Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Elektrokjemiske gjenkjenning av Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektronet Transport Shewanella oneidensis MR-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

Summary

Her presenterer vi en protokoll hele celle elektrokjemiske eksperimenter å studere bidrag av proton transport til frekvensen av ekstracellulære elektronet transport via de ytre membran cytochromes i Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

Direkte elektrokjemiske påvisning av c-type cytochrome komplekser innebygd i den bakterielle ytre membranen (ytre membran c-skriver cytochrome komplekser; OM c- Cyts) har nylig dukket opp som en roman hele celle analysemetode å karakterisere den bakterielle elektronet transporten fra åndedretts kjeden på cellen utsiden, referert til som den ekstracellulære elektronet transporten (lunsj). Mens den veien og kinetics elektron flyt under Fornying reaksjonen er gransket, har hele celler elektrokjemiske metode å undersøke virkningen av cation transport tilknyttet EET ennå ikke blitt fastsatt. Studien, et eksempel på en biokjemisk teknikk for å undersøke deuterium kinetic isotop effekten (KIE) på EET gjennom OM c- Cyts bruker en modell mikrobe, Shewanella oneidensis MR-1, er beskrevet. KIE på EET prosessen kan oppnås hvis EET gjennom OM c- Cyts fungerer som hastighetsbegrensning trinn i mikrobiell gjeldende produksjon. For dette formål, før en D2O, ble den supernatant løsningen erstattet med friske mediet som inneholder en tilstrekkelig mengde elektron donor støtte frekvensen av oppstrøms metabolske reaksjoner og fjerne planktoniske celler fra en uniform monolayer biofilm på arbeider elektroden. Alternative metoder for å bekrefte hastighetsbegrensningen trinn i mikrobiell gjeldende produksjon som EET gjennom OM c- Cyts er også beskrevet. Våre teknikken av en hel celle elektrokjemiske analysen for å undersøke proton transport kinetics kan brukes på andre electroactive mikrobiell stammer.

Introduction

Elektrokjemiske teknikker som direkte kjennetegner en redoks protein i en intakt bakteriell celle har nylig dukket opp siden oppdagelsen av metall-reduserende mikrobiell belastninger, S. oneidensis MR-1 eller Geobacter sulfurreducens PCA, som har ytre membran c-type cytochrome komplekser (OM c-Cyts) utsatt for cellen utvendig1,2,3,4,5. OM c- Cyts formidle elektronet transport fra åndedretts kjeden til fast underlag ligger extracellularly. Denne transporten kalles ekstracellulære elektronet transport (lunsj)1,6 og er en kritisk prosess for nye bioteknologi, for eksempel mikrobielle brenselceller6. Derfor, for å forstå de underliggende EET kinetics og mekanismer, og koblingen til mikrobiell fysiologi, OM c -Cyts er gransket bruker hele-celle elektrokjemi4,7, kombinert med mikroskopi 8 , 9, spektroskopi10,11og molekylærbiologi2,4. I kontrast er metoder for å undersøke virkningen av lunsj-assosiert kasjon transport, f.eks protoner, på EET kinetics i levende celler neppe etablert, til tross for proton transport over bakteriell membraner har en avgjørende rolle i signalering, homeostase og energi produksjon12,13,14. I denne studien, vi beskriver en teknikk for å undersøke virkningen av proton transport EET kinetics i S. oneidensis MR-1 cellen med hele celle elektrokjemiske mål, som krever identifikasjonen av trinnet hastighetsbegrensning i mikrobiell gjeldende produksjon15.

En direkte måte å vurdere bidrag av proton transport på den tilknyttede EET er deuterium kinetic isotop effekten (KIE). KIE er som endring i elektron overføring kinetics ved utskifting av protoner med deuterium ioner, som representerer virkningen av proton transport elektron overføring kinetics16. Teorien om KIE selv er godt etablert elektrokjemiske målinger med renset enzymer17. Men siden gjeldende produksjon i S. oneidensis MR-1 resultater fra flere forskjellige, og varierende18, kan ikke en bare identifisere EET som hastighetsbegrensning prosessen. For å observere KIE på proton transport prosesser kombinert med lunsj, må vi bekrefte at mikrobielle gjeldende produksjon er begrenset av elektronet transport via OM c- Cyts til elektroden. For dette formålet erstattet vi den supernatant løsningen med frisk medium som inneholder en høy konsentrasjon av laktat som et elektron donor optimal pH og temperaturforhold før KIE måling; Dette erstatning servert to roller: (1) det forbedret frekvensen av oppstrøms metabolske prosesser sammenlignet Fornying, og (2) utelatt svømming cellene i nedbryting fra monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 på arbeider elektrode ( Indium tin-dopet oksid (ITO) elektroden). Presenteres detaljert protokollen er ment å hjelpe nye utøvere opprettholde og bekrefte at EET prosessen er rente-bestemme skritt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dannelsen av en Monolayer Biofilm S. oneidensis MR-1 på en ITO elektrode (figur 1)

