Summary
Qui presentiamo un protocollo della intero-cellula elettrochimici esperimenti per studiare il contributo del trasporto di protoni per il tasso di trasporto dell'elettrone extracellulare attraverso il membrana esterna citocromi complessi di Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Diretta rilevazione elettrochimica di c-tipo complessi citocromo incorporati nella membrana esterna batterica (membrana esterna c-tipo complessi citocromo; OM c- Cyts) ha recentemente è emerso come un nuovo metodo analitico della intero-cellula per caratterizzare il trasporto dell'elettrone batterico dalla catena respiratoria all'esterno delle cellule, definito come il trasporto dell'elettrone extracellulare (EET). Mentre la via e la cinetica del flusso dell'elettrone durante la reazione di EET sono stati indagati, un metodo elettrochimico di cellule intere di esaminare l'impatto del trasporto dei cationi associato EET non è ancora stato stabilito. Nello studio presente, un esempio di una tecnica biochimica per esaminare l'effetto di isotopo cinetico di deuterio (KIE) su EET attraverso OM c- Cyts utilizzando un microbo modello, Shewanella oneidensis MR-1, è descritto. KIE sul processo EET può essere ottenuto se la EET attraverso OM c- Cyts agisce come la tappa limitante nella produzione corrente microbica. A tal fine, prima dell'aggiunta di D2O, il supernatante è stato sostituito con fresco che contenevano una quantità sufficiente del donatore dell'elettrone per sostenere il tasso di reazioni metaboliche a Monte e per rimuovere le cellule planctoniche da un'uniforme monostrato biofilm sull'elettrodo di lavoro. Metodi alternativi per confermare il tasso-di limitazione passo nella produzione corrente microbica come EET attraverso OM c- Cyts inoltre sono descritti. La nostra tecnica di analisi elettrochimica della intero-cellula per studiare la cinetica del trasporto di protoni può essere applicato ad altri ceppi microbici elettroattivi.
Introduction
Tecniche elettrochimiche direttamente caratterizzare una proteina redox in una cellula batterica intatta sono recentemente emersi dalla scoperta del metallo-riducentesi di ceppi microbici, quali S. oneidensis MR-1 o Geobacter sulfurreducens PCA, che hanno complessi di citocromo c-tipo di membrana esterna (OM c-Cyts) esposti al cellulare esterna1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts mediano il trasporto di elettroni dalla catena respiratoria a substrati solidi trova extracellularly. Questo trasporto è indicato come extracellulare trasporto dell'elettrone (EET)1,6 ed è un processo critico per le biotecnologie emergenti, ad esempio celle a combustibile microbico6. Di conseguenza, per comprendere la cinetica EET sottostante e meccanismi e relativo collegamento alla fisiologia microbica, OM c -Cyts sono stati studiati usando della intero-cellula elettrochimica4,7, combinato con la microscopia 8 , 9, spettroscopia10,11e biologia molecolare2,4. Al contrario, metodi per studiare l'impatto EET-collegata del trasporto dei cationi, ad esempio, protoni, sulla cinetica EET in cellule viventi sono stati stabiliti a malapena nonostante trasporto di protoni attraverso le membrane batteriche, avendo un ruolo critico nel segnalazione, omeostasi ed energia produzione12,13,14. Nello studio presente, descriviamo una tecnica per esaminare l'impatto del trasporto protone sulla cinetica EET in S. oneidensis MR-1 cellula usando cellule intere misure elettrochimiche, che richiede l'individuazione del passaggio limitante microbica attuale produzione15.
Un modo diretto per valutare il contributo del trasporto di protoni sulla EET associato è l'effetto isotopico cinetico di deuterio (KIE). Il KIE è osservabile come il cambiamento nella cinetica di trasferimento di elettroni sulla sostituzione di protoni con ioni di deuterio, che rappresenta l'impatto del trasporto di protoni su elettrone trasferimento cinetica16. La teoria di KIE stessa è stata stabilita in bene utilizzando misure elettrochimiche con enzimi purificati17. Tuttavia, poiché la produzione corrente in S. oneidensis MR-1 deriva da multiple, processi diversi e fluttuante18, uno non può identificare semplicemente EET come il processo di limitazione della velocità. Per osservare il KIE il protone processi di trasporto accoppiato con EET, abbiamo bisogno di confermare che l'attuale produzione microbica è limitata dal trasporto di elettroni tramite OM c- Cyts all'elettrodo. Per questo scopo, abbiamo sostituito il supernatante con medium fresco contenente un'alta concentrazione di lattato come un donatore di elettroni ai pH ottimale e le condizioni di temperatura prima misurazione KIE; Questa sostituzione servito due ruoli: (1) ha migliorato il tasso dei processi metabolici a monte rispetto alla EET e (2) le cellule di nuoto nel surnatante rilasciato dal biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su elettrodo di lavoro (omesso elettrodo di Indio ossido drogato con stagno (ITO)). Il protocollo dettagliato presentato è destinato per mantenere e confermare che il processo EET è il punto tasso-determinazione nuovi praticanti.
