Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Elektrokemisk detektion af Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektron Transport i Shewanella oneidensis hr.-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

Summary

Her præsenterer vi en protokol af hele-celle elektrokemiske eksperimenter til at studere bidrag af proton transport til sats af ekstracellulære elektron transport via de ydre membran cytokromer, der i Shewanella oneidensis hr.-1.

Abstract

Direkte elektrokemisk detektion af c-Skriv cytokrom komplekser indlejret i den bakterielle ydre membran (ydre membran c-Skriv cytokrom komplekser; OM c- Cyts) har for nylig dukket op som en roman hele-celle analytisk metode til at karakterisere den bakterielle elektron transport fra respiratorisk kæden til celle udvendige, kaldes den ekstracellulære elektron transport (EET). Mens pathway og kinetik af elektron flow under EET reaktion er blevet undersøgt, er en helhed-celle elektrokemiske metode til at undersøge virkningen af kation transport forbundet med EET endnu ikke fastlagt. I den foreliggende undersøgelse, et eksempel på en biokemisk teknik til at undersøge deuterium kinetic isotop effekt (KIE) på EET gennem OM c- Cyts ved hjælp af en model mikrobe, Shewanella oneidensis hr.-1, er beskrevet. KIE på EET processen kan opnås, hvis EET gennem OM c- Cyts fungerer som den trafikhastighedsbegrænsning trin i den mikrobielle nuværende produktion. Herpå, før tilsætning af D2O, blev supernatanten løsningen erstattet med friske medier indeholdende en tilstrækkelig mængde af elektron donoren støtte sats af upstream metaboliske reaktioner og fjerne de planktoniske celler fra en ensartet éncellelag biofilm på arbejde elektrode. Alternative metoder til at bekræfte hastighedsbegrænsende trin i mikrobiel nuværende produktion som EET gennem OM c- Cyts er også beskrevet. Vores teknik af en helhed-celle elektrokemisk analyse for at undersøge proton transport kinetik kan anvendes til andre electroactive mikrobielle stammer.

Introduction

Elektrokemiske teknikker til direkte karakterisere en redox protein i en intakt bakteriel celle er for nylig opstået siden opdagelsen af metal-reducerende mikrobielle stammer, såsom S. oneidensis hr.-1 eller Geobacter svovlreducens PCA, som har ydre membran c-type cytokrom komplekser (OM c-Cyts) udsat for celle udvendige1,2,3,4,5. OM c- Cyts mægle elektron transport fra den respiratoriske kæde på solid substrater beliggende extracellularly. Denne transport er benævnt ekstracellulære elektron transport (EET)1,6 og er en kritisk proces for nye bioteknologier, såsom mikrobielle brændselsceller6. Derfor, for at forstå de underliggende EET kinetik og mekanismer og dens forbindelse til mikrobiel fysiologi, OM c -Cyts er blevet undersøgt ved hjælp af hele-celle elektrokemi4,7, kombineret med mikroskopi 8 , 9, spektroskopi10,11, og molekylærbiologi2,4. Derimod har at undersøge virkningen af EET-associerede kation transport, fx protoner på EET kinetik i levende celler været næppe fastlaegges metoder, trods proton transport på tværs af bakteriel membraner har en afgørende rolle signalering, homøostase, og energi produktion12,13,14. I nuværende undersøgelse, vi beskriver en teknik til at undersøge virkningen af proton transport på EET kinetik i S. oneidensis hr.-1 celle ved hjælp af hele-celle elektrokemiske målinger, som kræver en identifikation af de hastighedsbegrænsende trin i mikrobielle nuværende produktion15.

En direkte måde at evaluere bidrag af proton transport på den tilknyttede EET er deuterium kinetic isotop effekt (KIE). KIE er observerbare som ændringen i elektron overførsel kinetik ved udskiftning af protoner med deuterium ioner, hvilket svarer til virkningen af proton transport elektron overførsel kinetik16. Teorien om KIE selv er blevet godt etableret, ved hjælp af elektrokemiske målinger med renset enzymer17. Men da nuværende produktion i S. oneidensis hr.-1 resultater fra flere, forskellige og svingende processer18, ikke en blot identificere EET som trafikhastighedsbegrænsning processen. Observere KIE på proton transport processer kombineret med EET, vi har brug at bekræfte, at den mikrobielle nuværende produktion er begrænset af elektron transport via OM c- Cyts til elektrode. Til dette formål erstattet vi den supernatanten løsning med friske medium, der indeholder en høj koncentration af laktat som en elektron donor på optimale pH og temperatur betingelser før KIE måling; denne udskiftning serveret to roller: (1) det forbedret satsen af upstream metaboliske processer i forhold til EET, og (2) udeladt svømning celler i supernatanten frigivet fra éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 på arbejde elektrode ( indium tin-doped oxid (ITO) elektrode). Fremlagt detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe nye udøvere fastholde og bekræfte, at EET proces er det hastighedsbestemmende trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dannelsen af en éncellelag Biofilm af S. oneidensis hr.-1 på en ITO elektrode (figur 1)

Bemærk: For at forhindre forurening af den elektrokemiske reaktor med andre mikrober, alle medierne, redskaber og dele af den elektrokemiske reaktor skal være steriliseret i forvejen. Når ved hjælp af S. oneidensis hr.-1 celler og konstruere de elektrokemiske reaktorer, alle procedurer bør gennemføres på en ren bænk.

  1. Dyrkning af S. oneidensis hr.-1 celler
    Bemærk: En éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 blev dannet en ITO elektrode efter betingelserne rapporterede tidligere4.
    1. For at dyrke S. oneidensis hr.-1 celler, tilføje en koloni af S. oneidensis hr.-1 dyrkes på en agar plade bestående af Luria-Bertani (LB) (20 g/L) og bacto agar (15 g/L) i 15 mL af LB medium (20 g/L) ved 30 ° C i 24 timer under aerobe forhold med rysten på 160 rpm.
    2. Centrifugeres cellesuspension ved 6.000 × g i 10 min., og deraf følgende celle resuspenderes i 15 mL af definerede medium (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L], og 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic syre [HEPES; 7,2 g/L]), suppleret med 10 mM laktat og 0,5 g/L gærekstrakt som kilde til CO2, og sporstoffer for S. oneidensis hr.-1 , henholdsvis.
    3. Yderligere dyrke cellesuspension aerobt ved 30 ° C i 12 timer med rysten på 160 rpm og centrifugeres igen ved 6.000 × g i 10 min. vask den resulterende celle pellet to gange med DM medium ved centrifugering i 10 min på 6.000 × g før den elektrokemiske eksperiment.
  2. Opførelsen af en tre-elektrode elektrokemiske reaktor (figur 1)
    1. Sætte en ITO substrat som arbejder elektrode i bunden af reaktoren.
    2. Efterfølgende, indsætte et glas cylinder (diameter på 2 cm) og en polytetrafluorethylen (PTFE) dækning. Derefter indsætte Ag/AgCl (KCl mættet) og en platin tråd ind i reaktoren som reference og counter elektroder, henholdsvis.
      Bemærk: For at forhindre udsivning af luft og løsning, indsætte en butyl gummi ark mellem hver komponent.
    3. Tilføje 4,0 mL af DM suppleret med 10 mM laktat og 0,5 g/L gær extract elektrokemiske-reaktoren.
    4. Når du har bekræftet, at der er ingen lækage fra den elektrokemiske reaktor, flow nitrogen gas ind i elektrokemiske reaktoren over 20 min til at opretholde anaerobe forhold inde i elektrokemiske reaktoren.
      Bemærk: For at forhindre forurening med andre mikrober, gassen skal filtreres før den munder ud i den elektrokemiske reaktor.
    5. Tilsluttes en potentiostat den elektrokemiske reaktor og anvende +0.4 V (versus standard hydrogen elektrode, hun) til ITO elektrode, at holde temperaturen af den elektrokemiske reaktor ved 30 ° C ved hjælp af en ekstern vand cirkulation system.
      Bemærk: For at forhindre, at effekten af en ekstern elektrisk felt, elektrokemiske reaktoren skal placeres i et Faraday bur.
  3. Elektrokemiske dyrkning af S. oneidensis hr.-1 celler (figur 1 og figur 2)
    1. Justere celle tæthed af suspensionen fremstillet i trin 1.1 til en optisk tæthed af 1.43 på 600 nm (OD600) med DM suppleret med 10 mM laktat og 0,5 g/L gær extract.
      Bemærk: For at opnå den korrekte OD600, anvende cellesuspension af OD600 ≤ 0,8 til en UV-vis spektrometer før justering OD600 til 1.43.
    2. Tilføje 0,3 mL af cellesuspension den elektrokemiske reaktoren via injektion port ved hjælp af en sprøjte: OD600 i reaktoren ændres til 0,1.
      Bemærk: Tilsætning af 0,3 mL cellesuspension med OD600 = 1,43 elektrokemiske reaktoren indeholdende 4,0 mL medium resultater i 4,3 mL af opløsning med en OD600 = 0,1. Når du bruger andre reaktorer med forskellige mængder, er ved beregningen af celle tæthed påkrævet.
    3. Fortsætte den potentielle anvendelse på +0.4 V (versus hun) til ITO elektrode i 25 timer.
      Bemærk: For dannelsen af en éncellelag biofilm på en ITO elektrode, sikre, at den producerede aktuelle udstiller en afvigelse mindre end 50% fra figur 2.

2. udskiftning af supernatanten med frisk DM Medium med 10 mM laktat (figur 3)

  1. Stop den potentielle anvendelse og afbryde den elektrokemiske reaktor fra potentiostat og vand cirkulation system.
  2. Udskiftning af supernatanten med frisk DM medium med 10 mM laktat
    1. Flow nitrogen gas i en flaske der indeholder DM med 10 mM laktat over 20 min til at fjerne ilt fra mediet.
    2. Langsomt fjerner alle supernatanten inde i elektrokemiske reaktoren ved hjælp af en sprøjte, under flydende nitrogen gas (figur 3a, b).
      Bemærk: For at undgå at bryde biofilm på ITO elektrode af nitrogen gas, gas skal flyde over flydende overfladen.
    3. Tilføje 4,0 mL frisk DM indeholdende 10 mM laktat ved hjælp af en sprøjte (figur 3 c).
      Bemærk: For at undgå at bryde biofilm på ITO elektrode, langsomt injicere medium langs væggen af den elektrokemiske reaktor. For at holde den biofilm, våd, bør medium tilføjes umiddelbart efter fjernelse af supernatanten. Indsprøjtning af de mellemstore op til 1 min efter fjernelse af supernatanten påvirker ikke den aktuelle produktion fra biofilm af S. oneidensis hr.-1.
    4. Skråkant, elektrokemiske reaktoren for at fjerne alle supernatant fastgjort til væggen af den elektrokemiske reaktor.
    5. Gentag trin 2.2.2-2.2.4 tre gange i alt.
  3. Luftstrømmen standses og forbinde den elektrokemiske reaktor til potentiostat igen, gælder ITO elektrode på 303 K. +0.4 V (versus hun)

3. tilsætning af Deuterium vand til at måle KIE på EET proces (figur 4)

  1. Bekræfte, at den nuværende produktion fra en éncellelag biofilm S. oneidensis hr.-1 er stabil og ikke stige hurtigt. Hvis aktuelt stiger stejlt, vente, indtil nuværende stabiliserer inden for en 5% stigning over 10 min.
    Bemærk: Dannelsen af en éncellelag biofilm på en ITO elektrode uden kontaminering af andre mikrobielle stammer blev bekræftet af rDNA sekvenser og en scanning elektron mikroskopisk billede af biofilm på en ITO elektrode, som rapporteret tidligere4. Bekræftelse af sats begrænsning af EET proces, overvåge virkningen, tilføje shuttling elektron mæglere som 100 µM anthraquinone-1-sulfonat (α-AQS). Afsnittet i Repræsentative resultater og henvise til15 for yderligere detaljer.
  2. Tilføje 40 µL af anoxiske 50% (v/v) D2O den elektrokemiske reaktoren ved hjælp af en sprøjte, således at koncentrationen er 0,5% (v/v) D2O i reaktoren.
    Bemærk: For at undgå skader på biofilm af D2O tilsætning, injicere D2O Dråbevist.
  3. Afvente den nuværende at stabilisere, og senere tilføje D2O op til 4,0% (v/v).
    Bemærk: For at opnå KIE værdi (forholdet mellem nuværende produktion D2O og H2O), kontrollere effekten af den samme mængde af H2O tilføjelse på den aktuelle produktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 25 h af potentielle anvendelse på +0.4 V (versus hun), blev en éncellelag biofilm dannet på den arbejdende elektrode af ITO glas, som var tidligere bekræftet af enten en scanning elektronmikroskopi eller en Konfokal mikroskopi4. De repræsentative tidsforløb af nuværende produktion fra S. oneidensis hr.-1 under dannelsen af en éncellelag biofilm er vist i figur 2. Selv om nuværende ændrer i hver måling, udviser den producerede strøm ikke en afvigelse mere end 50% fra værdien i figur 2 , hvis en éncellelag biofilm dannes ensartet.

Efter udskiftning af supernatanten med frisk DM med 10 mM laktat at maksimere antallet af metaboliske processer og vaske éncellelag biofilm (figur 3), kan en stabil anodisk strøm (ca 5% stigning i 10 min) overholdes under +0.4 V (versus hun ) ansøgning (figur 4a). Hvis den anodisk aktuelle stiger stejlt, vente, indtil nuværende stabiliserer. Det er meget muligt, at procedurerne for supernatanten udskiftning beskrevet i afsnit 2 kan skade biofilm og genopbygning kan forekomme.

Den faste linje i figur 4a skyldes repræsentant for mikrobiel nuværende ændringen induceret ved D2O tilsætning. Tilsætning af 1,0% (v/v) D2O faldet skarpt den mikrobielle nuværende inden for 10 s, mens næsten ingen aktuelle fald blev observeret ved tilsætning af H2O (punkteret linie i figur 4a)15. Den samme tendens var gengivet i mindst fire separate eksperimenter. Den sekventielle tilsætning af D2O ved endelige koncentrationer spænder fra 0,5% til 2,0% (v/v) klart udstillet stærk undertrykkelse i den aktuelle produktion (figur 4a)15. Fordi den mikrobielle nuværende produktion gradvist inddrives sandsynligvis på grund af fysiologiske virkning19,20, bør KIE tildeles til det nuværende fald snart efter tilsætning af D2O. I en tidligere betænkning samlet vi den nuværende produktion på ca. 10 min. efter tilsætning af D2O til at beregne værdien af KIE15.

Ved hjælp af to metoder, bekræftet vi, at den observerede aktuelle fald ved D2O tilsætning kan henføres til KIE på EET gennem OM c- Cyts kompleks. Først, vi tilføjet 1 µM riboflavin (RF) eller flavin mononucleotide (FMN) elektrokemiske-reaktoren før og efter D2O tilføjelse, som kan bruges til at studere EET i S. oneidensis hr.-1. I tilfælde af S. oneidensis hr.-1, biokemi specifikt fremskynde EET af bindende med OM c- Cyts i et par sekunder, fordi biokemi fungere som ikke-kovalent binding cofaktorer21,22, 23. derfor, en instant anodisk nuværende stigning ved flavin angiver sats begrænsning af EET proces via OM c- Cyts (figur 5). Vi yderligere bekræftet effekten af shuttling elektron mæglere på KIE. Lille redox molekyler, fxanthraquinone-1-sulfonat (α-AQS), opsige EET processen ved at sprede fra den mikrobielle elektron transportkæden til elektrode, i stedet for direkte elektron transport via OM c- Cyts15 , 24. her, tilføjelsen af 100 µM α-AQS forbedrede den nuværende produktion af mere end 5-fold (figur 4b), som angiver, at kinetik af de metaboliske reaktioner er hurtig nok til at gøre EET behandle det hastighedsbegrænsende trin. Konsekvent, forblev nuværende produktion medieret af α-AQS upåvirket af D2O tilsætning (figur 4b), viser, at den mulige forsinkelse i metaboliske reaktioner af D2O ikke forårsager de store KIE observeret i figur 4a .

Kombinationen af disse to metoder til at observere KIE på elektron transport med OM c- Cyts er det kritiske punkt i denne betænkning, og specifikt shuttling elektron mæglere kan være gældende for andre electroactive biofilm. Hertil kommer, når vi bekræftet, at den aktuelle ændring er tildelt EET proces, vi kunne vurdere effekten af en delvis sletning mutant OM c- Cyts eller af en flavin tilknyttet OM c- Cyts på proton overføre kinetik ved at sammenligne KIE i begge tilfælde15. Når D2O blev tilføjet i overværelse af FMN bindende med OM c- Cyts, det nuværende fald blev reduceret sådan, at det var mindre end uden FMN, der angiver, at bindingen af FMN ændret proton transport pathway og dens forsvindingskinetik (figur 4 c)15.

Figure 1
Figur 1: elektrokemiske reaktor anvendes i denne undersøgelse. Fotografi af den elektrokemiske celle før konstruktion (en) og efter anlæggelsen (b). (c) skematisk illustration af den elektrokemiske reaktor efter 25 h af elektrokemiske podning på +0.4 V vs hun. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative nuværende produktion fra S. oneidensis hr.-1 under éncellelag Biofilmdannelse på en ITO elektrode. En pil angiver tidspunktet for tilsætning af cellesuspension elektrokemiske-reaktoren. Den samme tendens var gengivet i mindst fem individuelle eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udskiftning af supernatanten til frisk definerede medium (DM) med 10 mM laktat. (en) Nitrogen gas flow over den væske overflade. (b) fjernelse af supernatanten fra den elektrokemiske reaktor. (c) tilsætning af 4,0 mL frisk DM indeholdende 10 mM laktat. Efter medium tilsætning, bør være skrå reaktoren for at fjerne supernatanten fastgjort til væggen i reaktoren. Gennemføre disse procedure (en-c) tre gange i alt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Effekten af D2O tilføjelse på den nuværende produktion fra en éncellelag biofilm S. oneidensis hr.-1. Gang versus nuværende produktion for en éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 i en elektrokemisk system, der indeholder 10 mM laktat (en), en yderligere 100 µM anthraquinone-1-sulfonat (α- AQS) (b), eller en ekstra 2 µM Flavin mononucleotide (FMN) (c). Den samme tendens var gengivet i mindst fire individuelle eksperimenter. Pilene angiver tid af tilsætning af D2O (streg) eller H2O (stiplet linje). De data, der svarer til den stiplede linje var normaliseret til datapunkt lige før tilsætning af D2O i streg data. Koncentrationen af D2O i elektrokemiske reaktoren er indiceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: vurdering af hastighedsbestemmende trin i den aktuelle produktion fra en éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 ved tilsætning af biokemi. Gang versus nuværende produktion fra en éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 10 mM laktat (solid line), 1.0 mM laktat (stiplet linje) og 0,1 mM laktat (stiplet linje). En pil angiver det tidspunkt, på hvilke 1 µM flavin mononucleotide (FMN) blev tilføjet i de elektrokemiske reaktorer. I nærværelse af 10 mM laktat, tilsætning af FMN drastisk øget den aktuelle produktion, viser, at den ekstracellulære elektron transport (EET) gennem c-Skriv cytokrom komplekser indlejret i den bakterielle ydre membran (OM c - Cyts) er hastighedsbestemmende. Mindre laktat koncentration i den elektrokemiske reaktor forårsaget en mindre nuværende forbedring af FMN tilføjelse, der angiver, at elektron levering fra de opstrøms metaboliske reaktioner OM c- Cyts gradvist blev langsommere end EET sats. Den samme tendens var gengivet i mindst to individuelle eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores hele-celle elektrokemisk analyse har adskillige tekniske fordele sammenlignet med protein elektrokemi. Mens protein oprensning kræver flere trin tidskrævende procedurer, tager vores hele-celle metode en dag af Self-Organized Biofilmdannelse efter cellekultur. For at opnå en stabil interaktion mellem OM c- Cyts og elektrode, vi behøver kun sterilisation og rengøring af elektrode overflade; Det kræver ikke elektrode ændring for organisering orientering af proteiner4, f.eks., S. oneidensis hr.-1 uløseligt lægger på elektroden, samtidig med at orientere OM c- Cyts i den samme retning25 , 26 , 27. derimod de elektrokemiske reaktioner af proteiner er føleligt påvirket af afstanden mellem redox websteder i protein og elektrode; således, at rensede proteiner skal være nøje orienteret28,29. Endnu vigtigere, hele-celle elektrokemisk analyse direkte karakteriserer OM c- Cyts komplekser indlejret i en lipid membranen med mulige interaktioner med andre Membranproteiner, og så afspejler den indfødte proton management i OM c - Cyts (det er ofte vanskeligt at efterligne ved hjælp af renset proteiner).

Vores teknik har imidlertid en begrænsning med hensyn til koncentrationen af D2O. høje koncentrationer af D2O potentielt bremse metaboliske processer og vækst19; Derfor, vi har udført eksperimenter ved hjælp af D2O koncentrationer, der var mindre end 4% (v/v) i denne protokol. Derudover fordi genekspression i mikrober er reguleret på en kompleks måde, kan små betingede forskelle stærkt påvirke den mikrobielle fænotype og endda elektron transport kinetik. Især falder laktat koncentrationen under nuværende produktion fra S. oneidensis hr.-1 biofilm; Det er derfor vigtigt at udføre KIE eksperimenter før trafikhastighedsbegrænsning processen skifter til upstream metaboliske reaktioner.

Det mest kritiske punkt held få KIE er at afklare og bekræfte den tilstand, hvor elektronen transport gennem OM c- Cyts grænser sats af nuværende produktion overvåget af det hele-celle elektrokemiske assay. I denne protokol forklare vi, hvordan til at bekræfte, at satsen for EET begrænser og afspejler den mikrobielle nuværende produktion. Vi indførte en kombination af to metoder; observation af den aktuelle ændring af flavin tilføjelse23, og D2O tilsætning i overværelse af en spreder elektron mægler, fxα-AQS15 (figur 4 og figur 5). Hvis man ikke kan lave EET behandle trafikhastighedsbegrænsning, ville den mest sandsynlige grund være ufuldstændige dannelse eller fysiske detachement af éncellelag biofilm, eller forurening af andre mikrober. Det anbefales kraftigt, bekræfter dannelsen af éncellelag biofilm ved scanning elektronmikroskopi eller Konfokal mikroskopi. Det er meget muligt, at den mellemstore udskiftning proces skader biofilm; Derfor, fjernelse og injektion af medium bør udføres langsomt og nitrogen gas skal flyde over den flydende overflade (figur 3). Hvis en ensartet éncellelag biofilm ikke gør EET behandle trafikhastighedsbegrænsning, er det bedst at revurderer de mellemstore komponenter og måling betingelser, f.eks.tilskud af laktat ved en højere koncentration end 10 mM, for yderligere acceleration af opstrøms metaboliske processer. Disse overvejelser er også vigtige i andre typer af EET-habil mikrober. Elektron mæglere kan specifikt bruges til at bekræfte, at EET proces trafikhastighedsbegrænsning i andre typer af EET-habil mikrober, herunder blandinger af bakteriestammer; Vi mener således, denne protokol som en generel metode til at undersøge den kinetiske virkningen af protoner på direkte elektron transport på grænsefladen bakterier/elektrode. Overvejer at EET er observeret i andre mikrobielle stammer og konsortier, som EET er trafikhastighedsbegrænsning, gælder denne protokol studere den mikrobielle respiration i anaerobe jern korrosion og metan-oxidation processer samt i mikrobielle brændstof celler30,31.

Vores system af S. oneidensis hr.-1 éncellelag biofilm trafikhastighedsbegrænsning processen med EET via OM c- Cyts kan bruges ikke kun til KIE-eksperimenter men også for den biokemiske karakterisering af OM c- Cyts. For eksempel, tilsætning af forskellige koncentrationer af biokemi, der binder som cofaktorer OM c- Cyts ville tillade den elektrokemiske kvantificering af dissociationskonstant (Kd ~ 10 µM) for dannelsen af flavin-bundet OM c- CYTS komplekser32,33,34. Desuden vores nylige arbejde demonstreret, at inverse elektron tilbagestrømning processen via OM c- Cyts kunne være karakteriseret gennem katodisk nuværende produktion33,34. Det er blevet foreslået, at elektronen tilbagestrømning er forbundet med proton import på tværs af OM som en kilde til kemiosmotisk ATP syntesen35; Det er derfor af stor interesse at undersøge virkningen af protoner på elektron tilbagestrømning kinetik i OM c- Cyts.

Afslutningsvis, udviklet vi teknikker til at undersøge deuterium KIE på EET gennem OM c- Cyts bruger bor S. oneidensis hr.-1. Teknikken kan anvendes til karakterisering af OM c- Cyts samt KIE observation, og det er potentielt gælder for andre electrogenic mikrober. Vi mener, at denne metode kan være en generel teknik til at undersøge EET direkte via OM c- Cyts in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev økonomisk støttet af en licensbetaling for specielt fremmes forskning fra Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) KAKENHI tilskud antal 24000010, 17H 04969, og JP17J02602, den os Office af Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. er en JSP'ER Research Fellow og støttet af JSP'ER gennem programmet for førende Graduate skoler (MERIT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

Biokemi spørgsmål 134 hele-celle elektrokemi cytokromer der metal reduktion bakterierne proton overførsel flavin bioelectrochemistry mikrobiel brændselsceller electroactive biofilm
Elektrokemisk detektion af Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektron Transport i <em>Shewanella oneidensis</em> hr.-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, … More

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter