Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.
Abstract
Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c- Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c- Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c- Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c- Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.
Introduction
Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln - Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c -Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.
Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist - Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.
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Protocol
1. Bildung von Biofilm Monolayer von S. Oneidensis MR-1 auf einer ITO-Elektrode (Abbildung 1)
Hinweis: Um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors mit anderen Mikroben zu verhindern, sollten alle Medien, Geräte und Komponenten des elektrochemischen Reaktors im Voraus sterilisiert werden. Wenn MR. S. Oneidensis -1 Zellen und konstruieren die elektrochemischen Reaktoren, alle Verfahren auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden sollten.
- Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen
Hinweis: Ein Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 entstand auf einer ITO Elektrode nach den Bedingungen berichtete zuvor4.- Um S. Oneidensis MR-1 Zellen wachsen, fügen Sie eine Kolonie von S. Oneidensis MR-1 auf einer nährbodenplatte bestehend aus Luria-Bertani (LB) (20 g/L) und Bacto Agar (15 g/L) in 15 mL LB-Medium (20 g/L) bei 30 ° C für 24 h unter aeroben Bedingungen mit 160 u/min schütteln angebaut.
- Die Zellsuspension bei 6.000 × g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in 15 mL definierte Medium (pH 7,8) (DM: Nahco33 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] und 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] Ethanesulfonic Säure [HEPES; 7,2 g/L]), ergänzt mit 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt als Quelle von Kohlenstoff, und Spurenelemente für S. Oneidensis MR-1 , beziehungsweise.
- Weiter kultivieren die Zellsuspension aerob bei 30 ° C für 12 h unter Schütteln bei 160 u/min und Zentrifugieren wieder bei 6.000 × g für 10 min. waschen das resultierende Zelle Pellet zweimal mit DM Medium durch Zentrifugation für 10 min bei 6000 × g vor der elektrochemischen Experimentieren Sie.
- Bau eines elektrochemischen drei-Elektroden-Reaktors (Abbildung 1)
- Setzen Sie ein Substrat ITO als Arbeitselektrode an der Unterseite des Reaktors.
- Anschließend fügen Sie einen Glaszylinder (Durchmesser 2 cm) und ein Cover von Polytetrafluorethylen (PTFE). Dann fügen Sie Ag/AgCl (KCl gesättigt) und einem Platindraht in den Reaktor als die Referenz und Zähler Elektroden bzw..
Hinweis: Um das Austreten von Luft und Lösung zu verhindern, legen Sie ein Butyl-Kautschuk-Blatt zwischen einzelnen Komponenten. - Fügen Sie 4,0 mL DM ergänzt mit 10 mM Laktat und Hefeextrakt 0,5 g/L in den elektrochemischen Reaktor hinzu.
- Fließen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass gibt es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor die Stickstoffgas in den elektrochemischen Reaktor über 20 min, anaerobe Bedingungen innerhalb des elektrochemischen Reaktors aufrechtzuerhalten.
Hinweis: Um Verunreinigungen mit anderen Mikroben zu verhindern, sollte das Gas gefiltert werden, bevor es in den elektrochemischen Reaktor fließt. - Verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit einem potentiostaten und + 0,4 V gelten (im Vergleich zu standard-Wasserstoff-Elektrode, sie) auf die ITO-Elektrode, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors bei 30 ° C mit einer externen Wasserkreislauf.
Hinweis: Um die Wirkung eines externen elektrischen Feldes zu verhindern, sollte der elektrochemische Reaktor in einen Faradayschen Käfig platziert werden.
- Elektrochemische Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen (Abbildung 1 und Abbildung 2)
- Passen Sie die Zelle Dichte der Suspension in Schritt 1.1 zu einer optischen Dichte von 1,43 bei 600 erhaltenen nm (OD600) mit DM 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefe ergänzt zu extrahieren.
Hinweis: Um die richtige OD600zu erhalten, gelten Sie die Zellsuspension OD600 ≤ 0,8 für eine UV-Vis-Spektrometer vor Einstellen der OD600 bis 1,43. - Hinzufügen von 0,3 mL Zellsuspension in den elektrochemischen Reaktor durch die Injektion Port mit einer Spritze: die OD600 im Reaktor ändert sich auf 0,1.
Hinweis: Die Zugabe von 0,3 mL Zellsuspension mit OD600 = 1,43 in elektrochemischen Reaktor mit 4,0 mL mittlere Ergebnissen in 4,3 mL der Lösung mit einer OD600 = 0,1. Bei Verwendung von anderen Reaktoren mit unterschiedlichen Volumina ist die Berechnung der Zelldichte erforderlich. - Die mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie), die ITO-Elektrode für 25 h fort.