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Protocol
1. formazione di un Biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su un elettrodo ITO (Figura 1)
Nota: Per evitare la contaminazione del reattore elettrochimico con altri microbi, tutti i media, implementa e componenti del reattore elettrochimico dovrebbero essere sterilizzati in anticipo. Quando usando le cellule di S. oneidensis MR-1 e costruire i reattori elettrochimici, tutte le procedure devono essere effettuate su un banco pulito.
- Coltura di cellule di S. oneidensis MR-1
Nota: Un biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 è stato formato su un ITO elettrodo seguendo le condizioni segnalate precedentemente4.- Per far crescere le cellule di S. oneidensis MR-1, aggiungere una colonia di S. oneidensis MR-1 cresciuta su una piastra di agar composto da Luria-Bertani (LB) (20 g/L) e agar di bacto (15 g/L) in 15 mL di LB medium (20 g/L) a 30 ° C per 24 h in condizioni aerobiche con agitazione a 160 giri/min.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 6.000 × g per 10 min e risospendere il pellet cellulare risultante in 15 mL di medium definito (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] e 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] acido etansolfonico [HEPES; 7,2 g/L]), supplementato con lattato di 10 mM e 0,5 g/L estratto di lievito come fonte di carbonio e oligoelementi per S. oneidensis MR-1 , rispettivamente.
- Coltivare la sospensione cellulare aerobicamente a 30 ° C per 12 ore con agitazione a 160 giri/min e centrifugare nuovamente a 6.000 × g per 10 min. lavare il pellet cellulare risultante due volte con il mezzo di DM mediante centrifugazione per 10 min a 6.000 × g prima l'elettrochimica ulteriormente esperimento.
- Costruzione di un reattore elettrochimico di tre elettrodi (Figura 1)
- Mettere un substrato di ITO come l'elettrodo di lavoro nella parte inferiore del reattore.
- Successivamente, inserire un cilindro di vetro (diametro di 2 cm) e una cover di politetrafluoroetilene (PTFE). Quindi inserire Ag/AgCl (KCl saturata) e un filo di platino nel reattore come gli elettrodi di riferimento e contatore, rispettivamente.
Nota: Per evitare la fuoriuscita di aria e soluzione, inserire un foglio di gomma butilica tra ogni componente. - Aggiungere 4,0 mL di DM completati con lattato di 10mm ed Estratto di lievito 0,5 g/L nel reattore elettrochimico.
- Dopo aver confermato che non ci siano perdite dal reattore elettrochimico, flusso del gas di azoto nel reattore elettrochimico oltre 20 min per mantenere condizioni anaerobiche all'interno del reattore elettrochimico.
Nota: Per evitare la contaminazione con altri microbi, il gas deve essere filtrato prima che fluisce nel reattore elettrochimico. - Collegare il reattore elettrochimico per un potenziostato e applicare + 0,4 V (contro elettrodo standard a idrogeno, lei) all'elettrodo ITO, mantenendo la temperatura del reattore elettrochimico a 30 ° C, utilizzando un sistema di circolazione dell'acqua esterna.
Nota: Per evitare l'effetto di un campo elettrico esterno, il reattore elettrochimico deve essere messi in una gabbia di Faraday.
- Elettrochimico coltivazione delle cellule di S. oneidensis MR-1 (Figura 1 e Figura 2)
- Regolare la densità delle cellule della sospensione ottenuta nel passaggio 1.1 per una densità ottica di 1,43 a 600 nm (OD600) con DM completati da lievito di lattato e 0,5 g/L di 10 mM estrarre.
Nota: Per ottenere il corretto OD600, applicare la sospensione cellulare OD600 ≤ 0,8 ad uno spettrometro UV-vis prima di regolare il OD600 alla 1.43. - Aggiungere 0,3 mL della sospensione delle cellule nel reattore elettrochimico attraverso la porta di iniezione con una siringa: la OD600 nel reattore cambia a 0.1.
