Summary
Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direct de détection électrochimique de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (membrane externe c-type du cytochrome complexes ; OM c- Cyts) a récemment émergé comme nouvelle méthode analytique cellule entière pour caractériser le transport des électrons bactérien de la chaine respiratoire à l’extérieur de la cellule, dénommé le transport des électrons extracellulaire (EET). Alors que la voie et la cinétique de l’écoulement d’électron au cours de la réaction de EET ont été étudiés, une méthode électrochimique cellule entière pour examiner l’impact du transport de cations associé à EET n’a pas encore été établie. Dans la présente étude, un exemple d’une technique biochimique pour examiner l’effet isotopique deutérium (KIE) sur EET par OM c- Cyts utilisant un microbe modèle, Shewanella oneidensis MR-1, est décrite. L’EIC sur le processus EET peut être obtenue si l’EET par OM c- Cyts agit comme l’étape cinétiquement limitante dans la production actuelle microbienne. À cette fin, avant l’ajout de D2O, le surnageant a été remplacé avec les supports neufs contenant une quantité suffisante de donneur d’électrons pour soutenir le taux de réactions métaboliques en amont et de retirer les cellules planctoniques un uniforme monocouche biofilm sur l’électrode de travail. Méthodes alternatives pour confirmer la limitante étape dans la production actuelle microbienne comme EET par OM c- Cyts sont également décrites. Notre technique d’un dosage électrochimique cellule entière pour étudier la cinétique du transport proton peut être appliquée à d’autres souches microbiennes électroactif.
Introduction
Des techniques électrochimiques de qualifier directement une protéine d’oxydo-réduction dans une cellule bactérienne intacte ont récemment émergé depuis la découverte de souches microbiennes-réduction des métaux, tels que S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, qui ont des complexes de cytochrome c-type de membrane externe (OM c-Cyts) exposés à la cellule extérieur1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts médiation transport des électrons de la chaine respiratoire à des substrats solides situé extracellulaire. Ce transport est dénommé extracellulaire transport d’électrons (EET)1,6 et est un processus critique pour les biotechnologies émergents, tels que les piles à combustible microbiennes6. Par conséquent, pour comprendre la cinétique EET sous-jacent et mécanismes et son lien avec la physiologie microbienne, OM c -Cyts ont été étudiés à l’aide de cellules entières électrochimie4,7, combinée avec la microscopie 8 , 9,10,de spectroscopie11et biologie moléculaire2,4. En revanche, méthodes pour étudier l’impact du transport de cations EET-liés, par exemple, les protons et sur la cinétique EET dans les cellules vivantes ont été guère établies, malgré le transport de protons à travers les membranes bactériennes ayant un rôle essentiel dans signalisation, homéostasie et énergie production12,13,,14. Dans la présente étude, nous décrivons une technique pour examiner l’impact du transport de protons sur la cinétique EET dans la cellule de MR-1 S. oneidensis à l’aide de mesures électrochimiques cellule entière, qui nécessite l’identification de l’étape cinétiquement limitante dans microbienne de production actuel15.
Une façon directe pour évaluer la contribution du transport de protons sur le EET associé est l’effet isotopique du deutérium (KIE). La KIE est observable comme le changement de cinétique de transfert d’électron sur le remplacement de protons avec des ions de deutérium, qui représente l’impact du transport de protons sur les électrons transfert cinétique16. La théorie de KIE lui-même a été clairement établie à l’aide de mesures électrochimiques avec enzymes purifiées,17. Toutefois, étant donné que la production actuelle en S. oneidensis MR-1 résulte de multiples processus variés et fluctuants18, on ne peut pas simplement identifier EET que le processus de limitation de vitesse. Pour observer la KIE sur les processus de transport de protons couplés avec EET, il faut confirmer que la production actuelle microbienne est limitée par transport d’électrons par l’intermédiaire de OM c- Cyts à l’électrode. À cette fin, nous avons remplacé la solution surnageante avec un milieu frais contenant une forte concentration de lactate comme donneur d’électrons au pH optimal et des conditions de température avant mesure KIE ; Ce remplacement a servi deux rôles : (1) il amélioré le taux des processus métaboliques en amont par rapport à l’EET et (2) omis les cellules de natation dans le surnageant détache le biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur la (électrode de travail électrode d’oxyde d’étain dopé (ITO) indium). Le protocole détaillé présenté est destiné à aider les nouveaux praticiens maintenir et confirmer que le processus EET est l’étape cinétiquement déterminante.
