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Biochemistry

विद्युत डिटेक्शन ऑफ ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव में Extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन पर Shewanella oneidensis एमआर-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

Summary

यहां हम Shewanella oneidensis एमआर-1 में बाहरी झिल्ली cytochromes परिसर के माध्यम से extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन की दर के लिए प्रोटॉन परिवहन के योगदान का अध्ययन करने के लिए पूरे सेल विद्युत प्रयोगों का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली (बाहरी झिल्ली सी-प्रकार cytochrome परिसरों में एंबेडेड सीप्रकार cytochrome परिसरों की प्रत्यक्ष विद्युत पता लगाने; ओम सी-Cyts) हाल ही में एक उपंयास पूरे सेल विश्लेषणात्मक विधि के रूप में उभरा है श्वसन श्रृंखला से कोशिका बाहरी, extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन (ईत) के रूप में संदर्भित करने के लिए बैक्टीरियल इलेक्ट्रॉन परिवहन की विशेषता है । जबकि ईत प्रतिक्रिया के दौरान इलेक्ट्रॉनक प्रवाह के मार्ग और कैनेटीक्स की जांच की गई है, ईत से संबद्ध कटियन परिवहन के प्रभाव की जांच करने के लिए एक पूरी-सेल विद्युत पद्धति अभी तक स्थापित नहीं की गई है. वर्तमान अध्ययन में, एक जैव रासायनिक तकनीक का एक उदाहरण ओम सी-Cyts के माध्यम से ईत पर ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव (कीे) की जांच करने के लिए एक मॉडल सूक्ष्म जीव, Shewanella oneidensis एमआर-1, का उपयोग करते हुए वर्णित है । ईत प्रक्रिया पर कीे प्राप्त की जा सकती है यदि ओम सी-Cyts के माध्यम से ईत के माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन में दर सीमित कदम के रूप में कार्य करता है । कि अंत करने के लिए, डी2के अलावा से पहले O, supernatant समाधान नए सिरे से इलेक्ट्रॉन दाता की पर्याप्त राशि युक्त मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया था ऊपर चयापचय प्रतिक्रियाओं की दर का समर्थन है, और एक समान से planktonic कोशिकाओं को दूर monolayer काम इलेक्ट्रोड पर फिल्म । वैकल्पिक तरीकों की पुष्टि करने के लिए दर को सीमित कदम में माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन के माध्यम से ईत के रूप में ओम ग-Cyts भी वर्णित हैं । प्रोटॉन परिवहन कैनेटीक्स की जांच के लिए एक पूरी सेल विद्युत परख की हमारी तकनीक अंय electroactive माइक्रोबियल उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

विद्युत तकनीक सीधे एक बरकरार जीवाणु कोशिका में एक redox प्रोटीन की विशेषता के लिए हाल ही में धातु की खोज के बाद से उभरा है-माइक्रोबियल उपभेदों, जैसे एस oneidensis एमआर-1 या Geobacter sulfurreducens पीसीए को कम करने, जो बाहरी झिल्ली सी-प्रकार cytochrome परिसरों (ओम सी-Cyts) सेल बाहरी1,2,3,4,5से अवगत कराया । ओम सी-Cyts extracellularly स्थित ठोस सब्सट्रेट करने के लिए श्वसन श्रृंखला से मध्यस्थता इलेक्ट्रॉन परिवहन. इस परिवहन के रूप में संदर्भित किया जाता है extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन (ईत)1,6 और उभरते जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, इस तरह के माइक्रोबियल ईंधन कोशिकाओं के रूप में6। इसलिए, अंतर्निहित ईत कैनेटीक्स और तंत्र को समझने के लिए, और माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के लिए अपनी कड़ी, ओम सी-Cyts पूरे सेल electrochemistry4का उपयोग कर जांच की गई है,7, माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त 8 , 9, स्पेक्ट्रोस्कोपी10,11, और आणविक जीवविज्ञान2,4. इसके विपरीत, ईत के प्रभाव की जांच करने के तरीके-जुड़े कटियन परिवहन, जैसे, प्रोटान, ईत कैनेटीक्स पर रहने वाले कोशिकाओं में शायद ही स्थापित किया गया है, बैक्टीरियल झिल्ली में एक महत्वपूर्ण भूमिका होने के पार प्रोटॉन परिवहन के बावजूद सिग्नलिंग, homeostasis, और ऊर्जा उत्पादन12,13,14. वर्तमान अध्ययन में, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए ईत कैनेटीक्स पर प्रोटॉन परिवहन के प्रभाव की जांच करने के लिए एस oneidensis श्री-1 सेल का उपयोग कर पूरे सेल विद्युत माप है, जो दर में सीमित कदम की पहचान की आवश्यकता है माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन15।