Nota: L'aggiunta di 0,3 mL di sospensione cellulare con OD600 = 1,43 nel reattore elettrochimico contenente 4,0 mL risultati medi in 4,3 mL della soluzione con un OD600 = 0.1. Quando si utilizzano altri reattori con volumi diversi, il calcolo della densità delle cellule è richiesto. - Continuare l'applicazione potenziale a + 0,4 V (contro lei) all'elettrodo ITO per 25 h.
Nota: Per la formazione di un biofilm monostrato su un elettrodo ITO, accertarsi che la corrente prodotta esibisce una deviazione inferiore al 50% dalla Figura 2.
- Regolare la densità delle cellule della sospensione ottenuta nel passaggio 1.1 per una densità ottica di 1,43 a 600 nm (OD600) con DM completati da lievito di lattato e 0,5 g/L di 10 mM estrarre.
2. sostituzione del surnatante con Medium fresco DM con 10 mM di lattato (Figura 3)
- Arrestare l'applicazione potenziale e staccare il reattore elettrochimico il potenziostato e il sistema di circolazione dell'acqua.
- Sostituzione del surnatante con medium fresco DM con 10 mM di lattato
- Flusso del gas di azoto in una bottiglia contenente DM con 10 mM di lattato oltre 20 minuti per rimuovere l'ossigeno dal mezzo.
- Rimuovere lentamente tutto il supernatante all'interno del reattore elettrochimico, utilizzando una siringa, sotto che scorre gas azoto (Figura 3a, b).
Nota: Per evitare di rompere il biofilm sull'elettrodo ITO di gas dell'azoto, il gas dovrebbe scorrere sopra la superficie del liquido. - Aggiungere 4,0 mL di fresco DM contenenti lattato 10 mM utilizzando una siringa (Figura 3C).
Nota: Per evitare di rompere il biofilm sull'elettrodo ITO, iniettare lentamente il mezzo lungo la parete del reattore elettrochimico. Per mantenere il biofilm bagnato, il mezzo deve essere aggiunto subito dopo la rimozione del surnatante. Iniezione della media fino a 1 min dopo la rimozione del surnatante non influisce la produzione attuale dal biofilm di S. oneidensis MR-1. - Inclinano il reattore elettrochimico per rimuovere tutti del surnatante attaccato al muro del reattore elettrochimico.
- Ripetere i passaggi 2.2.2-2.2.4 tre volte in totale.
- Interrompere il flusso di gas e collegare il reattore elettrochimico per il potenziostato ancora una volta, l'applicazione + 0,4 V (contro lei) all'elettrodo ITO k. 303
3. aggiunta di acqua di deuterio per misurare il KIE sul processo EET (Figura 4)
- Confermare che la produzione attuale da un monostrato di biofilm di S. oneidensis MR-1 è stabile e non aumenta rapidamente. Se la corrente aumenta ripidamente, attendere fino a quando la corrente si stabilizza all'interno di un aumento del 5% su 10 min.
Nota: La formazione di un biofilm monostrato su un elettrodo ITO senza contaminazione di altri ceppi microbici è stata confermata da sequenze di rDNA e una scansione immagine microscopica dell'elettrone del biofilm su un elettrodo ITO, come riferito precedentemente4. Per la conferma della limitazione tasso dal processo EET, monitorare l'effetto dell'aggiunta di spola elettrone mediatori quali 100 µM antrachinone-1-solfonato (α-AQS). Vedere la sezione di Risultati rappresentante e fare riferimento a15 per ulteriori dettagli. - Aggiungere 40 µ l di anossico 50% (v/v) D2O nel reattore elettrochimico usando una siringa, tale che la concentrazione è 0.5% (v/v) D2O nel reattore.
Nota: Per evitare danni al biofilm da aggiunta2O D, iniettare la D2O drop-wise. - Attendere che la corrente stabilizzare e successivamente aggiungere la D2O fino a 4,0% (v/v).
Nota: Per ottenere il valore KIE (il rapporto di produzione corrente in presenza D2O e H2O), verificare l'effetto dello stesso volume di aggiunta di2O H sulla produzione attuale.
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Representative Results
Dopo 25 h di potenziale applicazione a + 0,4 V (contro di lei), si formò un biofilm monostrato sull'elettrodo di lavoro di vetro di ITO, che precedentemente è stato confermato da una microscopia elettronica di esame o un microscopio confocale4. Il corso di tempo rappresentativo della produzione corrente dal S. oneidensis MR-1 durante la formazione di un biofilm monostrato è illustrato nella Figura 2. Anche se la corrente varia in ogni misura, la corrente prodotta non presenta una deviazione di oltre il 50% dal valore nella Figura 2 se un biofilm monostrato è formato in modo uniforme.