Merk: For å hindre forurensning av elektrokjemiske reaktoren med andre mikrober, alle medier, redskaper, og komponentene i elektrokjemiske reaktoren skal steriliseres på forhånd. Når benytter S. oneidensis MR-1 celler og konstruere de elektrokjemiske reaktorene, alle prosedyrer bør gjennomføres på en ren benk.

  1. Dyrking av S. oneidensis MR-1 celler
    Merk: En monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 ble dannet en ITO elektrode etter forholdene rapporterte tidligere4.
    1. For å vokse S. oneidensis MR-1 celler, legger du til en koloni av S. oneidensis MR-1 dyrket på en agar plate bestående av Luria-Bertani (LB) (20 g/L) og bacto agar (15 g/L) til 15 mL LB medium (20 g/L) på 30 ° C i 24 timer i aerobe forhold med skjelvende på 160 rpm.
    2. Sentrifuge celle suspensjon 6000 × g på 10 min og resuspend den resulterende celle pellet i 15 mL av definerte medium (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0.2 g/L], NaCl [10 g/L], og 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic syre [HEPES; 7,2 finans]), supplert med 10 mM laktat og 0,5 finans gjærekstrakt som kilde til karbon, og sporstoffer for S. oneidensis MR-1 , henholdsvis.
    3. Videre dyrke celle suspensjon din aerobt på 30 ° C i 12 h med skjelvende på 160 rpm og sentrifuge igjen på 6000 × g 10 min. vaskes den resulterende celle pellet to ganger med DM medium med sentrifugering i 10 min 6000 × g før den elektrokjemiske eksperiment.
  2. Byggingen av en tre-elektrode elektrokjemiske reaktor (figur 1)
    1. Sette en ITO substrat som arbeider elektroden på bunnen av reaktoren.
    2. Deretter setter du inn en glass sylinder (diameter på 2 cm) og en polytetrafluoroethylene (PTFE) dekket. Deretter inn Ag/AgCl (KCl mettet) og en platina ledning reaktoren som referanse og telleren elektrodene, henholdsvis.
      Merk: For å forhindre lekkasje av luft og løsningen, setter du inn en butylgummi arket mellom hver komponent.
    3. Legg 4.0 mL DM supplert med 10 mM laktat og 0,5 finans gjærekstrakt til elektrokjemiske reaktor.
    4. Etter å ha bekreftet at det ikke er noen lekkasje fra elektrokjemiske reaktoren, flyte nitrogen gassen til elektrokjemiske reaktor over 20 min å opprettholde anaerob forhold innenfor elektrokjemiske reaktoren.
      Merk: For å hindre smitte med andre mikrober, gassen skal filtreres før den munner ut i elektrokjemiske reaktoren.
    5. Koble elektrokjemiske reaktoren til en potentiostat og bruke 0,4 V (versus standard hydrogen elektrode, hun) til ITO elektroden, holde temperaturen på elektrokjemiske reaktoren på 30 ° C ved hjelp av en ekstern vann sirkulasjonssystem.
      Merk: For å unngå effekten av en ekstern elektrisk felt, elektrokjemiske reaktoren plasseres i Faraday bur.
  3. Elektrokjemiske dyrking av S. oneidensis MR-1 celler (figur 1 og figur 2)
    1. Justere celle tettheten av suspensjon fikk i trinn 1.1 en optisk tetthet av 1,43 på 600 nm (OD600) med DM supplert med 10 mM laktat og 0,5 finans gjær pakke.
      Merk: For å få riktig OD600, gjelde celle suspensjon av OD600 ≤ 0,8 en UV-vis spectrometer før justering OD600 til 1,43.
    2. Sammenlegge 0,3 mL av cellen suspensjon i elektrokjemiske reaktoren gjennom injeksjon port bruker en sprøyte: OD600 i reaktoren endres til 0.1.
      Merk: Tillegg 0,3 mL celle hjuloppheng med OD600 = 1,43 i elektrokjemiske reaktoren inneholder 4.0 mL middels resultater i 4,3 mL løsning med et OD600 = 0.1. Når du bruker andre reaktorer med ulike volumer, er beregningen av cellen tetthet nødvendig.
    3. Fortsette programmet potensielle på 0,4 V (versus hun) til ITO elektroden 25 h.
      Merk: For dannelsen av en monolayer biofilm på en ITO elektrode, kontroller at produsert gjeldende viser en avvik mindre enn 50% fra figur 2.