संबंधित ईत पर प्रोटॉन परिवहन के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए एक सीधा रास्ता ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव (कीे) है । ड्यूटेरियम आयनों के साथ प्रोटान के प्रतिस्थापन पर इलेक्ट्रॉन अंतरण कैनेटीक्स में परिवर्तन के रूप में चौकसी कीे जाती है, जो इलेक्ट्रॉनक अंतरण कैनेटीक्स पर प्रोटॉन परिवहन के प्रभाव का प्रतिनिधित्व करती है जो16/ के सिद्धांत कीे ही अच्छी तरह से स्थापित किया गया है शुद्ध एंजाइमों के साथ विद्युत माप का उपयोग17. हालांकि, के बाद से एस oneidensis एमआर में वर्तमान उत्पादन-एकाधिक, विविध, और अस्थिर प्रक्रियाओं से 1 परिणाम18, एक बस दर सीमित प्रक्रिया के रूप में ईत की पहचान नहीं कर सकते । प्रोटॉन परिवहन ईत के साथ युग्मित प्रक्रियाओं पर गौर कीे, हम पुष्टि करते है कि माइक्रोबियल मौजूदा उत्पादन के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन द्वारा सीमित है ओम सी-इलेक्ट्रोड के लिए Cyts । इस प्रयोजन के लिए, हम ताजा मध्यम के साथ supernatant समाधान की जगह एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में इष्टतम पीएच और तापमान की स्थिति कीे माप से पहले एक उच्च एकाग्रता से युक्त; इस प्रतिस्थापन दो भूमिकाओं में कार्य किया: (1) यह ईत की तुलना में ऊपर चयापचय प्रक्रियाओं की दर में वृद्धि हुई है, और (2) काम कर इलेक्ट्रोड पर monolayer के oneidensis एमआर-1 से जारी supernatant में तैराकी कोशिकाओं का लोप करें ( इंडियम टिन-मैगनीज ऑक्साइड (इतो) इलेक्ट्रोड). प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल नए चिकित्सकों को बनाए रखने और पुष्टि करते है कि ईत प्रक्रिया दर निर्धारण कदम है मदद करना है ।

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Protocol

1. एक इतो इलेक्ट्रोड पर एस oneidensis एमआर-1 के एक Monolayer फिल्म का गठन (चित्रा 1)

नोट: अन्य रोगाणुओं के साथ विद्युत रिएक्टर के संदूषण को रोकने के लिए, सभी मीडिया, लागू करता है, और विद्युत रिएक्टर के घटकों अग्रिम में निष्फल किया जाना चाहिए. जब एस oneidensis एमआर-1 कोशिकाओं का उपयोग कर और विद्युत रिएक्टरों का निर्माण, सभी प्रक्रियाओं एक स्वच्छ पीठ पर आयोजित किया जाना चाहिए ।