Dopo il rimontaggio del surnatante con DM fresco con il lattato di 10 mM per massimizzare il tasso di processi metabolici e lavare il biofilm monostrato (Figura 3), una corrente anodica stabile (circa il 5% aumento in 10 min) può essere osservata sotto + 0,4 V (contro di lei ) applicazione (Figura 4a). Se la corrente anodica aumenta ripidamente, attendere fino a quando la corrente si stabilizza. È altamente possibile che le procedure per la sostituzione del surnatante descritto nella sezione 2 possono danneggiare il biofilm e ricostruzione può verificarsi.
La linea continua in Figura 4a è il risultato rappresentativo per il cambiamento di corrente microbico indotto tramite l'aggiunta di2O D. L'aggiunta di 1,0% (v/v) D2O nettamente diminuita la corrente microbica entro 10 s, mentre quasi nessuna diminuzione corrente è stata osservata con l'aggiunta di H2O (linea tratteggiata in Figura 4a)15. La stessa tendenza è stata riprodotta in almeno quattro esperimenti separati. L'aggiunta sequenza di D2O alle concentrazioni finali che vanno da 0,5% al 2,0% (v/v) chiaramente esposto forte soppressione dell'attuale produzione (Figura 4a)15. Perché l'attuale produzione microbica ha recuperato gradualmente probabilmente dovuto l'effetto fisiologico19,20, KIE deve essere assegnato alla diminuzione corrente subito dopo l'aggiunta di D2O. In una precedente relazione, abbiamo raccolto la produzione attuale a circa 10 min dopo l'aggiunta di D2O per calcolare il valore di KIE15.
Utilizzando due metodi, abbiamo confermato che l'attuale diminuzione osservata tramite l'aggiunta di2O D è attribuibile a KIE su EET attraverso il complesso di - Cyts cOM. In primo luogo, abbiamo aggiunto 1 µM riboflavina (RF) o flavina mononucleotide (FMN) nel reattore elettrochimico prima e dopo l'aggiunta di2O D, che può essere usato per studiare EET in S. oneidensis MR-1. Nel caso di S. oneidensis MR-1, Flavine specificamente accelerano il processo di EET legandosi con OM c- Cyts in pochi secondi, perché i Flavine funzionano come grippaggio non covalente cofattori21,22, 23. Pertanto, un aumento di corrente anodico istantaneo da aggiunta di flavin indica limitazione dal processo EET via OM c- Cyts (Figura 5). Abbiamo confermato ulteriormente l'effetto di mediatori dell'elettrone la spola su KIE. Le molecole redox piccolo, ad esempio, dell'antrachinone-1-solfonato (α-AQS), terminare il processo EET diffondendo dalla catena di trasporto dell'elettrone microbica all'elettrodo, invece di trasporto dell'elettrone diretto via OM c- Cyts15 , 24. qui, l'aggiunta di 100 µM α-AQS migliorato la produzione corrente di più di 5 volte (Figura 4b), che indica che la cinetica delle reazioni metaboliche sono abbastanza veloci per rendere la EET elaborare il passaggio limitante. Coerentemente, produzione corrente mediata da α-AQS è rimasto inalterato tramite l'aggiunta di2O D (Figura 4b), dimostrando che il ritardo potenziale nelle reazioni metaboliche di D2O non causa il grande KIE osservata in Figura 4a .
La combinazione di questi due approcci per osservare il KIE il trasporto dell'elettrone con OM c- Cyts è il punto critico di questa relazione, e in particolare, può essere applicabile a altri biofilm elettroattivi spola mediatori dell'elettrone. Inoltre, una volta che abbiamo confermato che l'attuale cambiamento è assegnato al processo EET, abbiamo potuto valutare l'effetto di un mutante di delezione parziale di OM c- Cyts o una flavina associato OM c- Cyts sul protone trasferimento cinetica confrontando il KIE in entrambi casi15. Quando è stato aggiunto D2O in presenza di FMN vincolante con OM c- Cyts, la diminuzione di corrente è stata ridotta tale che era più piccola di quella senza FMN, che indica che l'associazione di FMN alterato la via di trasporto del protone e la sua cinetica (Figura 4C)15.
