS), de EET-proces beëindigen door het verspreiden van de microbiële elektronentransport keten voor de elektrode, in plaats van directe elektronentransport via OM c- Cyts15 , 24. hier, de toevoeging van 100 µM α-AQS verbeterd de huidige productie van meer dan 5-voudig (figuur 4b), die aangeeft dat de kinetiek van de metabole reacties snel genoeg om het verwerken van de snelheidslimieten stap EET. Consequent, bleef huidige productie gemedieerd door α-AQS onaangetast door D2O toevoeging (figuur 4b), waaruit blijkt dat de mogelijke vertraging in metabole reacties door D2O niet de grote KIE waargenomen in figuur 4a tot .
De combinatie van deze twee benaderingen voor het observeren van het KIE op elektronentransport met OM c- Cyts is het kritieke punt van dit verslag, en in het bijzonder pendelen elektron bemiddelaars kan gelden voor andere electroactive biofilms. Bovendien, zodra we bevestigd dat de huidige wijziging wordt toegewezen aan het proces van EET, we het effect van een mutant gedeeltelijke verwijdering van OM ckan beoordelen - Cyts of van een flavin gekoppeld OM c- Cyts op het proton transfer kinetiek door het vergelijken van het KIE in beide gevallen15. Wanneer D2O werd toegevoegd in de aanwezigheid van FMN bindend met OM c- Cyts, de huidige daling werd teruggebracht zodat het kleiner dan dat zonder FMN was, die aangeeft dat de binding van FMN het proton vervoer traject en de kinetiek (figuur gewijzigd 4 c)15.
Figuur 1: elektrochemische reactor in deze studie gebruikt. Foto van de elektrochemische cel voor bouw (een) en na bouw (b). (c) Schematische illustratie van de elektrochemische reactor na 25 h van elektrochemische inoculatie bij +0.4 V vs ze. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger van de huidige productie van S. oneidensis heer-1 tijdens de vorming van de biofilm enkelgelaagde op een elektrode ITO. Een pijl geeft aan dat de tijd van de toevoeging van de celsuspensie in de elektrochemische reactor. De dezelfde tendens werd gereproduceerd in ten minste vijf afzonderlijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vervanging van het supernatans dat aan verse beschreven medium (DM) met 10 mM lactaat. (een) stikstofgas stroom boven het vloeistofoppervlak. (b) verwijdering van het supernatans van de elektrochemische reactor. (c) toevoeging van 4,0 mL verse DM bevattende 10 mM lactaat. Na de middellange toevoeging, moet de reactor worden schuin om te verwijderen van het supernatans dat is gekoppeld aan de muur van de reactor. Uitvoeren van deze procedure (een-c) drie keer in totaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Effect van D2O aanvulling op de huidige productie van een biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1. Tijd ten opzichte van de huidige productie voor een enkelgelaagde biofilm van S. oneidensis heer-1 in een elektrochemische systeem met 10 mM lactaat, (een), een extra 100 µM Anthrachinon-1-sulfonaat (α- AQS) (b), of een extra 2 µM Flavin mononucleotide (FMN) (c). De dezelfde tendens werd gereproduceerd in ten minste vier afzonderlijke experimenten. De pijlen geven de tijd van de toevoeging van D2O (vaste lijn) of H2O (gestippelde lijn). De gegevens overeenstemmen met de stippellijn waren genormaliseerd naar het gegevenspunt net voordat het prestatiemeteritembestand van D2O in de ononderbroken lijn gegevens. De concentratie van D2O in de elektrochemische reactor wordt aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: beoordeling van de tarief-bepalende stap in de huidige productie van een biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 door toevoeging van flavins. Tijd ten opzichte van de huidige productie van een biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 in aanwezigheid van 0.1 mM lactaat (stippellijn), 10 mM lactaat (vaste lijn) en 1,0 mM lactaat (gestippelde lijn). Een pijl geeft aan dat het punt van de tijd op welke 1 µM flavine mononucleotide (FMN) is toegevoegd in de elektrochemische reactoren. In aanwezigheid van 10 mM lactaat, de toevoeging van FMN drastisch toegenomen de huidige productie, waaruit blijkt dat de extracellulaire elektronentransport (EET) t/m c-Typ cytochroom complexen ingebed in de bacteriële buitenmembraan (OM c - Cyts) is het tarief-bepalen. Minder lactaat concentratie in de elektrochemische reactor veroorzaakt een kleinere huidige verbetering door FMN toevoeging, waaruit blijkt dat de levering van het elektron uit de upstream metabole reacties op OM c- Cyts werd geleidelijk lager is dan de snelheid van EET. De dezelfde tendens werd gereproduceerd in ten minste twee afzonderlijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze geheel-cel elektrochemische bepaling heeft een aantal technische voordelen vergeleken met eiwit elektrochemie. Hoewel eiwitreiniging vereist de multi-step tijdrovende procedures, neemt onze geheel-cell, methode een dag van zelf-georganiseerde biofilm vorming na celkweek. Om te bereiken van een stabiele interactie tussen OM c- Cyts en de elektrode, moeten we alleen sterilisatie en reiniging van het oppervlak van de elektrode; het vereist geen wijziging van de elektrode voor het organiseren van de richting van eiwitten4, bijvoorbeeld, oneidensis S. MIJNHEER-1 intrinsiek hecht op de elektrode, terwijl het oriënteren van de OM- c- Cyts in de zelfde richting25 , 26 , 27. de elektrochemische reacties van eiwitten zijn daarentegen gevoelig getroffen door de afstand tussen de redox sites in het eiwit en de elektrode; de gezuiverde eiwitten moeten dus zorgvuldig georiënteerde28,29. Nog belangrijker, de elektrochemische bepaling van geheel-cel rechtstreeks kenmerkt OM c- Cyts complexen ingebed in een lipide membraan met mogelijke interacties met andere membraaneiwitten en zo weerspiegelt de inheemse proton beheer in de OM c - Cyts (dit is vaak moeilijk te imiteren met behulp van gezuiverde eiwitten).