  1. एस oneidensis एमआर-1 कोशिकाओं की खेती
    नोट: एस oneidensis एमआर-1 की एक monolayer की एक इतो इलेक्ट्रोड पर गठन किया गया था शर्तों के बाद पहले4की सूचना दी ।
    1. एस oneidensis एमआर-1 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, एस की एक कॉलोनी जोड़ें । oneidensis एमआर-1 एक आगर प्लेट पर उगाया Luria-Bertani (पौंड) (20 जी/एल) और bacto (15 जी/एल) में पौंड मध्यम (20 जी/एल) के 15 मिलीलीटर में 30 डिग्री सेल्सियस में 24 एच के लिए १६० rpm पर मिलाते के साथ एरोबिक स्थितियों में ।
    2. 10 मिनट के लिए ६,००० × g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, और निर्धारित माध्यम (पीएच ७.८) (डीएम: के 15 मिलीलीटर में परिणामी सेल गोली reसस्पेंड NaHCO3 [२.५ g/l], CaCl2· 2H2हे [०.०८ g/l], NH4सीएल [१.० g/l], MgCl2· 6H2O [०.२ g/l], NaCl [10 g/l], और 2-[4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic एसिड [HEPES; ७.२ g/l]), कार्बन के स्रोत के रूप में 10 मिमी स्तनपान और ०.५ जी/एल खमीर निकालने के साथ पूरक है, और तत्वों का पता लगाने के लिए एस oneidensis एमआर-1 क्रमशः.
    3. आगे १६० आरपीएम पर झटकों के साथ 12 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक और सेल निलंबन खेती और फिर से ६,००० × जी पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा डीएम माध्यम के साथ परिणामी सेल गोली धो दो बार ६,००० × जी में 10 मिनट के लिए विद्युत से पहले प्रयोग.
  2. एक तीन इलेक्ट्रोड विद्युत रिएक्टर का निर्माण (चित्रा 1)
    1. रिएक्टर के नीचे काम कर इलेक्ट्रोड के रूप में एक इतो सब्सट्रेट रखो.
    2. इसके बाद, एक ग्लास सिलेंडर (2 सेमी का व्यास) और एक polytetrafluoroethylene (PTFE) कवर डालें । फिर एजी/AgCl (KCl संतृप्त) और संदर्भ और काउंटर इलेक्ट्रोड के रूप में रिएक्टर में एक प्लैटिनम तार, क्रमशः डालें ।
      नोट: हवा और समाधान के रिसाव को रोकने के लिए, प्रत्येक घटक के बीच एक butyl रबर शीट डालें ।
    3. विद्युत रिएक्टर में 10 मिमी स्तनपान और ०.५ ग्राम/एल खमीर निकालने के साथ पूरक डीएम के ४.० मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. पुष्टि करने के बाद कि वहां विद्युत रिएक्टर से कोई रिसाव नहीं है, 20 मिनट से अधिक विद्युत रिएक्टर में नाइट्रोजन गैस प्रवाह को विद्युत रिएक्टर के अंदर anaerobic शर्तों को बनाए रखने ।
      नोट: अन्य रोगाणुओं के साथ संक्रमण को रोकने के लिए, गैस विद्युत रिएक्टर में बहती से पहले फ़िल्टर किया जाना चाहिए.
    5. विद्युत रिएक्टर को एक potentiostat से कनेक्ट करें और + ०.४ V (बनाम मानक हाइड्रोजन इलेक्ट्रोड, वह) इतो इलेक्ट्रोड पर लागू करें, एक बाहरी जल परिसंचरण प्रणाली का उपयोग करके 30 डिग्री सेल्सियस पर विद्युत रिएक्टर का तापमान रखते हुए ।
      नोट: एक बाहरी बिजली के क्षेत्र के प्रभाव को रोकने के लिए, विद्युत रिएक्टर एक फैराडे पिंजरे में रखा जाना चाहिए ।
  3. एस oneidensis एमआर-1 कोशिकाओं (चित्रा 1 और चित्रा 2) की विद्युत खेती
    1. १.१ चरण में प्राप्त निलंबन के सेल घनत्व को समायोजित ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर १.४३ के एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए 10 मिमी स्तनपान और ०.५ जी द्वारा पूरक और खमीर निकालने/
      नोट: सही आयुध डिपो६००प्राप्त करने के लिए, आयुध डिपो६०० ≤ ०.८ के लिए एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए १.४३ के लिए ओडी६०० समायोजित करने से पहले सेल निलंबन लागू होते हैं ।
    2. एक सिरिंज का उपयोग कर इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से विद्युत रिएक्टर में सेल निलंबन की ०.३ मिलीलीटर जोड़ें: आयुध डिपो में६०० रिएक्टर में परिवर्तन ०.१ ।
      नोट: के अलावा ०.३ एमएल सेल निलंबन के साथ आयुध डिपो६०० = १.४३ विद्युत रिएक्टर में ४.० मिलीलीटर मध्यम परिणाम के साथ समाधान की ४.३ मिलीलीटर में एक आयुध डिपो६०० = ०.१ । विभिंन संस्करणों के साथ अंय रिएक्टरों का उपयोग करते समय, कोशिका घनत्व की गणना की आवश्यकता है ।
    3. पर संभावित आवेदन जारी रखें + ०.४ वी (वह) के लिए इतो इलेक्ट्रोड के लिए 25 ज.
      नोट: एक इतो इलेक्ट्रोड पर एक monolayer के गठन के लिए, सुनिश्चित करें कि उत्पादित वर्तमान दर्शाती है एक विचलन से कम ५०% से चित्रा 2.