Figura 1: reattore elettrochimico utilizzato in questo studio. Fotografia della cella elettrochimica prima costruzione (un) e dopo la costruzione (b). (c) illustrazione schematica del reattore elettrochimico dopo 25 h di inoculazione elettrochimico a + 0,4 V vs lei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: produzione attuale rappresentativo da S. oneidensis MR-1 durante la formazione di biofilm monostrato su un elettrodo ITO. Una freccia indica il tempo dell'aggiunta della sospensione delle cellule nel reattore elettrochimico. La stessa tendenza è stata riprodotta in almeno cinque singoli esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sostituzione del surnatante a medium definito fresco (DM) con il lattato di 10 mM. (un) gas azoto flusso sopra la superficie del liquido. (b) rimozione del surnatante dal reattore elettrochimico. (c) aggiunta di 4,0 mL fresco DM contenenti lattato di 10 mM. Dopo l'aggiunta di media, il reattore deve essere inclinato per eliminare il surnatante attaccato al muro del reattore. Condurre la procedura (una–c), questi tre volte in totale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetto dell'aggiunta di2O D sulla produzione attuale da un monostrato di biofilm di S. oneidensis MR-1. Tempo versus produzione corrente per un biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 in un sistema elettrochimico contenenti 10 mM lattato (una), un antrachinone-1-solfonato di ulteriori 100 µM (α- AQS) (b), o un ulteriore 2 µM flavina mononucleotide (FMN) (c). La stessa tendenza è stata riprodotta in almeno quattro singoli esperimenti. Le frecce indicano il tempo dell'aggiunta di D2O (linea continua) o H2O (linea tratteggiata). I dati corrispondenti alla linea tratteggiata sono stati normalizzati al punto di dati appena prima dell'aggiunta di D2O nei dati di linea continua. La concentrazione di D2O nel reattore elettrochimico è indicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: valutazione di determinare il tasso di passaggio nella produzione corrente da un monostrato biofilm di S. oneidensis MR-1 con l'aggiunta di Flavine. Tempo versus produzione attuale da un monostrato di biofilm di S. oneidensis MR-1 in presenza di lattato di 10 mM (linea continua), lattato di 1,0 mM (linea tratteggiata) e lattato di 0,1 mM (linea tratteggiata). Una freccia indica il punto di tempo quale 1 μm flavina mononucleotide (FMN) è stato aggiunto nei reattori elettrochimici. In presenza di lattato di 10 mM, l'aggiunta di FMN drasticamente aumentato la produzione attuale, dimostrando che il trasporto dell'elettrone (EET) extracellulare attraverso c-tipo complessi citocromo incorporati nella membrana esterna batterica (OM c - Cyts) è il tasso-determinazione. Meno lattato concentrazione nel reattore elettrochimico causato un aumento di corrente più piccolo da aggiunta FMN, che indica che il rifornimento di elettroni dalle reazioni metaboliche a Monte a OM c- Cyts divenne gradualmente più lento del tasso EET. La stessa tendenza è stata riprodotta in almeno due singoli esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nostra analisi elettrochimica della intero-cellula ha diversi vantaggi tecnici rispetto con elettrochimica della proteina. Mentre la purificazione della proteina richiede lunghe procedure multifase, il nostro metodo di cellule intere prende un giorno di formazione di biofilm auto-organizzata dopo coltura cellulare. Per ottenere una stabile interazione tra OM c- Cyts e l'elettrodo, abbiamo bisogno solo la sterilizzazione e la pulizia della superficie dell'elettrodo; non richiede modifiche di elettrodo per organizzare l'orientamento di proteine4, ad es., s. oneidensis MR-1 intrinsecamente viene agganciato l'elettrodo, mentre orientando l' OM c- Cyts nella stessa direzione25 , 26 , 27. al contrario, le reazioni elettrochimiche di proteine risentono sensibilmente la distanza tra siti redox nella proteina e l'elettrodo; quindi, le proteine purificate devono essere attentamente orientata28,29. Ancora più importante, l'analisi elettrochimica di cellule intere direttamente caratterizza complessi di OM c- Cyts incorporate in una membrana lipidica con possibili interazioni con altre proteine di membrana e quindi riflette il protone nativo gestione nella OM c - Cyts (questo è spesso difficile da imitare utilizzando proteine purificate).
