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Biochemistry

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584

Summary

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

Directa detección electroquímica de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complejos citocromo; OM c- Cyts) recientemente ha surgido como un método de análisis de celulares nuevos para caracterizar el transporte de electrones bacteriano de la cadena respiratoria al exterior de la célula, conocido como el transporte de electrones extracelular (EET). Mientras que la vía y cinética del flujo del electrón durante la reacción de EET se han investigado, un método electroquímico de la célula entera para examinar el impacto del transporte de cationes asociado con EET todavía no se ha establecido. En el presente estudio, se describe un ejemplo de una técnica bioquímica para examinar el efecto de cinética isótopos de deuterio (KIE) sobre EET mediante OM c- Cyts usando un microbio modelo, Shewanella oneidensis MR-1. El KIE en el proceso EET puede obtenerse si la OTA a través de OM c- Cyts actúa como el paso tarifa-limitador en la actual producción microbiana. Para ello, antes de la adición de D2O, la solución sobrenadante fue reemplazada con medio fresco que contiene una cantidad suficiente de la donante del electrón para apoyar la tasa de reacciones metabólicas por aguas arriba y para eliminar las células planctónicas de un uniforme monocapa biofilm en el electrodo de trabajo. Métodos alternativos para confirmar la limitación de velocidad se paso en actual producción microbiana como EET mediante OM c- Cyts también se describen. Nuestra técnica de un análisis electroquímico de células completas para investigar la cinética del transporte de protones se puede aplicar a otras cepas microbianas electroactivos.

Introduction

Recientemente han surgido técnicas electroquímicas para caracterizar directamente una proteína redox en una célula bacteriana intacta desde el descubrimiento del metal reduciendo las cepas microbianas, como Geobacter sulfurreducens PCA, S. oneidensis MR-1 que tienen complejos de citocromo tipo c de membrana externa (OM c-Cyts) expuestos a la célula exterior1,2,3,4,5. El OM c- Cyts mediar transporte de electrones de la cadena respiratoria a sustratos sólidos situados extracelularmente. Este transporte se denomina transporte de electrones extracelular (EET)1,6 y es un proceso crítico para las biotecnologías emergentes, tales como las células de combustible microbianas6. Por lo tanto, para comprender la cinética subyacente de EET y mecanismos y su relación con la fisiología microbiana, OM c -Cyts han investigado usando celulares electroquímica4,7, combinado con microscopía 8 , 9, espectroscopia10,11y biología molecular2,4. En contraste, los métodos para investigar el impacto del transporte de cationes asociados de EET, por ejemplo, protones, en la cinética de la EET en las células vivas apenas establecidos, a pesar de transporte de protones a través de las membranas bacterianas tienen un papel fundamental señalización, homeostasis y energía producción12,13,14. En el presente estudio, describimos una técnica para examinar el impacto del transporte de protones en la cinética de la EET en la S. oneidensis MR-1 célula usando células completas medidas electroquímicas, que requiere la identificación del paso tarifa-limitador en la microbiana de producción actual15.

Una forma directa de evaluar la contribución del transporte de protones en la OTA asociada es efecto cinético del isótopo deuterio (KIE). El KIE es observable como el cambio en la cinética de transferencia de electrones sobre el reemplazo de protones con los iones de deuterio, que representa el impacto del transporte del protón en electrón transferencia cinética16. La teoría de KIE sí mismo se ha establecido bien con medidas electroquímicas de enzimas purificadas17. Sin embargo, ya que la producción actual en S. oneidensis MR-1 resultado de múltiples procesos diversos y fluctuantes18, uno no puede simplemente identificar EET como el proceso de limitación de velocidad. Para observar el KIE en procesos de transporte de protones junto con EET, tenemos que confirmar que la actual producción microbiana está limitada por el transporte de electrones a través de OM c- Cyts al electrodo. Para ello, sustituimos la solución sobrenadante con medio fresco que contiene una alta concentración de lactato como un donante del electrón en el pH óptimo y la temperatura antes de la medición de KIE; este reemplazo sirve dos funciones: (1) mejora la tasa de los procesos metabólicos por aguas arriba en comparación con la OTA y (2) omite las células de la natación en el sobrenadante del monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 en el (electrodo de trabajo electrodos de óxido de estaño dopado (ITO) de indio). El protocolo detallado presentado pretende ayudar a los nuevos profesionales mantener y confirmar que el proceso EET es la etapa de determinación de tasa.