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Protocol
1. formation d’un Biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur une électrode ITO (Figure 1)
Remarque : Pour éviter la contamination du réacteur électrochimique avec d’autres microbes, tous les médias, outils et composants du réacteur électrochimique doivent être stérilisés à l’avance. Quand à l’aide de cellules de S. oneidensis MR-1 et la construction des réacteurs électrochimiques, toutes les procédures doivent être réalisées sur un banc propre.
- Culture de cellules de S. oneidensis MR-1
Remarque : Un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 a été formé sur l’OIC électrode suivant les conditions signalées précédemment4.- Pour cultiver des cellules S. oneidensis MR-1, ajoutez une colonie de S. oneidensis MR-1, cultivé sur une gélose comprenant Luria-Bertani (LB) (20 g/L) et bacto agar (15 g/L) dans 15 mL de milieu LB (20 g/L) à 30 ° C pendant 24 h dans des conditions aérobies avec agitation à 160 tours/minute.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 6 000 × g pendant 10 min et remettre en suspension le culot cellulaire qui en résulte dans 15 mL de milieu défini (pH 7,8) (DM : NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] et 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acide [HEPES ; 7,2 g/L]), additionné de 10 mM de lactate et extrait de levure 0,5 g/L comme source de carbone et d’oligo-éléments pour S. oneidensis MR-1 , respectivement.
- Encore cultiver la suspension cellulaire en aérobiose à 30 ° C pendant 12 h avec agitation à 160 tr/min et centrifuger à nouveau à 6 000 × g pendant 10 min. laver le culot qui en résulte deux fois avec DM moyen par centrifugation pendant 10 min à 6 000 × g avant l’électrochimique Faites des essais.
- Construction d’un réacteur électrochimique à trois électrodes (Figure 1)
- Mettre un substrat ITO comme l’électrode de travail en bas du réacteur.
- Par la suite, insérez un cylindre de verre (diamètre de 2 cm) et une couverture de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Puis insérez Ag/AgCl (KCl saturé) et un fil de platine dans le réacteur comme les électrodes de référence et compteur, respectivement.
Remarque : Pour éviter les fuites d’air et solution, insérez une feuille de caoutchouc butyle entre chaque composant. - Ajouter 4,0 mL de DM additionné de 10 mM de lactate et d’extrait de levure de 0,5 g/L dans le réacteur électrochimique.
- Après avoir confirmé qu’il n’y a pas de fuite provenant du réacteur électrochimique, jettent le gaz d’azote dans le réacteur électrochimique pendant 20 min pour maintenir des conditions anaérobies dans le réacteur électrochimique.
Remarque : Pour éviter la contamination par d’autres microbes, le gaz doit être filtré avant elle se jette dans le réacteur électrochimique. - Connectez le réacteur électrochimique d’un potentiostat et appliquer + 0,4 V (versus l’électrode standard à hydrogène, elle) à l’électrode ITO, maintenir la température du réacteur électrochimique à 30 ° C à l’aide d’un système de circulation d’eau externe.
Remarque : Pour éviter l’effet d’un champ électrique extérieur, le réacteur électrochimique devrait être placé dans une cage de Faraday.
- Électrochimique culture de cellules de MR-1 S. oneidensis (Figure 1 et Figure 2)
- Ajuster la densité des cellules de la suspension obtenue à l’étape 1.1 à une densité optique de 1,43 à 600 nm (OD600) avec DM complétée par de la levure de lactate et 0,5 g/L 10 mM extrait.
Remarque : Pour obtenir la bonne OD600, appliquer la suspension cellulaire de OD600 ≤ 0,8 à un spectromètre UV-visible avant réglage de l' OD600 à 1,43. - Ajouter 0,3 mL de la suspension cellulaire dans le réacteur électrochimique par l’orifice d’injection à l’aide d’une seringue : l' OD600 dans le réacteur passe à 0,1.
Remarque : L’ajout de suspension cellulaire 0,3 mL avec OD600 = 1,43 dans réacteur électrochimique contenant 4,0 mL résultats moyenne à 4,3 mL de la solution avec un OD600 = 0,1. Lorsque vous utilisez d’autres réacteurs avec des volumes différents, le calcul de la densité cellulaire est nécessaire. - Continuer l’application potentielle à + 0,4 V (par rapport à elle) à l’électrode ITO pour 25 h.
Remarque : Pour la formation d’un biofilm monocouche sur une électrode ITO, assurez-vous que le courant produit montre un écart de moins de 50 % par rapport à la Figure 2.
- Ajuster la densité des cellules de la suspension obtenue à l’étape 1.1 à une densité optique de 1,43 à 600 nm (OD600) avec DM complétée par de la levure de lactate et 0,5 g/L 10 mM extrait.
2. remplacement du liquide surnageant avec un milieu frais DM avec 10 mM de Lactate (Figure 3)
- Arrêter l’application potentielle et déconnectez le réacteur électrochimique de la potentiostat et le système de circulation d’eau.
- Remplacement du liquide surnageant avec un milieu frais DM avec 10 mM de lactate
- L’azote gazeux se jettent dans une bouteille contenant des DM avec 10 mM de lactate pendant 20 min pour enlever l’oxygène du milieu.
- Retirez lentement tous le surnageant à l’intérieur du réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue, en s’écoulant l’azote gazeux (Figure 3 a, b).
Remarque : Pour éviter de casser le biofilm sur l’électrode ITO par gaz d’azote, le gaz doit circuler au-dessus de la surface du liquide. - Ajouter 4,0 mL de DM frais contenant du lactate de 10 mM à l’aide d’une seringue (Figure 3C).
Remarque : Pour éviter de casser le biofilm sur l’électrode ITO, injecter lentement le milieu le long du mur du réacteur électrochimique. Pour garder le biofilm humide, la moyenne s’ajouteront immédiatement après l’élimination du surnageant ; Injection de la moyenne jusqu'à 1 min après l’élimination du surnageant n’influe pas sur la production actuelle de biofilm de S. oneidensis MR-1. - Incliner le réacteur électrochimique pour retirer tout le liquide surnageant fixé au mur du réacteur électrochimique.
- Répétez les étapes 2.2.2-2.2.4 trois fois au total.
- Arrêter l’écoulement de gaz et brancher le réacteur électrochimique pour le potentiostat nouveau, appliquant + 0,4 V (par rapport à elle) à l’électrode ITO à 303 K.
3. l’addition d’eau de deutérium pour mesurer la KIE sur le processus EET (Figure 4)
- Confirmer que la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 est stable et n’augmente pas rapidement. Si le courant augmente fortement, attendez que le courant se stabilise au sein d’une augmentation de 5 % pendant 10 min.
Remarque : La formation d’un biofilm monocouche sur une électrode ITO sans contamination des autres souches microbiennes a été confirmée par des séquences des ADNr et une balayage image microscopique de l’électron du biofilm sur une électrode ITO, tel que rapporté précédemment4. Pour la confirmation de la limitation de vitesse par le processus EET, surveiller l’effet de l’ajout de navette électron médiateurs tels que 100 µM anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS). Reportez-vous à la section des Résultats représentant et référence15 pour plus de détails. - Ajouter 40 µL d’anoxique 50 % (v/v) D2O dans le réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue telle que la concentration est de 0,5 % (v/v) D2O dans le réacteur.
Remarque : Pour éviter d’endommager le biofilm par addition de2O D, injecter la D2O goutte-à-goutte. - Attendez que le courant se stabilise et ajoutez ensuite la D2O jusqu'à 4,0 % (v/v).
Remarque : Pour obtenir la valeur KIE (le ratio de la production actuelle en présence D2O et H2O), vérifier l’effet du même volume d’addition2O H sur la production actuelle.
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Representative Results
Après 25 h de demande potentielle, à + 0,4 V (par rapport à elle), un biofilm monocouche a été formé sur l’électrode de travail du verre ITO, qui a été précédemment confirmée par un microscope électronique à balayage ou une microscopie confocale4. L’évolution temporelle représentatifs de la production actuelle de M. S. oneidensis -1 lors de la formation d’un biofilm monocouche est montrée dans la Figure 2. Bien que le courant change à chaque mesure, le courant produit ne présente pas un écart de plus de 50 % de la valeur à la Figure 2 si un biofilm monocouche est formé de façon uniforme.
Après le remplacement du liquide surnageant avec DM fraîche avec 10 mM de lactate pour maximiser la vitesse des processus métaboliques et laver le biofilm monocouche (Figure 3), un courant anodique stable (environ 5 % augmentation en 10 min) peut être observé sous + 0,4 V (contre elle ) application (Figure 4 a). Si le courant anodique augmente fortement, attendez que le courant se stabilise. Il est très possible que les modalités de remplacement surnageant décrite à l’article 2 peuvent endommager le biofilm et reconstruction peut se produire.
La ligne continue dans la Figure 4 a est le résultat représentatif du changement actuel microbienne induite par l’addition de2O D. L’ajout de 1,0 % (v/v) D2O a fortement diminué le courant microbien dans les 10 s, alors que presque aucune diminution actuelle a été observée par l’addition de H2O (en pointillé dans la Figure 4 a)15. La même tendance a été reproduite dans au moins quatre expériences distinctes. L’addition séquentielle de D2O final concentrations allant de 0,5 % à 2,0 % (v/v) exposé clairement une forte suppression dans l' actuel de la production (Figure 4 a)15. Étant donné que la production actuelle microbienne récupérer peu à peu probable en raison de l’effet physiologique19,20, KIE devrait être attribué à la baisse actuelle peu de temps après l’ajout de D2O. Dans un précédent rapport, nous avons recueilli la production actuelle d’environ 10 min après l’addition de D2O pour calculer la valeur de KIE15.
À l’aide de deux méthodes, nous a confirmé que la diminution actuelle observée par l’addition de2O D est attribuable à la KIE sur l’EET par le biais de l’OM c- Cyts complexe. Tout d’abord, nous avons ajouté 1 riboflavine µM (RF) ou flavine mononucléotide (FMN) dans le réacteur électrochimique avant et après l’ajout de2O D, qui peut être utilisée pour étudier EET dans S. oneidensis MR-1. Dans le cas de S. oneidensis MR-1, flavines spécifiquement accélèrent le processus d’EET en se liant avec OM c- Cyts en quelques secondes, car les flavines servent de liaison non covalente cofacteurs21,22, 23. par conséquent, une augmentation du courant anodique instantanée par addition de flavin indique limitation de vitesse le processus EET via OM c- Cyts (Figure 5). Nous avons confirmé davantage l’effet de la navette de médiateurs de l’électron sur KIE. Redox de petites molécules, par exemple, anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS), mettre fin au processus EET par diffusion de la chaîne de transport d’électrons microbienne à l’électrode, au lieu de transport d’électron direct via OM c- Cyts15 , 24. ici, l’addition de 100 µM α-AQS augmente la production actuelle de plus de 5 fois (Figure 4 b), qui indique que la cinétique des réactions métaboliques sont assez rapide pour faire le EET traiter l’étape cinétiquement limitante. Constamment, production actuelle médiée par le α-AQS est resté inchangée par l’addition de2O D (Figure 4 b), ce qui démontre que le retard éventuel dans les réactions métaboliques par D2O ne provoque pas le grand KIE observée dans Figure 4 a .
La combinaison de ces deux approches pour observer la KIE sur le transport des électrons avec OM c- Cyts est le point critique de ce rapport, et plus précisément, la navette de médiateurs de l’électron peut s’applique à autres des biofilms électroactifs. En outre, une fois que nous avons confirmé que le changement actuel est assigné au processus EET, nous pourrions évaluer l’effet d’un mutant de délétion partielle de OM c- Cyts ou d’une flavine associée OM c- Cyts sur proton transfer cinétique en comparant la KIE dans les deux cas15. Quand D2O a été ajouté en présence de la FMN liaison avec OM c- Cyts, la diminution actuelle a été réduite telle qu’elle était plus petite que celle sans FMN, indiquant que la liaison de la FMN altéré la voie de transport protonique et sa cinétique (Figure 4c)15.
Figure 1 : réacteur électrochimique utilisé dans cette étude. Photographie de la cellule électrochimique avant construction (un) et après la construction (b). (c) illustration schématique du réacteur électrochimique après 25 h d’inoculation électrochimique à + 0,4 V vs SHE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : production actuelle représentante de S. oneidensis MR-1 lors de la formation de biofilm monocouche sur une électrode ITO. Une flèche indique le moment de l’ajout de la suspension cellulaire dans le réacteur électrochimique. La même tendance a été reproduite dans au moins cinq expériences individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : remplacement du surnageant dans un milieu frais défini (DM) avec 10 mM de lactate. (un) azote gazeux coulée au-dessus de la surface du liquide. (b) retrait du liquide surnageant du réacteur électrochimique. (c) Addition 4,0 mL DM frais contenant du lactate de 10 mM. Après l’addition moyenne, le réacteur doit être incliné pour éliminer le surnageant fixé au mur du réacteur. Mener ces procédureun–(c) trois fois au total. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet de l’addition de2O D sur la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1. Temps par rapport à la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 dans un système électrochimique contenant 10 mM de lactate (un), un anthraquinone-1-sulfonate de 100µm supplémentaires (α- AQS) (b), ou un supplémentaire 2 µM flavine mononucléotide (FMN) (c). La même tendance a été reproduite dans au moins quatre expériences individuelles. Les flèches indiquent le moment de l’addition de D2O (trait plein) ou H2O (en pointillé). Les données correspondant à la ligne pointillée ont été normalisées pour le point de données juste avant l’ajout de D2O dans les données de trait plein. La concentration de D2O dans le réacteur électrochimique est indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : évaluation de la déterminante étape dans la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 par l’ajout des flavines. Temps par rapport à la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 en présence de lactate (trait plein) de 10 mM et 1,0 mM de lactate (ligne pointillée) 0,1 mM de lactate (ligne pointillée). Une flèche indique le point de temps à laquelle 1µm flavine mononucléotide (FMN) a été ajouté dans les réacteurs électrochimiques. En présence de lactate de 10 mM, l’ajout de la FMN a considérablement augmenté la production actuelle, ce qui démontre que le transport des électrons extracellulaire (EET) par le biais de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (OM c - Cyts) est déterminante. Moins de lactate de concentration dans le réacteur électrochimique causé une plus petite amélioration actuelle par addition de FMN, indiquant que l’approvisionnement électronique grâce aux réactions métaboliques en amont à OM c- Cyts devient progressivement plus lent que le taux EET. La même tendance a été reproduite dans au moins deux expériences individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Notre essai électrochimique cellule entière a plusieurs avantages techniques par rapport à l’électrochimie de protéine. Tandis que la purification de la protéine nécessite des procédures fastidieuses multi-étapes, notre méthode de cellule entière prend une journée de formation de biofilm auto-organisé après culture cellulaire. Pour parvenir à une interaction stable entre OM c- Cyts et l’électrode, nous avons besoin seulement de stérilisation et de nettoyage de la surface de l’électrode ; il ne nécessite pas de modification de l’électrode pour organiser l’orientation des protéines4, par exemple, MR-1 s. oneidensis intrinsèquement se fixe sur l’électrode, tout en orientant l' OM c- Cyts dans la même direction25 , 26 , 27. en revanche, les réactions électrochimiques des protéines sont sensiblement affectées par la distance entre les sites d’oxydo-réduction dans la protéine et l’électrode ; ainsi, les protéines purifiées doivent être soigneusement orienté28,29. Plus important encore, l’analyse électrochimique cellule entière directement caractérise complexes de Cyts - cOM incorporés dans une membrane lipidique avec interactions possibles avec d’autres protéines de la membrane et reflète donc le proton natif management dans l’OM c - Cyts (c’est souvent difficile d’imiter à l’aide de protéines purifiées).
Cependant, notre technique a une limitation en ce qui concerne la concentration D2O. hautes concentrations de D2O potentiellement ralentissent le processus métaboliques et croissance19; par conséquent, nous avons effectué des expériences en utilisant des concentrations de2O D qui ont moins de 4 % (v/v) dans le présent protocole. En outre, parce que l’expression des gènes chez les microbes est réglementée de manière complexe, petites différences conditionnelles peuvent affecter fortement le phénotype microbiens et même la cinétique de transport d’électrons. En particulier, la concentration de lactate diminue au cours de la production actuelle de MR-1 S. oneidensis biofilm ; par conséquent, il est important de mener des expériences KIE avant que le processus de limitation de vitesse se déplace vers des réactions métaboliques en amont.
Point le plus critique pour obtenir avec succès la KIE est de clarifier et de confirmer l’État dans lequel l’électron transport OM c- Cyts limites le taux de production actuel contrôlé par le dosage électrochimique cellule entière. Dans ce protocole, nous expliquons comment confirmer que le taux de l’EET limite et reflète la production actuelle microbienne. Nous avons introduit une combinaison des deux méthodes ; observation du changement actuel de flavin ajout23et addition2O D en présence d’un médiateur électrons diffusant, par exemple, α-AQS15 (Figure 4 et Figure 5). Si on ne peut faire l’EET traiter limitante, la raison plus probable serait une formation incomplète ou détachement physique du biofilm monocouche ou contamination par d’autres microbes. Nous recommandons fortement confirmant la formation du biofilm monocouche par microscopie électronique ou la microscopie confocale à balayage. Il est fort possible que le processus de remplacement moyen endommage le biofilm ; par conséquent, l’enlèvement et l’injection du milieu se fasse lentement et azote gazeux doit circuler au-dessus de la surface du liquide (Figure 3). Si un biofilm monocouche uniforme ne fait pas l’EET traiter limitante, il convient de réexaminer les composants moyens et les conditions de mesure, p. ex., la supplémentation de lactate à une concentration supérieure à 10 mM, pour une accélération supplémentaire de processus métaboliques en amont. Ces considérations sont également importantes dans d’autres types de microbes EET-capable. Médiateurs de l’électron permet spécifiquement pour confirmer que le processus EET est cinétiquement limitante dans d’autres types de microbes EET-capable, y compris les mélanges de souches bactériennes ; ainsi, nous considérons ce protocole comme une méthode générale d’étudier l’impact cinétique des protons sur le transport des électrons directement à l’interface de bactéries/électrode. Considérant que EET est observé dans d’autres souches microbiennes et les consortiums, pour autant que le processus EET est cinétiquement limitante, ce protocole s’applique à étudier la respiration microbienne dans la corrosion du fer anaérobies et les processus d’oxydation du méthane ainsi que dans les piles à combustible microbienne30,31.
Notre système de biofilm monocouche S. oneidensis MR-1 avec le processus de limitation de vitesse de EET par OM c- Cyts peut être utilisé non seulement pour les expériences KIE mais aussi pour la caractérisation biochimique de l’OM c- Cyts. Par exemple, l’ajout de différentes concentrations de flavines qui lient comme cofacteurs d’OM c- Cyts permettrait la quantification électrochimique de la constante de dissociation (Kd ~ 10 µM) pour la formation de flavin lié aux OM c- CYTS complexes32,33,34. Par ailleurs, nos travaux récents ont démontré que le processus de reflux électron inversée par l’intermédiaire de OM c- Cyts pourrait être caractérisée par le biais de cathodique actuelle production33,34. Il a été proposé que le refoulement de l’électron est associé à importation de proton à travers l’OM comme source pour chimiosmotique ATP synthèse35; par conséquent, il est très intéressant d’examiner l’impact des protons sur la cinétique de reflux électron en OM c- Cyts.
En conclusion, nous avons développé des techniques pour examiner le deutérium KIE sur l’EET par OM c- Cyts utilisant vivant S. oneidensis MR-1. La technique peut être utilisée pour la caractérisation des OM c- Cyts comme observation KIE et il est potentiellement applicable à d’autres microbes électrogénique. Nous pensons que cette méthodologie peut être une technique générale pour étudier l’EET directement via OM c- Cyts in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention pour spécialement favorisé la recherche de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 24000010, 17H 04969 et JP17J02602, la nous Bureau du Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. est chercheur JSPS et pris en charge par JSPS grâce au programme pour les écoles supérieures menant (mérite).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