2.10 मिमी स्तनपान के साथ ताजा डीएम मध्यम के साथ Supernatant के प्रतिस्थापन (चित्रा 3)

  1. संभावित अनुप्रयोग रोकें और potentiostat और जल परिसंचरण प्रणाली से विद्युत रिएक्टर को डिस्कनेक्ट कर दें ।
  2. 10 मिमी स्तनपान के साथ ताजा डीएम मध्यम के साथ supernatant के प्रतिस्थापन
    1. एक बोतल में नाइट्रोजन गैस के साथ 10 मिमी स्तनपान कराने के साथ डीएम के माध्यम से ऑक्सीजन को दूर करने के लिए 20 मिनट ।
    2. धीरे से विद्युत रिएक्टर के अंदर सभी supernatant निकालें एक सिरिंज का उपयोग कर, नाइट्रोजन गैस बहने के तहत (चित्र 3ए, b) ।
      नोट: नाइट्रोजन गैस द्वारा इतो इलेक्ट्रोड पर फिल्म तोड़ने से बचने के लिए, गैस तरल सतह के ऊपर प्रवाह करना चाहिए.
    3. एक सिरिंज (चित्रा 3सी) का उपयोग कर 10 मिमी स्तनपान युक्त ताजा डीएम के ४.० मिलीलीटर जोड़ें.
      नोट: इतो इलेक्ट्रोड पर फिल्म तोड़ने से बचने के लिए, धीरे विद्युत रिएक्टर की दीवार के साथ मध्यम सुई. इस फिल्म को गीली रखने के लिए supernatant को हटाने के बाद मीडियम को तुरंत जोड़ देना चाहिए । supernatant के हटाने के बाद 1 मिनट तक के माध्यम का इंजेक्शन एस oneidensis एमआर-1 की फिल्म से मौजूदा उत्पादन पर असर नहीं पड़ता ।
    4. विद्युत रिएक्टर विद्युत रिएक्टर की दीवार से जुड़ी supernatant के सभी हटाने के लिए तिरछा ।
    5. चरण -8-2.2.4 कुल में तीन बार दोहराएँ ।
  3. गैस का प्रवाह रोकें और विद्युत रिएक्टर को potentiostat फिर से कनेक्ट करें, + ०.४ V (वह) इतो इलेक्ट्रोड को ३०३ K पर लागू करना ।

3. इसके अलावा ड्यूटेरियम पानी के उपाय कीे ईत प्रक्रिया पर (चित्रा 4)

  1. पुष्टि करें कि एस oneidensis एमआर-1 के एक monolayer से वर्तमान उत्पादन स्थिर है और तेजी से वृद्धि नहीं करता है । यदि वर्तमान में तेजी से बढ़ जाती है, जब तक प्रतीक्षा करें 10 मिनट से अधिक 5% वृद्धि के भीतर वर्तमान स्थिर ।
    नोट: अन्य माइक्रोबियल उपभेदों के संदूषण के बिना एक इतो इलेक्ट्रोड पर एक monolayer की एक फिल्म के गठन rDNA दृश्यों और एक इतो इलेक्ट्रोड पर एक फिल्म की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि द्वारा पुष्टि की गई थी, के रूप में पहले4की रिपोर्ट. ईत प्रक्रिया द्वारा दर सीमा की पुष्टि के लिए, गढ़शंकर इलेक्ट्रॉन मध्यस्थों जैसे १०० µ एम anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) को जोड़ने के प्रभाव पर नजर रखें । अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम और संदर्भ15 के अनुभाग देखें ।
  2. जोड़ें ४० µ एल के anoxic ५०% (v/v) डी2o विद्युत रिएक्टर में एक सिरिंज का उपयोग कर ऐसे कि एकाग्रता ०.५% है (v/v) d2o रिएक्टर में ।
    नोट: डी2ओ इसके अलावा द्वारा इस फिल्म के लिए नुकसान को रोकने के लिए, डी2ओ ड्रॉप वार सुई ।
  3. वर्तमान को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें, और बाद में ४.०% (v/v) करने के लिए D2O जोड़ें ।
    नोट: कीे मान (D2o और H2o की उपस्थिति में वर्तमान उत्पादन का अनुपात) को प्राप्त करने के लिए, वर्तमान उत्पादन पर एच2ओ इसके अलावा की एक ही मात्रा के प्रभाव की जांच करें ।

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Representative Results

+ ०.४ V पर संभावित आवेदन के 25 ज (बनाम वह) के बाद, एक monolayer फिल्म इतो ग्लास, जो पहले या तो एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या एक फोकल माइक्रोस्कोपी4द्वारा की पुष्टि की थी के काम इलेक्ट्रोड पर गठन किया गया था । एक monolayer फिल्म के गठन के दौरान एस oneidensis एमआर-1 से वर्तमान उत्पादन का प्रतिनिधि टाइम कोर्स चित्रा 2में दिखाया गया है । हालांकि मौजूदा हर माप में बदल, उत्पादन वर्तमान में एक विचलन का प्रदर्शन नहीं करता है ५०% से अधिक चित्रा 2 में मान यदि एक monolayerीय फिल्म समान रूप से बनाई है ।