Tuttavia, la nostra tecnica ha una limitazione per quanto riguarda la concentrazione di D2O. ad alte concentrazioni di D2O potenzialmente rallentano i processi metabolici e crescita19; di conseguenza, abbiamo condotto degli esperimenti utilizzando le concentrazioni di2O di D che erano meno del 4% (v/v) in questo protocollo. Inoltre, poiché l'espressione genica in microbi è regolata in modo complesso, piccole differenze condizionale fortemente potrebbero influenzare il fenotipo microbico e anche la cinetica di trasporto dell'elettrone. In particolare, la concentrazione di lattato diminuisce durante la produzione corrente dal biofilm S. oneidensis MR-1; Pertanto, è importante per condurre gli esperimenti KIE prima che il processo di limitazione della velocità sposta a reazioni metaboliche a Monte.
Il punto più critico per ottenere con successo la KIE è chiarire e confermare la condizione in cui l'elettrone trasporto attraverso OM c- Cyts limiti il tasso di produzione corrente monitorata dall'analisi elettrochimica della intero-cellula. In questo protocollo, spieghiamo come per confermare che il tasso della EET limita e riflette l'attuale produzione microbica. Abbiamo introdotto una combinazione dei due metodi; osservazione del cambiamento attuale di flavin aggiunta23e aggiunta di2O D in presenza di un diffusore mediatore di elettroni, ad esempio, α-AQS15 (Figura 4 e Figura 5). Se uno non può fare il EET elaborare tasso-di limitazione, il motivo più probabile sarebbe formazione incompleta o distacco fisico del biofilm monostrato o contaminazione da altri microbi. Si consiglia di confermare la formazione del biofilm monostrato di scansione microscopia elettronica o microscopia confocale. È altamente possibile che il processo di sostituzione media danneggia il biofilm; di conseguenza, la rimozione e l'iniezione del mezzo dovrebbe essere condotta lentamente e gas azoto dovrebbe scorrere sopra la superficie del liquido (Figura 3). Se un biofilm monostrato uniforme non fa il EET processo limitante, è meglio a riesaminare i componenti medie e condizioni di misura, ad esempio, il completamento del lattato ad una concentrazione superiore a 10 mM, per un'ulteriore accelerazione di processi metabolici a Monte. Queste considerazioni sono importanti in altri tipi di microbi EET-capace. Mediatori dell'elettrone possono essere utilizzati in particolare per confermare che il processo EET è limitante in altri tipi di microbi EET-capace, compresi i miscugli di ceppi batterici; quindi, consideriamo questo protocollo come un metodo generale per studiare l'impatto cinetico di protoni il trasporto dell'elettrone diretto all'interfaccia di batteri/elettrodo. Considerando che EET è osservato in altri ceppi microbici e consorzi, per quanto riguarda il processo EET è limitante, questo protocollo è applicabile per studiare la respirazione microbica in ferro anaerobica corrosione e processi di ossidazione del metano, così come quella in microbica carburante cellule30,31.
Il nostro sistema di biofilm monostrato S. oneidensis MR-1 con il processo di limitazione della velocità di EET tramite OM c- Cyts può essere utilizzato non solo per gli esperimenti KIE ma anche per la caratterizzazione biochimica di OM c- Cyts. Ad esempio, l'aggiunta delle concentrazioni differenti di Flavine che legano come cofattori a OM c- Cyts avrebbe permesso la quantificazione elettrochimica della costante di dissociazione (Kd ~ 10 µM) per la formazione di flavin-associazione OM c- Cyts complessi32,33,34. Inoltre, il nostro lavoro recente ha dimostrato che il processo di riflusso di elettrone inversa tramite OM c- Cyts potrebbe essere caratterizzata attraverso catodica corrente produzione33,34. È stato proposto che il riflusso di elettrone è associato con protone importazione attraverso l'OM come fonte per chemiosmotica ATP sintesi35; Pertanto, è di grande interesse per esaminare l'impatto di protoni sulla cinetica di riflusso dell'elettrone in OM c- Cyts.
In conclusione, abbiamo sviluppato tecniche per esaminare il deuterio KIE su EET attraverso OM c- Cyts utilizzando vivere S. oneidensis MR-1. La tecnica può essere utilizzata per la caratterizzazione di OM c- Cyts nonché osservazione KIE ed è potenzialmente applicabile ad altri microbi elettrogeniche. Noi crediamo che questa metodologia può essere una tecnica generale di indagare la EET direttamente tramite OM c- Cyts in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione per appositamente ricerca promossa dalla società Giappone per numero di promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant 24000010, 17H 04969 e JP17J02602, il noi Office del Naval Research globali (N62909-17-1-2038). Y.T. è un ricercatore di JSP e supportato da JSP attraverso il programma per scuole laureato leader (MERIT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
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