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Protocol

1. formación de una monocapa de Biofilm de S. oneidensis MR-1 en un electrodo ITO (figura 1)

Nota: Para evitar la contaminación del reactor electroquímico con otros microbios, todos los medios, instrumentos y componentes del reactor electroquímico deben esterilizarse previamente. Cuando utilizando células de S. oneidensis MR-1 y la construcción de los reactores electroquímicos, todos los procedimientos deben realizarse en una mesa de trabajo limpia.

  1. Cultivo de células de S. oneidensis MR-1
    Nota: Un monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 se constituyó en un ITO electrodo siguiendo las condiciones anteriormente registrados4.
    1. Para hacer crecer células de S. oneidensis MR-1, agregar una colonia de S. oneidensis MR-1 cultivadas en una placa de agar que Luria-Bertani (LB) (20 g/L) y bacto agar (15 g/L) en 15 mL de medio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h en condiciones aeróbicas con agitación a 160 rpm.
    2. Centrifugue la suspensión de células en 6.000 × g por 10 min y resuspender el precipitado celular resultante en 15 mL de medio definido (pH 7.8) (DM: NaHCO3 [2, 5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] y 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido [HEPES; 7,2 g/L]), suplementado con lactato de 10 mM y 0,5 g/L Extracto de levadura como fuente de carbono y oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.
    3. Además cultivar la suspensión celular aeróbica a 30 ° C por 12 h con agitación a 160 rpm y centrifugar nuevamente a 6.000 × g por 10 minutos lavar el precipitado de células resultante dos veces con medio de DM por centrifugación durante 10 minutos a 6.000 × g antes de la electroquímica experimento.
  2. Construcción de un reactor electroquímico de tres electrodos (figura 1)
    1. Poner un sustrato ITO como el electrodo de trabajo en la parte inferior del reactor.
    2. Posteriormente, coloque un cilindro de vidrio (diámetro de 2 cm) y una cubierta de politetrafluoroetileno (PTFE). Luego inserte (KCl saturado) de Ag/AgCl y un alambre de platino en el reactor como los electrodos de referencia y contador, respectivamente.
      Nota: Para evitar la fuga de aire y solución, inserte una hoja de goma de butilo entre cada componente.
    3. Añadir 4,0 mL de MS suplementados con lactato de 10 mM y extracto de levadura 0.5 g/L en el reactor electroquímico.
    4. Después de confirmar que no hay ninguna salida desde el reactor electroquímico, flujo del gas del nitrógeno en el reactor electroquímico durante 20 min para mantener condiciones anaeróbicas en el reactor electroquímico.
      Nota: Para evitar la contaminación con otros microbios, el gas debe filtrarse antes de que fluya en el reactor electroquímico.
    5. Conectar el reactor electroquímico con un potenciostato y aplicar +0.4 V (versus electrodo de hidrógeno estándar, ella) al electrodo ITO, manteniendo la temperatura del reactor electroquímico a 30 ° C mediante un sistema de circulación de agua exterior.
      Nota: Para evitar el efecto de un campo eléctrico externo, el reactor electroquímico debe colocarse en una jaula de Faraday.
  3. Cultivo electroquímico de S. oneidensis MR-1 células (figura 1 y figura 2)
    1. Ajustar la densidad celular de la suspensión obtenida en el paso 1.1 a una densidad óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) con DM complementado por levadura de lactato y 0,5 g/L de 10 mM del extracto.
      Nota: Para obtener el correcto OD600, aplicar la suspensión de OD600 ≤ 0,8 a un espectrómetro de UV-vis antes de ajustar el OD600 a 1,43.
    2. Agregar 0,3 mL de la suspensión de células en el reactor electroquímico a través del puerto de inyección con una jeringa: OD600 en el reactor cambia a 0.1.
      Nota: La adición de la suspensión celular de 0.3 mL con OD600 = 1,43 en el reactor electroquímico que contiene 4,0 mL resultado medio en 4,3 mL de solución con un OD600 = 0.1. Cuando utilice otros reactores con volúmenes distintos, el cálculo de la densidad celular se requiere.
    3. Continuar la aplicación en +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO para 25 h.
      Nota: Para la formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO, asegúrese de que la corriente producida exhibe una desviación inferior al 50% de la figura 2.

2. reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato (figura 3)

  1. Detener la aplicación potencial y desconectar el reactor electroquímico el potenciostato y el sistema de circulación de agua.
  2. Reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato
    1. Flujo de nitrógeno gas en un frasco que contenga DM con lactato de 10 mM más de 20 minutos para quitar el oxígeno del medio.
    2. Lentamente Quite todo el sobrenadante dentro el reactor electroquímico utilizando una jeringa, en que fluye el gas del nitrógeno (figura 3a, b).
      Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO por el gas del nitrógeno, el gas debe fluir sobre la superficie del líquido.
    3. Añadir 4,0 mL de MS dulce que contiene lactato de 10 mM utilizando una jeringa (Figura 3C).
      Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO, inyecte lentamente el medio a lo largo de la pared del reactor electroquímico. Para mantener la biopelícula húmeda, se debe agregar el medio inmediatamente después de la eliminación del sobrenadante. Inyección de la media hasta 1 min después de la eliminación del sobrenadante no afecte la producción actual de biofilm de S. oneidensis MR-1.
    4. Incline el reactor electroquímico para quitar todo el sobrenadante fijado a la pared del reactor electroquímico.
    5. Repita los pasos 2.2.2-2.2.4 tres veces en total.
  3. Detener el flujo de gas y conectar el reactor electroquímico para el potenciostato, aplicando +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO a 303 K.

3. adición de deuterio agua para medir el KIE en el proceso EET (figura 4)

  1. Confirman que la producción actual de una monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1 es estable y no aumenta rápidamente. Si la corriente aumenta abruptamente, espere hasta que la corriente se estabiliza dentro de un aumento de 5% durante 10 minutos.
    Nota: La formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO sin contaminación de otras cepas microbianas fue confirmada por secuencias del rDNA y una escaneo imagen microscópica electrónica de la biopelícula en un electrodo ITO, como se informó anteriormente4. Para la confirmación de la limitación de la tasa por el proceso EET, monitorear el efecto de la adición de mover electrones mediadores como 100 μm antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Ver la sección de Resultados de representante y de referencia15 para más detalles.
  2. Agregar 40 μl de anoxia 50% (v/v) D2O en el reactor electroquímico utilizando una jeringa de tal manera que la concentración es de 0.5% (v/v) D2O en el reactor.
    Nota: Para evitar daños en el biofilm por la adición de2O de D, inyectar D2O mediante goteo.
  3. Espera para que estabilizar la corriente y posteriormente añadir el D2O hasta un 4.0% (v/v).
    Nota: Para obtener el valor KIE (el ratio de producción actual en presencia D2O y H2O), verificar el efecto del mismo volumen de adición de H2O en la producción actual.

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Representative Results

Después de 25 h de potencial aplicación en +0.4 V (contra ella), se formó una biopelícula de monocapa en el electrodo de trabajo de vidrio de ITO, que previamente fue confirmado por una microscopía electrónica o la microscopia confocal4. El curso del tiempo representativo de la producción actual de la S. oneidensis MR-1 durante la formación de una biopelícula de monocapa se muestra en la figura 2. Aunque la corriente altera en cada medición, la corriente producida no exhibe una desviación de más del 50% del valor en la figura 2 si uniformemente se forma un biofilm de monocapa.

Después del reemplazo del sobrenadante con DM fresco con lactato de 10 mM para maximizar la tasa de los procesos metabólicos y lavar la monocapa de biopelícula (figura 3), puede observarse una corriente anódica estable (aproximadamente 5% aumento en 10 minutos) bajo +0.4 V (en lugar de ella ) aplicación (figura 4a). Si la corriente anódica aumenta abruptamente, espere hasta que la corriente se estabiliza. Es muy posible que los procedimientos para el reemplazo de sobrenadante que se describe en la sección 2, pueden dañar el biofilm y reconstrucción puede ocurrir.

La línea sólida en la figura 4a es el resultado representativo para el cambio actual microbiano inducido por la adición de2O de D. La adición de 1,0% (v/v) D2O disminuyó bruscamente la corriente microbiana dentro de 10 s, mientras que casi ninguna disminución actual fue observada por la adición de H2O (línea punteada en la figura 4a)15. La misma tendencia se reprodujo en al menos cuatro experimentos separados. La adición secuencial de D2O en concentraciones finales que van desde la supresión fuerte de 0.5% a 2.0% (v/v) claramente expuesta en la actual producción (figura 4a)15. Porque la producción microbiana actual gradualmente recuperado probablemente debido al efecto fisiológico19,20, KIE debe asignarse a la disminución de la corriente poco después de la adición de D2O. En un informe anterior, recogimos la producción actual en aproximadamente 10 minutos después de la adición de D2O para calcular el valor de KIE15.

Utilizando dos métodos, se confirmó que la disminución actual observada por la adición de2O de D es atribuible a KIE en la EET a través del OM c- Cyts complejo. En primer lugar, hemos añadido 1 riboflavina μm (RF) o fosfato de lactoflavina (FMN) en el reactor electroquímico antes y después de la adición de2O de D, que se puede utilizar para el estudio de EET en S. oneidensis MR-1. En el caso de S. oneidensis MR-1, flavins específicamente aceleran la EET atando con OM c- Cyts en unos pocos segundos, porque los flavins funcionan como no-covalente cofactores21,22, 23. por lo tanto, un aumento de corriente anódico instantáneo además de flavin indica limitación de tasa por el proceso de EET mediante OM c- Cyts (figura 5). Además se confirmó el efecto de trasladar mediadores electrón en KIE. Redox pequeñas moléculas, por ejemplo, antraquinona-1-sulfonato (α-AQS), terminar el proceso EET por difusión de la cadena microbiana del transporte del electrón al electrodo, en lugar de transporte directo de electrones vía OM c- Cyts15 , 24. aquí, la adición de 100 μm de α-AQS mejorada la producción actual por más de 5 veces (Figura 4b), que indica que la cinética de las reacciones metabólicas son lo suficientemente rápido como para hacer la OTA el paso de limitación de velocidad de proceso. Constantemente, la producción actual mediada por α-AQS seguía siendo inafectada por D2O adición (Figura 4b), demostrando que el retraso potencial en reacciones metabólicas por D2O no hace el KIE grande observado en figura 4a .

La combinación de estos dos enfoques para observar el KIE en el transporte de electrones a OM c- Cyts es el punto crítico de este informe, y concretamente, realizar trayectos mediadores de electrones pueden ser aplicable a otros biofilms electroactivos. Además, una vez que confirmamos que el cambio actual está asignado al proceso de EET, podríamos evaluar el efecto de un mutante de eliminación parcial de OM c- Cyts o de una flavina asociado a OM c- Cyts en protón transferencia cinética comparando el KIE en ambos casos15. Cuando se agregó D2O en presencia de la FMN con OM c- Cyts, la disminución de la corriente fue reducida, que era más pequeño que sin FMN, indicando que el enlace de FMN altera la vía de transporte de protones y su cinética (figura 4 c)15.

Figure 1
Figura 1: reactor electroquímico utilizado en este estudio. Fotografía de la celda electroquímica (un) antes y después de la construcción (b). (c) Ilustración esquemática del reactor electroquímico después de 25 h de inoculación electroquímica en +0.4 V vs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: producción actual representante de S. oneidensis MR-1 durante la formación de biofilm de monocapa sobre un electrodo ITO. Una flecha indica el momento de la adición de la suspensión de células en el reactor electroquímico. La misma tendencia se reprodujo en por lo menos cinco experimentos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: reemplazo del sobrenadante a medio fresco definido (DM) con lactato de 10 mM. (a) nitrógeno flujo sobre la superficie del líquido. (b) eliminación del sobrenadante del reactor electroquímico. (c) adición de 4,0 mL fresco DM que contiene lactato de 10 mM. Después de añadir el medio, el reactor debe ser inclinado para retirar el sobrenadante fijado a la pared del reactor. Llevar a cabo estos procedimiento (unac) tres veces en total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Efecto de adición de2O de D en la producción actual de una monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1. Tiempo versus producción actual por un monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1 en un sistema electroquímico que contiene 10 mM lactato (un), un antraquinona adicional 100 μm-1-sulfonato (α- AQS) (b), o un adicional de 2 μm fosfato de lactoflavina (FMN) (c). La misma tendencia se reprodujo en al menos cuatro experimentos individuales. Las flechas indican el momento de la adición de D2O (línea sólida) o H2O (línea punteada). Se normalizaron los datos correspondientes a la línea de puntos hasta el punto de datos justo antes de la adición de D2O en los datos de línea sólida. Se indica la concentración de D2O en el reactor electroquímico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: evaluación de la determinación de la tasa de paso en la producción actual de un monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 por la adición del flavins. Tiempo versus la producción actual de una monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1 en presencia de lactato de 10 mM (línea sólida), lactato de 1,0 mM (línea discontinua) y lactato de 0,1 mM (línea punteada). Una flecha indica el momento en que 1 μm fosfato de lactoflavina (FMN) fue agregado en los reactores electroquímicos. En presencia de lactato de 10 mM, la adición de FMN aumentado drástico la producción actual, demostrando que el transporte de electrones extracelular (EET) a través de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (OM c - Cyts) es determinar la tasa. Menos lactato la concentración en el reactor electroquímico causado una mejora actual más pequeño por la adición de la FMN, que indica que la fuente de electrones de las reacciones metabólicas por aguas arriba a OM c- Cyts gradualmente llegó a ser más lento que la tasa EET. La misma tendencia se reprodujo en al menos dos experimentos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Nuestro análisis electroquímico de células completas tiene varias ventajas técnicas en comparación con electroquímica de proteína. Mientras que la purificación de proteínas requiere varios pasos lentos procedimientos, nuestro método de celulares toma un día de formación del biofilm auto-organizada después de cultivo celular. Para lograr una interacción estable entre OM c- Cyts y el electrodo, necesitamos sólo la esterilización y limpieza de la superficie del electrodo; no requiere modificación de electrodo para organizar la orientación de proteínas4, p. ej., S. oneidensis MR-1 intrínsecamente se fija sobre el electrodo, mientras orientando el OM c- Cyts en la misma dirección25 , 26 , 27. en contraste, las reacciones electroquímicas de proteínas sensiblemente afectadas por la distancia entre sitios redox de la proteína y el electrodo; así, las proteínas purificadas deben ser cuidadosamente orientados28,29. Más importante aún, el ensayo electroquímico de células enteras directamente caracteriza complejos de - Cyts cOM embebidos en una membrana lipídica con posibles interacciones con otras proteínas de membrana y así refleja el protón nativo gestión OM c - Cyts (esto es a menudo difícil de imitar con proteínas purificadas).

Sin embargo, la técnica tiene una limitación con respecto a la concentración de D2O. alta concentraciones de D2O potencialmente ralentizar los procesos metabólicos y de crecimiento19; por lo tanto, llevamos a cabo los experimentos utilizando D2O concentraciones que fueron menos del 4% (v/v) en el presente Protocolo. Además, porque la expresión de genes en microbios se regula de manera compleja, pequeñas diferencias condicionales podrían afectar fuertemente el fenotipo microbiano e incluso la cinética del transporte de electrones. En particular, disminuye la concentración de lactato durante la actual producción de biofilm S. oneidensis MR-1; por lo tanto, es importante llevar a cabo los experimentos KIE antes de que el proceso de limitación de velocidad cambia a reacciones metabólicas por aguas arriba.