Onze techniek heeft echter een beperking met betrekking tot de concentratie van D2O. hoge concentraties van D2O potentieel vertragen van metabole processen en groei19; we experimenten daarom met D2O concentraties die minder dan 4% (v/v) in dit protocol waren. Bovendien, omdat genexpressie in microben in een ingewikkelde manier is gereglementeerd, kleine voorwaardelijke verschillen misschien sterk van invloed op de microbiële fenotype en zelfs het elektronentransport kinetiek. In het bijzonder vermindert de lactaat concentratie tijdens de huidige productie van de S. oneidensis heer-1 biofilm; Daarom is het belangrijk te voeren van de experimenten KIE voordat de snelheidslimieten proces naar upstream metabole reacties verschuift.
Het meest kritieke punt om met succes de KIE is gepreciseerd en bevestigd de conditie waarin het elektron vervoer via OM c- Cyts grenzen het percentage van de huidige productie gecontroleerd door de elektrochemische bepaling van geheel-cel. In dit protocol uitleggen we hoe om te bevestigen dat het tempo van de EET beperkt en de microbiële huidige productie weerspiegelt. We introduceerden een combinatie van twee methoden; observatie van de huidige wijziging door flavin toevoeging23en D2O toevoeging in de aanwezigheid van een diffusing elektron bemiddelaar, bijvoorbeeld, α-AQS15 (Figuur 4 en Figuur 5). Als men niet kan maken de EET verwerken snelheidslimieten, is de meest waarschijnlijke reden zou onvolledig vorming of fysieke detachement enkelgelaagde biofilm, of besmetting door andere microben. Het is raadzaam de vorming van de biofilm enkelgelaagde bevestigen door het scannen van elektronenmicroscopie of confocale microscopie. Het is zeer mogelijk dat de middellange vervanging proces schadelijk is voor de biofilm; Daarom, de verwijdering en de injectie van het medium moeten langzaam worden uitgevoerd en stikstofgas moet stromen boven het vloeistofoppervlak (Figuur 3). Als een uniforme enkelgelaagde biofilm maakt niet de EET verwerken snelheidslimieten, is het beste te bestuderen de middellange onderdelen en de meetomstandigheden, bijvoorbeeldsuppletie van lactaat met een hogere concentratie dan 10 mM, voor verdere versnelling van upstream metabolische processen. Deze overwegingen zijn ook belangrijk in andere soorten EET-staat microben. Elektron bemiddelaars kunnen specifiek worden gebruikt om te bevestigen dat het proces van de EET-snelheidslimieten in andere soorten EET-staat microben met inbegrip van mengsels van bacteriestammen; Dus, wij beschouwen dit protocol als een algemene methode te onderzoeken van de kinetische effecten van protonen op directe elektronentransport op het raakvlak van bacteriën/elektrode. Gezien het feit dat EET wordt waargenomen in andere microbiële stammen en -consortia, in zover het EET-proces snelheidslimieten is-, is dit protocol van toepassing op het bestuderen van de microbiële ademhaling in anaërobe ijzer corrosie en methaan-oxidatie processen alsmede die in microbiële brandstof cellen30,31.
Ons systeem van S. oneidensis heer-1 enkelgelaagde biofilm met de snelheidslimieten proces van EET via OM c- Cyts kan worden niet alleen gebruikt voor de KIE experimenten maar ook voor de Biochemische karakterisering van OM c- Cyts. Bijvoorbeeld, de toevoeging van verschillende concentraties van flavins die zich als cofactoren tot OM c binden- Cyts zou toestaan de elektrochemische kwantificering van de dissociatieconstante (Kd ~ 10 µM) voor de vorming van flavin-gebonden OM c- Cyts complexen32,33,34. Bovendien ons recente werk aangetoond dat het omgekeerde elektron terugvoer proces via OM c- Cyts kon worden gekenmerkt door middel van kathodische huidige productie33,34. Er wordt geopperd dat de terugvoer van het elektron geassocieerd met proton importeren via de OM als een bron voor chemiosmotic ATP synthese35 wordt; Daarom is het van groot belang voor het onderzoeken van het effect van protonen op de kinetiek van de Terugvloeiing elektron in OM c- Cyts.
Kortom, ontwikkelde we technieken om te onderzoeken het deuterium KIE op het EET OM c- Cyts met behulp van S. oneidensis heer-1 leven. De techniek kan worden gebruikt voor de karakterisering van OM c- Cyts evenals KIE waarneming, en het geldt potentieel voor andere electrogenic microben. Wij zijn van mening dat deze methode kan een algemene techniek te onderzoeken de EET direct via OM c- Cyts in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door een Grant-in-Aid voor speciaal bevorderd onderzoek van de vereniging van Japan voor promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI Grant nummer 24000010, 17H 04969, en JP17J02602, de ons kantoor van Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. is een JSPS Research Fellow en ondersteund door JSPS via het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (MERIT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