Hinweis: Für die Bildung von Biofilm Monolage auf einer ITO-Elektrode, sicherzustellen Sie, dass der erzeugte Strom eine Abweichung von weniger als 50 % aus Abbildung 2zeigt.
- Passen Sie die Zelle Dichte der Suspension in Schritt 1.1 zu einer optischen Dichte von 1,43 bei 600 erhaltenen nm (OD600) mit DM 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefe ergänzt zu extrahieren.
(2) Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM Laktat (Abbildung 3)
- Die mögliche Anwendung zu stoppen und die potentiostaten und den Wasserkreislauf den elektrochemischen Reaktor trennen.
- Laktat-Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM
- Das Stickstoffgas fließen in eine Flasche mit DM mit 10 mM Laktat über 20 min, Sauerstoff vom Medium zu entfernen.
- Entfernen Sie langsam den überstand im elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze unter fließendem Stickstoffgas (Abb. 3a, b).
Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode durch Stickstoffgas, sollte das Gas über der Flüssigkeitsoberfläche fließen. - Zugeben Sie 4,0 mL frische DM mit 10 mM Laktat mit einer Spritze (Abb. 3 c).
Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode, injizieren Sie langsam das Medium entlang der Mauer des elektrochemischen Reaktors. Um den Biofilm feucht zu halten, sollte das Medium sofort nach dem Entfernen des Überstandes hinzugefügt werden. Injektion von der Mittel-bis zu 1 min nach dem Entfernen des Überstandes beeinträchtigt nicht die aktuelle Produktion aus der Biofilm von S. Oneidensis MR-1. - Schräge des elektrochemischen Reaktors Entfernen aller der Überstand an der Wand des elektrochemischen Reaktors befestigt.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.4 in insgesamt drei Mal.
- Stoppen Sie den Gasstrom zu und verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit dem potentiostaten wiederum die ITO-Elektrode bei 303 k + 0,4 V (gegen sie) zuweisen
(3) Zugabe von Deuterium Wasser zur Messung der KIE auf den EET-Prozess (Abbildung 4)
- Bestätigen Sie, dass die laufenden Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 stabil ist und wird nicht schnell erhöht. Wenn der Strom steil steigt, warten Sie, bis der Strom innerhalb einer Erhöhung um 5 % über 10 min stabilisiert.
Hinweis: Eine Monolage Biofilmbildung auf eine ITO-Elektrode ohne Kontamination der andere mikrobielle Stämme rDNA Sequenzen und ein Scan Elektron mikroskopische Bild des Biofilms auf eine ITO-Elektrode, bestätigte wie zuvor4berichtet. Zur Bestätigung der Rate Beschränkung durch die EET Prozess überwachen Sie den Effekt des Hinzufügens pendelt Elektron Mediatoren wie 100 µM anthraquinon-1-Sulfonate (α-AQS). Siehe Abschnitt Vertreter Ergebnisse und15 für weitere Details verweisen. - Fügen Sie 40 µL anoxischen 50 % (V/V) D2O in den elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze, so dass die Konzentration 0,5 % (V/V) D2O im Reaktor.
Hinweis: Zur Vermeidung von Schäden an den Biofilm durch D2O Zusatz injizieren Sie D2O tropfenweise. - Warten Sie, bis des Stroms zu stabilisieren, und anschließend fügen Sie die D-2O bis zu 4,0 % (V/V).
Hinweis: Um den KIE-Wert (das Verhältnis der laufenden Produktion in Anwesenheit D2O und H2O) zu erhalten, überprüfen Sie die Wirkung des gleichen Volumens von H2O Zusatz auf der aktuellen Produktion.
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Representative Results
Nach 25 h mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie) bildete ein monomolekularen Film Biofilm auf die Arbeitselektrode ITO Glas, zuvor durch ein Rasterelektronenmikroskop oder einem konfokalen Mikroskopie4bestätigt wurde. Der repräsentative zeitliche Verlauf der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 während einer Monoschicht Biofilmbildung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl der Strom in jeder Messung verändert, wird der produzierte Strom keine Abweichung von mehr als 50 % vom Wert in Abbildung 2 aufweisen, wenn ein Monolage Biofilm einheitlich gebildet wird.
Nach dem Austausch des Überstands mit frischen DM mit 10 mM Laktat zu maximieren Sie die Geschwindigkeit der Stoffwechselvorgänge und waschen den Monolage Biofilm (Abbildung 3) kann ein stabile anodische Strom (ca. 5 % Steigerung in 10 min) unter 0,4 V (im Gegensatz zu sie beobachtet werden ) Anwendung (Abb. 4a). Wenn die anodische Strom steil ansteigt, warten Sie, bis die aktuelle stabilisiert. Es ist gut möglich, dass die Verfahren zur überstand Ersatz in Abschnitt 2 beschriebenen des Biofilms schadet und Rekonstruktion auftreten kann.
Die durchgezogene Linie in Abbildung 4a ist das repräsentative Ergebnis für die mikrobielle Stromänderung induziert durch die D-2O-Zufuhr. Die Zugabe von 1,0 % (V/V) D2O drastisch eingebrochen und den mikrobiellen Strom innerhalb von 10 s, während fast keine aktuellen Rückgang durch die Zugabe von H2O (gestrichelte Linie in Abbildung 4a)15beobachtet wurde. Die gleiche Tendenz wurde in mindestens vier separate Experimenten reproduziert. Aufeinanderfolgende Zugabe der D2O am Endkonzentrationen von 0,5 % auf 2,0 % (V/V) deutlich zeigte starke Unterdrückung in der aktuellen Produktion (Abb. 4a)15. Da die mikrobiellen aktuelle Produktion allmählich erholte sich wahrscheinlich durch die physiologische Wirkung19,20, sollten KIE der aktuelle Rückgang bald nach der Zugabe von D2O. zugewiesen werden In einem früheren Bericht haben wir die aktuelle Produktion bei etwa 10 min nach der Zugabe von D2O zur Berechnung des Wertes der KIE15gesammelt.
Mit zwei Methoden haben wir bestätigt, dass die beobachteten aktuellen Abnahme durch die D-2O-Zufuhr auf KIE auf die EET durch die OM c- Cyts Anlage zurückzuführen ist. Erstens haben wir 1 µM Riboflavin (RF) oder Flavin mononukleotid (FMN) in den elektrochemischen Reaktor vor und nach dem D2O Zusatz, die verwendet werden können, um EET in S. Oneidensis MR-1 zu studieren. Im Falle von S. Oneidensis MR-1, flavinen speziell beschleunigen die EET durch die Bindung mit OM c- Cyts in wenigen Sekunden, weil die flavinen als nicht-kovalente Bindung Cofaktoren21,22, Funktion 23. daher eine sofortige anodische Stromanstieg durch Flavin Zugabe gibt Rate Beschränkung durch die EET-Prozess über OM c- Cyts (Abbildung 5). Weiter haben wir die Wirkung von pendelt Elektron Mediatoren auf KIE bestätigt. Kleinen Redox-Moleküle, z.B.anthraquinon-1-Sulfonate (α-AQS), beendet den EET-Prozess durch Diffusion aus der mikrobiellen Elektronentransport-Kette an der Elektrode, anstatt direkte Elektronentransport über OM c- Cyts15 , 24. hier die Zugabe von 100 µM α-AQS verbessert die aktuelle Produktion von mehr als 5-fach (Abbildung 4 b), was darauf hinweist, dass die Kinetik der metabolischen Reaktionen sind schnell genug, um die EET die Bandbreitenbegrenzung Schritt zu machen. Konsequent, blieb die aktuelle Produktion vermittelt durch α-AQS unberührt D2O-Zufuhr (Abbildung 4 b), zeigen, dass die mögliche Verzögerung in metabolischen Reaktionen von D2O keine der großen KIE beobachtet in Abbildung 4a verursacht .
Die Kombination dieser beiden Ansätze zu beobachten, die KIE auf Elektronentransport mit OM c- Cyts ist der kritische Punkt dieses Berichts, und insbesondere pendelt Elektron Mediatoren kann für andere Elektroaktive Biofilmen. Darüber hinaus, sobald wir bestätigt, dass die aktuelle Änderung der EET Prozess zugeordnet ist, könnte wir beurteilen die Wirkung eine teilweise Löschung Mutante OM c- Cyts oder eine Flavin zugeordnete OM c- Cyts auf das Proton der Übertragung von Kinetik durch den Vergleich der KIE in Beide Fälle15. Wenn D2O wurde hinzugefügt, in Anwesenheit von FMN verbindlich mit OM c- Cyts, der aktuelle Rückgang wurde reduziert, so dass es kleiner als die ohne FMN war, darauf hinweist, dass die Bindung von FMN Proton Transport Weg und die Kinetik (Figur verändert 4 c)15.
Abbildung 1: elektrochemische Reaktor in dieser Studie verwendeten. Foto der elektrochemischen Zelle vor Baubeginn (ein) und nach dem Bau (b). (c) schematische Darstellung der elektrochemischen Reaktor nach einer elektrochemischen Inokulation auf + 0,4 V 25 h Vs SHE. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative aktuelle Produktion von S. Oneidensis MR-1 während der Monolage Biofilmbildung auf einer ITO-Elektrode. Ein Pfeil zeigt die Zeit der Zugabe die Zellsuspension in den elektrochemischen Reaktor. Die gleiche Tendenz wurde in mindestens fünf einzelnen Experimenten reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Ersatz des Überstands frische definierte Medium (DM) mit 10 mM Laktat. (ein) Stickstoffgas Flow über der Flüssigkeitsoberfläche. (b) Entfernung des Überstands aus dem elektrochemischen Reaktor. (c) Zugabe von 4,0 mL frische DM mit 10 mM Laktat. Nach der mittleren Zugabe sollte der Reaktor geneigt sein, um den überstand an der Wand des Reaktors befestigt zu entfernen. Durchführen Sie diese Verfahren (ein–c) insgesamt dreimal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Wirkung von D-2O-Zufuhr über die aktuelle Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1. Zeit im Vergleich zu aktuellen Produktion für einen monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 in einem elektrochemischen System mit 10 mM Laktat (ein), eine zusätzliche 100 µM anthraquinon-1-Sulfonate (α- AQS) (b), oder eine zusätzliche 2 µM Flavin mononukleotid (FMN) (c). Die gleiche Tendenz wurde in mindestens vier einzelnen Experimenten reproduziert. Die Pfeile zeigen die Zeit des Zusatzes von D2O (durchgezogene Linie) oder H2O (gestrichelte Linie). Die Daten entsprechend der gestrichelten Linie wurden auf den Datenpunkt kurz vor der Zugabe von D2O in die durchgezogene Liniendaten normalisiert. Die Konzentration von D2O im elektrochemischen Reaktor wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bewertung der Rate-Bestimmung Schritt in der laufenden Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 durch die Zugabe von flavinen. Zeit im Vergleich zu aktuellen Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 im Beisein von 10 mM Laktat (durchgezogene Linie), 1,0 mM Laktat (gestrichelte Linie) und 0,1 mM Laktat (gepunktete Linie). Ein Pfeil zeigt den Zeitpunkt, an welchem 1, den µm Flavin mononukleotid (FMN) in die elektrochemischen Reaktoren hinzugefügt wurde. In Anwesenheit von 10 mM Laktat, die Zugabe von FMN drastisch erhöht der aktuellen Produktion, die belegen, dass die extrazelluläre Elektronentransport (EET) durch c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (OM c - Cyts) ist Rate-Bestimmung. Weniger Laktat-Konzentration in der elektrochemischen Reaktor verursacht einer kleinere aktuelle Erweiterung von FMN hinaus darauf hinweist, dass zufließenden Elektronen aus der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen, OM c- Cyts allmählich langsamer als die EET-Rate. Die gleiche Tendenz wurde in mindestens zwei einzelne Versuche reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen - Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung der Proteine4, z. B. S. Oneidensis MR-1 per se auf die Elektrode beim Ausrichten der OM c misst- Cyts in der gleichen Richtung25 , 26 , 27. im Gegensatz dazu die elektrochemischen Reaktionen der Proteine empfindlich betroffen sind der Abstand zwischen Redox-Standorte in das Protein und die Elektrode; also müssen der gereinigten Proteine sorgfältig ausgerichtet28,29. Noch wichtiger ist, die gesamte Zelle elektrochemische Assay direkt OM c- Cyts komplexe eingebettet in eine Lipidmembran mit möglichen Interaktionen mit anderen Membranproteinen charakterisiert, und so spiegelt das native Proton-Management in der OM c - Cyts (Dies ist oft schwer zu imitieren, mit gereinigten Proteinen).
Unsere Technik hat jedoch eine Einschränkung in Bezug auf die Konzentration von D2O. hohe Konzentrationen von D2O Stoffwechselprozesse und Wachstum19möglicherweise verlangsamen; Daher haben wir die Experimente mit D-2O-Konzentrationen, die weniger als 4 % (V/V) in diesem Protokoll wurden durchgeführt. Darüber hinaus weil Genexpression in Mikroben auf komplexe Weise reguliert wird, könnten kleine bedingte Unterschiede stark der mikrobiellen Phänotyp und sogar den Elektronentransport Kinetik beeinflussen. Insbesondere verringert die Laktatkonzentration während der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 Biofilm; Daher ist es wichtig, die KIE Experimente durchzuführen, bevor die Bandbreitenbegrenzung Prozess zu vorgelagerten Stoffwechselreaktionen verschiebt.
Der kritischste Punkt um erfolgreich die KIE zu erhalten ist, zu klären und bestätigen den Zustand, in dem das Elektron transportieren durch OM c- Cyts Grenzen die Rate der laufenden Produktion durch die gesamte Zelle elektrochemische Assay überwacht. In diesem Protokoll erklären wir, wie zu bestätigen, dass die Rate der EET begrenzt und die mikrobielle aktuelle Produktion spiegelt. Wir haben eine Kombination aus beiden Methoden eingeführt; Beobachtung der aktuellen Änderung von Flavin Zusatz23und D-2O-Zufuhr in Anwesenheit von diffundierende Elektron Vermittler, z. B.α-AQS15 (Abbildung 4 und Abbildung 5). Wenn man die EET verarbeiten-Bandbreitenbegrenzung machen kann, wäre die wahrscheinlichste Grund unvollständig Bildung oder physische Trennung der Monolage Biofilm oder Verunreinigung durch andere Mikroben. Wir empfehlen dringend, bestätigt, dass der Monolage Biofilmbildung scanning Electron Microscopy oder der konfokalen Mikroskopie. Es ist sehr möglich, dass die mittlere Austauschprozess den Biofilm schädigt; Daher sollte die Entfernung und die Injektion des Mediums langsam durchgeführt werden sollten, und Stickstoffgas über der Flüssigkeitsoberfläche (Abbildung 3). Wenn ein einheitliche Monolage Biofilm nicht die EET verarbeiten-Bandbreitenbegrenzung zu machen, empfiehlt es sich, die mittelkomponenten und Messbedingungen, z. B.Supplementierung von Laktat in einer höheren Konzentration als 10 mM, für weitere Beschleunigung zu überdenken vorgelagerten Stoffwechselprozesse. Diese Überlegungen sind auch bei anderen Arten von EET-fähigen Mikroben wichtig. Elektron Mediatoren können insbesondere verwendet werden, zu bestätigen, dass die EET Bandbreitenbegrenzung in anderen Arten von EET-fähigen Mikroben einschließlich Mischungen von Bakterienstämmen erfolgt; so betrachten wir dieses Protokoll als eine allgemeine Methode, die kinetische Wirkung von Protonen auf direkte Elektronentransport an der Schnittstelle von Bakterien/Elektrode zu untersuchen. Man bedenkt, dass EET in andere mikrobielle Belastungen und Konsortien, beobachtet wird, soweit die EET-Bandbreitenbegrenzung erfolgt, gilt dieses Protokoll die mikrobielle Atmung in anaeroben Eisen Korrosion und Methan-Oxidation Prozesse sowie im Studium mikrobiellen Brennstoffzellen30,31.
Unser System von S. Oneidensis MR-1 Monolage Biofilm mit dem Rate-limiting Prozess der EET per OM c- Cyts eignet sich nicht nur für die KIE-Experimente, sondern auch für die biochemische Charakterisierung von OM c- Cyts. Beispielsweise würde die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen an flavinen, die als Cofaktoren, OM cbinden - Cyts die elektrochemische Quantifizierung der Dissoziationskonstante (Kd ~ 10 µM) für die Bildung von Flavin-gebundenen OM cerlauben- CYTS komplexe32,33,34. Darüber hinaus unsere jüngsten Arbeiten gezeigt, dass die inverse Elektron Rückfluss über OM c- Cyts sein könnte durch kathodische aktuelle Produktion33,34gekennzeichnet. Es wurde vorgeschlagen, dass der Elektron Rückfluss über das OM als Quelle für chemiosmotischen ATP Synthese35Proton Import zugeordnet ist; Daher ist es von großem Interesse für die Untersuchung der Auswirkungen von Protonen auf das Elektron Rückfluss Kinetik in OM c- Cyts.
Zusammenfassend haben wir Techniken, um zu prüfen, das Deuterium KIE auf die EET mithilfe OM c- Cyts Leben S. Oneidensis MR-1 entwickelt. Die Technik kann verwendet werden zur Charakterisierung von OM c- Cyts sowie KIE Beobachtung und es gilt möglicherweise für andere elektrogenes Mikroben. Wir glauben, dass diese Methodik kann eine allgemeine Technik, die EET direkt über OM c- Cyts in Vivozu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
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