10 मिमी स्तनपान के साथ ताजा डीएम के साथ supernatant के प्रतिस्थापन के बाद चयापचय प्रक्रियाओं की दर को अधिकतम करने के लिए और monolayer फिल्म धोने (चित्रा 3), एक स्थिर anodic वर्तमान (10 मिनट में लगभग 5% वृद्धि) के तहत मनाया जा सकता है + ०.४ वी (बनाम वह ) आवेदन (चित्रा 4a). यदि anodic वर्तमान तेजी से बढ़ जाती है, जब तक इंतजार वर्तमान स्थिर । यह बहुत संभव है कि खंड 2 में वर्णित supernatant प्रतिस्थापन के लिए प्रक्रियाओं को नुकसान कर सकते है और फिल्म पुनर्निर्माण हो सकता है ।

चित्रा 4a में ठोस लाइन डी2ओ इसके अलावा द्वारा प्रेरित माइक्रोबियल वर्तमान परिवर्तन के लिए प्रतिनिधि परिणाम है. १.०% के अलावा (v/v) डी2ओ तेजी से 10 एस के भीतर माइक्रोबियल वर्तमान में कमी आई है, जबकि लगभग कोई मौजूदा कमी एच2ओ ( चित्र 4a)15में बिंदीदार रेखा के अलावा द्वारा मनाया गया । इसी प्रवृत्ति को कम से कम चार पृथक प्रयोगों में reproduced किया गया. अंतिम ०.५% से २.०% से लेकर सांद्रता पर डी2ओ के अनुक्रमिक इसके अलावा (v/स्पष्ट रूप से वर्तमान उत्पादन में मजबूत दमन (चित्र 4a)15प्रदर्शन किया । क्योंकि सूक्ष्म जीवाणु वर्तमान उत्पादन धीरे-19शारीरिक प्रभाव के कारण बरामद होने की संभावना,20, कीे डी2ओ के अतिरिक्त के बाद जल्द ही वर्तमान कमी को सौंपा जाना चाहिए. पिछली रिपोर्ट में, हम15कीे कीमत की गणना करने के लिए डी2ओ के अलावा लगभग 10 मिनट में वर्तमान उत्पादन एकत्र ।

दो विधियों का उपयोग करते हुए, हमने पुष्टि की है कि डी2ओ इसके अलावा द्वारा मनाया वर्तमान कमी ईत पर ओम सी-Cyts परिसर के माध्यम से कीे विशेषता है । सबसे पहले, हम 1 µ एम riboflavin (आरएफ) या फ्लेविन mononucleotide (FMN) के पहले विद्युत रिएक्टर में और डी2O इसके अलावा, जो ईत एस oneidensis एमआर-1 में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद जोड़ा । एस oneidensis एमआर-1 के मामले में, flavins विशेष रूप से कुछ ही सेकंड में ओम सी-Cyts के साथ बाध्यकारी द्वारा ईत प्रक्रिया में तेजी लाने, क्योंकि गैर flavins बाध्यकारी आबंध के रूप में cofactors समारोह में21,22, 23. इसलिए, फ्लेविन अतिरिक्त द्वारा एक पल anodic वर्तमान वृद्धि ओम सी-Cyts (चित्रा 5) के माध्यम से ईत प्रक्रिया द्वारा दर सीमा इंगित करता है । हमने आगे गढ़शंकर पर इलेक्ट्रॉनक मध्यस्थों कीे प्रभाव की पुष्टि की । छोटे redox अणुओं, जैसे, anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS), इलेक्ट्रोड के लिए माइक्रोबियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला से फैलाना द्वारा ईत प्रक्रिया को समाप्त, ओम सीके माध्यम से प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन परिवहन के बजाय-Cyts15 , 24. यहां १०० µ मीटर α-AQS के अलावा 5 से अधिक गुना (चित्रा 4b) द्वारा मौजूदा उत्पादन बढ़ाया, जो इंगित करता है कि चयापचय प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स ईत प्रक्रिया दर सीमित कदम बनाने के लिए काफी तेजी से कर रहे हैं । लगातार, वर्तमान उत्पादन α द्वारा मध्यस्थता-AQS डी2ओ इसके अलावा (चित्रा 4b) से अप्रभावित रहे, का प्रदर्शन है कि डी2ओ द्वारा चयापचय प्रतिक्रियाओं में संभावित देरी के कारण नहीं बड़ी कीे संख्या में मनाया चित्र 4a .

ओम सी-Cyts के साथ इलेक्ट्रॉनक परिवहन कीे ओर गौर करने के लिए इन दोनों दृष्टिकोणों का संयोजन इस रिपोर्ट के महत्वपूर्ण बिन्दु है और विशेष रूप से गढ़शंकर में इलेक्ट्रॉन मध्यस्थों को अन्य electroactive के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, एक बार हम पुष्टि की है कि वर्तमान परिवर्तन ईत प्रक्रिया को सौंपा है, हम ओम सी-Cyts या एक ओम सीके साथ जुड़े फ्लेविन के एक आंशिक विलोपन उत्परिवर्ती के प्रभाव का आकलन सकता है-Cyts की तुलना द्वारा प्रोटॉन हस्तांतरण कैनेटीक्स में दोनों मामले15. जब डी2ओ ओम सी-Cyts के साथ FMN बंधन की उपस्थिति में जोड़ा गया था, मौजूदा कमी इस तरह कम है कि यह FMN के बिना कि से छोटा था, यह दर्शाता है कि FMN के बंधन प्रोटॉन परिवहन मार्ग और उसके कैनेटीक्स बदल गया था (चित्रा 4c)15.

Figure 1
चित्रा 1: विद्युत रिएक्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया. निर्माण से पहले विद्युत सेल की तस्वीर (एक) और निर्माण के बाद (बी) । (c) विद्युत रिएक्टर की योजनाबद्ध चित्रण के बाद विद्युत टीका के 25 ज + ०.४ वी बनाम वह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि वर्तमान उत्पादन से एस oneidensis श्री-1 एक इतो इलेक्ट्रोड पर monolayer फिल्म गठन के दौरान. एक तीर विद्युत रिएक्टर में सेल निलंबन के अलावा के समय को इंगित करता है । एक ही प्रवृत्ति कम से कम पांच व्यक्तिगत प्रयोगों में reproduced किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:10 मिमी स्तनपान के साथ ताजा परिभाषित मध्यम (डीएम) के लिए supernatant के प्रतिस्थापन. (क) तरल सतह के ऊपर नाइट्रोजन गैस का प्रवाह. (ख) विद्युत रिएक्टर से supernatant को हटाना । (ग) ४.० मिलीलीटर ताजा डीएम 10 मिमी स्तनपान युक्त के अलावा । यम वर्धन के बाद रिएक्टर की दीवार से जुड़ी supernatant को हटाने के लिए रिएक्टर को तिरछा किया जाना चाहिए । इन प्रक्रिया (a-c) कुल में तीन बार आचरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: डी2के प्रभाव एस oneidensis एमआर-1 के एक monolayer फिल्म से वर्तमान उत्पादन पर अतिरिक्त । एस के एक monolayer की फिल्म के लिए समय बनाम वर्तमान उत्पादन । 10 मिमी स्तनपान युक्त एक विद्युत प्रणाली में oneidensis एमआर-1 (ए), एक अतिरिक्त १०० µ एम anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) (ख), या एक अतिरिक्त 2 µ एम फ्लेविन mononucleotide (FMN) (c) । इसी प्रवृत्ति को कम से कम चार व्यक्तिगत प्रयोगों में reproduced किया गया था । तीर डी2o (ठोस रेखा) या H2o (डॉटेड रेखा) के जोड़ के समय को इंगित करता है । डॉटेड रेखा के संगत डेटा को सॉलिड लाइन डेटा में केवल D2के अतिरिक्त डेटा पॉइंट के लिए सामान्यीकृत किया गया था । विद्युत रिएक्टर में डी2की एकाग्रता दर्शाई गई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: flavins के अलावा एस oneidensis एमआर-1 के एक monolayer से मौजूदा उत्पादन में दर-निर्धारण कदम का आकलन । एस oneidensis एमआर-1 की एक monolayer की उपस्थिति में 10 मिमी स्तनपान (ठोस लाइन), १.० मिमी स्तनपान (डैश्ड लाइन), और ०.१ मिमी स्तनपान (बिंदीदार रेखा) से वर्तमान उत्पादन के समय बनाम । एक तीर उस समय बिंदु को इंगित करता है जिस पर 1 µ m फ्लेविन mononucleotide (FMN) को विद्युत रिएक्टरों में जोड़ा गया था । 10 मिमी स्तनपान की उपस्थिति में, FMN के अलावा काफी मौजूदा उत्पादन में वृद्धि हुई है, का प्रदर्शन है कि extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन (ईत) के माध्यम से सीप्रकार cytochrome परिसरों बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली में एंबेडेड (ओम सी -Cyts) का दर निर्धारण है. विद्युत रिएक्टर में कम स्तनपान एकाग्रता FMN अलावा द्वारा एक छोटे वर्तमान वृद्धि का कारण बनता है, यह दर्शाता है कि ऊपर से इलेक्ट्रॉन की आपूर्ति के लिए ऊपर चयापचय प्रतिक्रियाओं ओम c-Cyts धीरे से ईत दर से धीमी हो गई । एक ही प्रवृत्ति के कम से कम दो व्यक्तिगत प्रयोगों में reproduced था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हमारे पूरे सेल विद्युत परख प्रोटीन electrochemistry के साथ तुलना में कई तकनीकी लाभ है । जबकि प्रोटीन शुद्धि बहु कदम समय लेने वाली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है, हमारे पूरे सेल विधि सेल संस्कृति के बाद स्वयं के एक दिन का आयोजन किया-सह फिल्म गठन लेता है । ओम सी-Cyts और इलेक्ट्रोड के बीच एक स्थिर संपर्क को प्राप्त करने के लिए, हम केवल नसबंदी और इलेक्ट्रोड सतह की सफाई की जरूरत है; यह प्रोटीन4के उंमुखीकरण के आयोजन के लिए इलेक्ट्रोड संशोधन की आवश्यकता नहीं है, जैसे, एस oneidensis एमआर-1 आंतरिक रूप से इलेक्ट्रोड पर देता है, जबकि एक ही दिशा में ओम सी-Cyts ओरिएंट25 , 26 , 27. इसके विपरीत प्रोटीन की विद्युत प्रतिक्रियाओं में redox स्थलों के बीच की दूरी से ही संवेदनशील होते हैं और इलेक्ट्रोड्स में भी इसका प्रभाव होता है; इस प्रकार, शुद्ध प्रोटीन ध्यान से28,29उंमुख होना चाहिए । इससे भी महत्वपूर्ण बात, पूरे सेल विद्युत परख सीधे ओम सी-Cyts अंय झिल्ली प्रोटीन के साथ संभव बातचीत के साथ एक लिपिड झिल्ली में एंबेडेड परिसर की विशेषता है, और इसलिए ओम सी में देशी प्रोटॉन प्रबंधन को दर्शाता है -Cyts (यह अक्सर शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर नकल करने के लिए मुश्किल है) ।

हालांकि, हमारी तकनीक डी 2 o की एकाग्रता के संबंध में एक सीमा है, d2o की उच्च सांद्रता संभावित रूप से चयापचय प्रक्रियाओं और विकास19को धीमा; इसलिए, हमने D2O सांद्रता का उपयोग करते हुए प्रयोग किए हैं, जो इस प्रोटोकॉल में 4% (v/v) से कम थे । इसके अलावा, क्योंकि रोगाणुओं में जीन अभिव्यक्ति एक जटिल तरीके से विनियमित है, छोटे सशर्त मतभेद दृढ़ता से माइक्रोबियल phenotype और यहां तक कि इलेक्ट्रॉन परिवहन कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकता है । विशेष रूप से, एस oneidensis एमआर-1 से वर्तमान उत्पादन के दौरान स्तनपान कराने की एकाग्रता कम हो जाती है; इसलिए, दर-सीमित प्रक्रिया में बदलाव के लिए ऊपर की चयापचय प्रतिक्रियाओं से पहले कीे प्रयोगों का संचालन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

सबसे विचारणीय बिन्दु कीे सफलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए इस दशा को स्पष्ट और पुष्ट करना है कि ओम सी-Cyts के माध्यम से इलेक्ट्रॉनक परिवहन पूरे सेल विद्युत परख कर वर्तमान उत्पादन की दर की सीमा पर नजर रखे. इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे पुष्टि करने के लिए कि ईत सीमा की दर और माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन को दर्शाता है समझाओ । हम दो तरीकों का एक संयोजन की शुरुआत की; फ्लेविन अलावा23, और डी2ओ इसके अलावा एक फैलाना इलेक्ट्रॉन मध्यस्थ की उपस्थिति में, जैसे, α-AQS15 (चित्रा 4 और चित्रा 5) द्वारा वर्तमान परिवर्तन का अवलोकन । यदि एक ईत प्रक्रिया दर सीमित नहीं कर सकते हैं, सबसे संभावित कारण अधूरा गठन या monolayer की शारीरिक टुकड़ी होगा फिल्म, या अंय रोगाणुओं द्वारा संदूषण । हम दृढ़ता से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग द्वारा monolayer की फिल्म के गठन की पुष्टि की सिफारिश । यह बहुत संभव है कि मध्यम प्रतिस्थापन की प्रक्रिया को इस फिल्म को नुकसान; इसलिए, हटाने और मध्यम के इंजेक्शन धीरे से आयोजित किया जाना चाहिए, और नाइट्रोजन गैस तरल सतह (चित्रा 3) के ऊपर प्रवाह करना चाहिए । यदि एक समान monolayer फिल्म ईत प्रक्रिया दर सीमित नहीं है, यह सबसे अच्छा है मध्यम घटकों और माप की स्थिति की जांच, उदा, 10 मिमी से अधिक एकाग्रता के लिए स्तनपान की पूरकता, के आगे त्वरण के लिए ऊपर चयापचय प्रक्रियाओं । ये विचार ईत-सक्षम रोगाणुओं के अंय प्रकारों में भी महत्वपूर्ण हैं । इलेक्ट्रॉन मध्यस्थों विशेष रूप से पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ईत प्रक्रिया दर-बैक्टीरियल उपभेदों के मिश्रण सहित ईत-सक्षम रोगाणुओं के अंय प्रकारों में सीमित है; इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल पर विचार करने के लिए एक सामांय विधि के रूप में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन परिवहन पर प्रोटान के काइनेटिक प्रभाव की जांच बैक्टीरिया/इलेक्ट्रोड अंतरफलक । यह देखते हुए कि ईत अंय माइक्रोबियल उपभेदों और consortia में मनाया जाता है, जहां तक ईत प्रक्रिया दर सीमित है, इस प्रोटोकॉल को anaerobic लोहे की जंग और मीथेन ऑक्सीकरण प्रक्रियाओं में माइक्रोबियल श्वसन अध्ययन के रूप में अच्छी तरह से लागू है कि में माइक्रोबियल ईंधन की कोशिकाओंको30,31।

ओम सी-Cyts के जरिए ईत की दर-सीमित प्रक्रिया के साथ एस oneidensis एमआर-1 monolayer फिल्म की हमारी प्रणाली न केवल कीे प्रयोगों के लिए बल्कि ओम सी-Cyts के जैव रासायनिक लक्षण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, flavins के विभिंन सांद्रता कि ओम सीके लिए cofactors के रूप में बांध के अलावा-Cyts ठहराव के गठन के लिए (कश्मीरडी ~ 10 पृथक्करण एम) की अनुमति होगी विद्युत µ-बाध्य ओम सी- Cyts परिसरों३२,३३,३४। इसके अलावा, हमारे हाल के काम का प्रदर्शन किया है कि ओम सीCyts के माध्यम से व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन backflow प्रक्रिया कैथोडिक वर्तमान उत्पादन३३,३४के माध्यम से विशेषता हो सकती है । यह प्रस्ताव किया गया है कि इलेक्ट्रॉन backflow chemiosmotic एटीपी संश्लेषण के लिए एक स्रोत के रूप में ओम भर में प्रोटॉन आयात के साथ जुड़ा हुआ है३५; इसलिए, यह महान ब्याज की है ओम सी-Cyts में इलेक्ट्रॉन backflow कैनेटीक्स पर प्रोटान के प्रभाव की जांच ।

अंत में हमने तकनीक विकसित कर ओम सी-Cyts के माध्यम से ईत पर ड्यूटेरियम कीे जांच करने के लिए oneidensis एमआर-1 का उपयोग कर रहे हैं । तकनीक ओम सी-Cyts के रूप में अच्छी तरह से कीे प्रेक्षण के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह संभवतः अंय electrogenic रोगाणुओं के लिए लागू है । हमें विश्वास है कि इस पद्धति को vivo मेंओम सी-Cyts के जरिए सीधे ईत की जांच करने की एक सामान्य तकनीक हो सकती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम आर्थिक रूप से जापान सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI अनुदान संख्या २४००००१०, 17H04969, और JP17J02602, अमेरिका के नौसेना अनुसंधान ग्लोबल (N62909-17-1-2038) के कार्यालय से विशेष रूप से पदोन्नत अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था । Y.T. एक JSPS अनुसंधान साथी है और अग्रणी स्नातक स्कूलों (योग्यता) के लिए कार्यक्रम के माध्यम से JSPS द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

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References

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जैव रसायन १३४ अंक पूरे सेल electrochemistry cytochromes धातु बैक्टीरिया को कम करने प्रोटॉन स्थानांतरण फ्लेविन bioelectrochemistry माइक्रोबियल ईंधन कोशिकाओं electroactive जैव फिल्म
विद्युत डिटेक्शन ऑफ ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव में Extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन पर <em>Shewanella oneidensis</em> एमआर-1
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Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

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