2. erstatning av nedbryting med fersk DM Medium med 10 mM laktat (Figur 3)

  1. Stoppe programmet potensielle og koble elektrokjemiske reaktoren fra potentiostat og vann sirkulasjonssystem.
  2. Utskifting av nedbryting med fersk DM medium med 10 mM laktat
    1. Flyt gassen nitrogen i en flaske som inneholder DM med 10 mM laktat over 20 min fjerne oksygen fra mediet.
    2. Fjern sakte alle nedbryting inne elektrokjemiske reaktoren bruker en sprøyte, under strømmer nitrogen gass (figur 3a, b).
      Merk: For å unngå å bryte biofilm på ITO elektroden av nitrogen gass, gassen skal flyte over flytende overflaten.
    3. Legge til 4.0 mL frisk DM som inneholder 10 mM laktat bruker en sprøyte (Figur 3 c).
      Merk: For å unngå å bryte biofilm på ITO elektroden, sakte Injiser mediet langs elektrokjemiske reaktoren. For å holde biofilm våt, bør medium legges umiddelbart etter fjerning av nedbryting. Injeksjon av middels opptil 1 min etter fjerning av nedbryting påvirker ikke gjeldende produksjon fra biofilm S. oneidensis MR-1.
    4. Skråstill elektrokjemiske reaktoren for å fjerne alle nedbryting på vegg av elektrokjemiske reaktoren.
    5. Gjenta trinn 2.2.2-2.2.4 tre ganger i totalt.
  3. Stoppe gasstrømmen og koble elektrokjemiske reaktoren til potentiostat igjen, bruke 0,4 V (versus hun) på ITO elektroden på 303 K.

3. tillegg Deuterium vann å måle KIE på EET prosessen (Figur 4)

  1. Kontroller at gjeldende produksjon fra en monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 er stabil og ikke øker raskt. Hvis gjeldende øker bratt, vente til gjeldende stabiliserer innenfor en 5% økning over 10 min.
    Merk: Dannelsen av en monolayer biofilm på en ITO elektrode uten forurensning av andre mikrobiell stammer ble bekreftet av rDNA sekvenser og en skanning elektron mikroskopiske bilde av biofilm på en ITO elektrode, som rapportert tidligere4. For bekreftelse av rate begrensning av EET prosessen, overvåke effekten av å legge skytteltrafikk elektron meglere som 100 µM anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS). Se delen av Representant resultater og referanse15 for ytterligere detaljer.
  2. Legge til 40 µL av anoksisk 50% (v/v) D2O til elektrokjemiske reaktor bruker en sprøyte slik at konsentrasjonen er 0,5% (v/v) D2O i reaktoren.
    Merk: For å unngå skader på biofilm av D2O tillegg, injisere D2O drop-wise.
  3. Vent for gjeldende å stabilisere, og senere legger til D2O til 4,0% (v/v).
    Merk: For å få KIE verdien (forholdet mellom gjeldende produksjon i nærvær av D2O og H2O), se effekten av samme volum H2O tillegg på gjeldende produksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter 25 h potensielle programmet på 0,4 V (versus hun) dannet en monolayer biofilm på arbeider elektroden ITO glass, tidligere bekreftet av en skanning elektronmikroskop eller en AC confocal mikroskopi4. Representant gang løpet av gjeldende produksjon fra S. oneidensis MR-1 under dannelsen av en monolayer biofilm er vist i figur 2. Selv om gjeldende endrer hver måling, viser produsert gjeldende ikke et avvik over 50% fra verdien i figur 2 hvis en monolayer biofilm dannes jevnt.