El punto más crítico para obtener con éxito el KIE es aclarar y confirmar la condición en que el electrón transporte a través de OM c- Cyts límites de la tasa de producción actual por el ensayo electroquímico de células completas. En este protocolo, explicamos cómo confirmar que la tasa de la EET limita y refleja la actual producción microbiana. Hemos introducido una combinación de dos métodos; observación del cambio actual por flavin además23y D2O adición en presencia de un difusión electrónica mediador, por ejemplo, α-AQS15 (figura 4 y figura 5). Si uno no puede hacer la OTA proceso de limitación de velocidad, la razón más probable sería la formación incompleta o la separación física del biofilm de monocapa o contaminación por otros microbios. Recomendamos confirmar la formación de la biopelícula de la monocapa mediante la exploración de la microscopia electrónica o microscopía confocal. Es muy posible que el proceso de reemplazo medio daña la biopelícula; por lo tanto, la extracción y la inyección del medio deben realizarse lentamente y nitrógeno debe fluir sobre la superficie del líquido (figura 3). Si un biofilm monocapa uniforme no hace la OTA proceso de limitación de velocidad, es mejor volver a examinar los componentes medio y condiciones de medición, por ejemplo, el suplemento de lactato en una concentración mayor de 10 mM, para la aceleración de más de procesos metabólicos por aguas arriba. Estas consideraciones también son importantes otros tipos de microbios capaces de EET. Mediadores de electrón pueden utilizarse específicamente para confirmar que el proceso EET es tarifa-limitación en otros tipos de microbios capaces de EET incluidas las mezclas de cepas bacterianas; por lo tanto, consideramos este protocolo como un método general para investigar el impacto cinético de protones en transporte directo de electrones en la interfase electrodo/bacterias. Teniendo en cuenta que la EET se observa en otras cepas microbianas y consorcios, como el proceso EET es tarifa-limitación, este protocolo es aplicable para el estudio de la respiración microbiana en los procesos de oxidación del metano y corrosión anaerobia del hierro, así como en las células de combustible microbiana30,31.

Nuestro sistema de biofilm de S. oneidensis MR-1 monocapa con el proceso de limitación de velocidad de EET mediante OM c- Cyts puede utilizarse no sólo para los experimentos KIE sino también para la caracterización bioquímica de OM c- Cyts. Por ejemplo, la adición de diferentes concentraciones de flavinas que se unen como cofactores a OM c- Cyts permitiría la cuantificación electroquímica de la constante de disociación (Kd ~ 10 μm) para la formación de flavin-limite OM c- Cyts complejos32,33,34. Además, nuestro trabajo reciente demostró que el proceso de expulsión electrónica inversa mediante OM c- Cyts podría ser caracterizado a través de la producción corriente catódica33,34. Se ha propuesto que el reflujo del electrón se asocia con importación de protones a través de la OM como fuente para la síntesis de ATP35de quimioautótrofos; por lo tanto, es de gran interés para examinar el impacto de los protones sobre la cinética de expulsión de electrones en OM c- Cyts.

En conclusión, hemos desarrollado técnicas para examinar el deuterio KIE en la EET a través de OM c- Cyts mediante viven S. oneidensis MR-1. La técnica puede ser usada para la caracterización de OM c- Cyts así como observación de KIE y es potencialmente aplicable a otros microbios electrógenos. Creemos que esta metodología puede ser una técnica general para investigar la OTA directamente a través de OM c- Cyts en vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado financieramente por un subvenciones de investigación promovido especialmente de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI número de concesión 24000010, 17H 04969 y JP17J02602, el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038). Y.T. es un investigador de JSP y apoyado por JSP a través del programa escuelas de graduados principales (mérito).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

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References

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Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la <em>Shewanella oneidensis</em> MR-1
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Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

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