Etter utskifting av nedbryting med fersk DM med 10 mM laktat å maksimere metabolske prosesser og vaske monolayer biofilm (Figur 3), kan en stabil anodic strøm (ca 5% økning i 10 min) observeres under 0,4 V (versus hun ) program (figur 4a). Hvis anodic gjeldende øker bratt, vente til gjeldende stabiliserer. Det er meget mulig at prosedyrene for supernatant erstatning beskrevet i avsnitt 2 kan skade biofilm og gjenoppbygging kan oppstå.

Den heltrukne linjen i figur 4a skyldes representant for mikrobiell gjeldende endring av D2O tillegg. I tillegg 1,0% (v/v) D2O kraftig redusert mikrobiell gjeldende innen 10 s, mens nesten ingen gjeldende nedgangen ble observert ved tilsetning av H2O (stiplet linje i figur 4a)15. Den samme tendensen var gjengitt i minst fire separate forsøk. Sekvensiell tillegg av D2O på siste konsentrasjonene varierer fra 0,5% til 2.0% (v/v) tydelig viste sterke undertrykkelse i gjeldende produksjon (figur 4a)15. Fordi mikrobiell gjeldende produksjon gradvis gjenopprettet sannsynlig grunn fysiologisk effekt19,20, skal KIE tilordnes til gjeldende nedgangen etter tillegg av D2O. I en tidligere rapport samlet vi gjeldende produksjon på ca 10 min etter at D2O beregne verdien av KIE15.

Bruker to metoder, bekreftet vi at observert gjeldende nedgangen av D2O tillegg skyldes KIE på EET gjennom OM c- Cyts komplekset. Først lagt vi 1 µM riboflavin (RF) eller flavin mononucleotide (FMN) til elektrokjemiske reaktor før og etter D2O tillegg, hvilke kan brukes å studere EET S. oneidensis MR-1. Ved S. oneidensis MR-1, flavins spesielt akselerere EET prosessen ved binding med OM c- Cyts i noen sekunder, fordi flavins fungere som ikke-kovalente bindende kofaktorer21,22, 23. en umiddelbar anodic gjeldende økning av flavin tillegg angir derfor rate begrensning av EET prosessen via OM c- Cyts (figur 5). Vi ytterligere bekreftet effekten av skytling elektron meglere på KIE. Liten redoks molekyler, f.eksanthraquinone-1-sulfonate (α-AQS), avslutte EET prosessen ved å spre fra mikrobiell elektronet transportkjeden til elektroden, i stedet for direkte elektronet transport via OM c- Cyts15 , 24. her, tillegg av 100 µM α-AQS forbedret den gjeldende produksjonen ved flere 5-fold (figur 4b), som viser at the kinetics av metabolske reaksjoner er rask nok til å gjøre EET behandle hastighetsbegrensning trinnet. Konsekvent, forble gjeldende produksjon formidlet av α-AQS upåvirket av D2O tillegg (figur 4b), viser at potensielle forsinkelsen i metabolske reaksjoner av D2O ikke forårsaker den store KIE observert i figur 4a .

Kombinasjonen av disse to tilnærmingene å observere KIE på elektronet transport med OM c- Cyts er det kritiske punktet i denne rapporten, og spesielt skytling elektron meglere kan være gjelder for andre electroactive biofilm. Dessuten, når vi bekreftet at gjeldende endring er tilordnet EET prosessen, kan vi vurdere effekten av en delvis sletting mutant OM c- Cyts eller av en flavin tilknyttet OM c- Cyts på proton overføre kinetics ved å sammenligne KIE i begge tilfeller15. Når D2O ble lagt i nærvær av FMN binding med OM c- Cyts, gjeldende nedgangen ble redusert slik at det var mindre enn uten FMN, som indikerer at binding av FMN endret proton transport veien og dens kinetics (figur 4 c)15.

Figure 1
Figur 1: elektrokjemiske reaktoren brukt i denne studien. Bilde av elektrokjemiske cellen før bygging (en) og etter (b). (c) skjematisk illustrasjon av elektrokjemiske reaktoren etter 25 h elektrokjemiske inoculation på 0,4 V vs hun. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant gjeldende produksjon fra S. oneidensis MR-1 under monolayer biofilm dannelsen på en ITO elektrode. En pil angir i tillegg celle suspensjon i elektrokjemiske reaktoren. Den samme tendensen var gjengitt i minst fem personlige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: utskifting av nedbryting å frisk definerte medium (DM) med 10 mM laktat. (en) Nitrogen gass flyt over flytende overflaten. (b) fjerning av nedbryting fra elektrokjemiske reaktoren. (c) tillegg av 4.0 mL frisk DM inneholder 10 mM laktat. Etter at middels, bør reaktoren være skråstilt for å fjerne nedbryting på vegg av reaktoren. Utføre disse prosedyrer (en-c) tre ganger totalt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Effekten av D2O tillegg på gjeldende produksjon fra en monolayer biofilm S. oneidensis MR-1. Tid versus gjeldende produksjon for en monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 i en elektrokjemisk systemet med 10 mM laktat (en), en ekstra 100 µM anthraquinone-1-sulfonate (α- AQS) (b), eller en ekstra 2 µM Flavin mononucleotide (FMN) (c). Den samme tendensen var gjengitt i minst fire individuelle eksperimenter. Pilene angir tiden i tillegg D2O (heltrukket linje) eller H2O (stiplet linje). Data tilsvarende den stiplede linjen var normalisert til datapunktet like før tillegg av D2O i heltrukket data. Konsentrasjonen av D2O i elektrokjemiske reaktoren er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: vurdering av pris-bestemme trinn i den gjeldende produksjonen fra en monolayer biofilm av S. oneidensis MR-1 med tillegg av flavins. Gang mot gjeldende produksjon fra en monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 i nærvær av 10 mM laktat (heltrukket linje), 1.0 mM laktat (stiplet linje) og 0,1 mM laktat (stiplet linje). En pil angir tidspunktet på hvilke 1 µM flavin mononucleotide (FMN) ble lagt til elektrokjemiske reaktorene. I nærvær av 10 mM laktat, tillegg av FMN økte drastisk gjeldende produksjon, viser at den ekstracellulære elektronet transporten (lunsj) til c-skriver cytochrome komplekser innebygd i den bakterielle ytre membranen (OM c - Cyts) er rente-bestemme. Mindre laktat konsentrasjon i elektrokjemiske reaktoren skyldes en mindre gjeldende ekstrautstyr FMN tillegg, som angir at elektron tilbudet fra oppstrøms metabolske reaksjoner OM c- Cyts ble gradvis tregere enn Fornying. Den samme tendensen var gjengitt i minst to individuelle eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Våre hele-celle elektrokjemiske analysen har flere tekniske fordeler sammenlignet med protein elektrokjemi. Mens protein rensing krever flere trinn tidkrevende prosedyrer, tar våre hele-cellen metoden en dag av Self-organisert biofilm formasjon etter cellekultur. For å oppnå en stabil samhandling mellom OM c- Cyts og elektroden, vi må bare sterilisering og rengjøring av elektroden overflaten; det krever ikke elektrode endringer for organisering retningen på proteiner4, f.eks S. oneidensis MR-1 egentlig festes på elektroden, når du orientere OM c- Cyts i samme retning25 , 26 , 27. derimot elektrokjemiske reaksjoner av proteiner er følsomt berørt av avstanden mellom redoks områder i protein og elektroden; Dermed må renset proteiner være nøye orientert28,29. Enda viktigere, hele celler elektrokjemiske analysen direkte karakteriserer OM c- Cyts komplekser innebygd i en lipid membran med mulighetene for interaksjon med andre membran proteiner, og så reflekterer innfødt proton ledelse i OM c - Cyts (dette er ofte vanskelig å etterligne bruke renset proteiner).

Våre teknikken har imidlertid en begrensning med hensyn til konsentrasjonen av D2O. høye konsentrasjoner av D2O potensielt senke hastigheten metabolske prosesser og vekst19; Derfor gjennomførte vi eksperimenter med D2O konsentrasjoner som var mindre enn 4% (v/v) i denne protokollen. I tillegg fordi byggkorn under mikrober er regulert i en komplisert måte, kan små betinget forskjeller sterkt påvirke mikrobiell fenotypen og selv elektronet transport kinetics. Spesielt synker laktat konsentrasjonen under gjeldende produksjon fra S. oneidensis MR-1 biofilm; Derfor er det viktig å utføre KIE eksperimentet før hastighetsbegrensning prosessen skifter til oppstrøms metabolske reaksjoner.

Det mest kritiske tidspunkt å oppnår KIE er å avklare og bekrefte tilstanden der elektronet transport gjennom OM c- Cyts begrenser frekvensen av gjeldende produksjon overvåket av hele celle elektrokjemiske analysen. I denne protokollen forklarer vi hvordan du bekrefter at EET begrenser og gjenspeiler mikrobiell gjeldende produksjon. Vi innført en kombinasjon av to metoder; observasjon av gjeldende endring av flavin tillegg23, og D2O tillegg i nærvær av en spre elektron megler, f.eksα-AQS15 (Figur 4 og figur 5). Hvis en ikke kan gjøre EET behandle hastighetsbegrensning, være den mest sannsynlige grunnen ufullstendig formasjon eller fysisk avdeling av monolayer biofilm eller forurensning av andre mikrober. Vi anbefaler sterkt bekrefter dannelsen av monolayer biofilm av elektronmikroskop eller AC confocal mikroskopi. Det er godt mulig at middels erstatningsprosessen skader biofilm; Derfor fjerning og injeksjon av mediet skal utføres langsomt, og nitrogen gass skal flyte over flytende overflaten (Figur 3). Hvis en ensartet monolayer biofilm ikke gjør EET behandle hastighetsbegrensning, er det best å reexamine middels komponentene og måling forhold, f.ekstilskudd av laktat på en høyere konsentrasjon enn 10 mM, for ytterligere akselerasjon av oppstrøms metabolske prosesser. Disse betraktningene er også viktig i andre typer lunsj-kompatible mikrober. Elektron meglere kan spesielt brukes til å bekrefte at EET prosessen er hastighetsbegrensning i andre typer lunsj-kompatible mikrober inkludert blandinger av bakteriell stammer; Derfor anser vi denne protokollen som en generell metode å undersøke kinetic virkningen av protoner på direkte elektronet transport på bakterier/elektrode grensesnittet. Vurderer at EET er observert i andre mikrobiell stammer og konsortier, så vidt EET prosessen er hastighetsbegrensningen, gjelder denne protokollen å studere mikrobiell åndedrett i anaerob jern korrosjon og metan-oksidasjon prosesser og i mikrobielle brenselceller30,31.

Vårt system av S. oneidensis MR-1 monolayer biofilm med hastighetsbegrensning prosessen med EET via OM c- Cyts kan brukes ikke bare for KIE eksperimenter men også for biokjemiske karakterisering av OM c- Cyts. For eksempel tillegg av ulike konsentrasjoner av flavins som binder som kofaktorer OM c- Cyts ville tillate den elektrokjemiske kvantifiseringen av dissosiasjon konstant (Kd ~ 10 µM) for dannelsen av flavin-bundet OM c- Cyts komplekser32,33,34. Videre arbeidet vårt siste viste at den omvendte elektron tilbakestrømming prosessen via OM c- Cyts kan være preget gjennom Katodisk gjeldende produksjon33,34. Det har blitt foreslått at elektron tilbakestrømming er forbundet med proton import over OM som kilde for chemiosmotic ATP syntese35; Derfor er det av stor interesse å undersøke virkningen av protoner på elektron tilbakestrømming kinetics i OM c- Cyts.

I konklusjonen, utviklet vi teknikker for å undersøke deuterium KIE på EET gjennom OM c- Cyts bruker lever S. oneidensis MR-1. Teknikken kan brukes for karakteristikk av OM c- Cyts samt KIE observasjon, og det er potensielt gjelder andre electrogenic mikrober. Vi tror at denne metodikken kan være en generell teknikk for å undersøke EET direkte via OM c- Cyts i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en Grant-in-Aid for spesielt forfremmet forskning fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHI bevilgning nummer 24000010, 17H 04969, og JP17J02602, oss Office av Naval Research globalt (N62909-17-1-2038). Y.T. er stipendiat JSP og støttes av JSP gjennom programmet for ledende utdannet skoler (fortjeneste).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

Biokjemi problemet 134 hele celler elektrokjemi cytochromes metall redusere bakterier proton overføring flavin bioelectrochemistry mikrobielle brenselceller electroactive biofilm
Elektrokjemiske gjenkjenning av Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektronet Transport <em>Shewanella oneidensis</em> MR-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, … More

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter