Summary
여기 선물이 전체 셀 전기 화학 실험 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 복잡 한 외부 막 한다 통해 extracellular 전자 전송의 속도를 양성자 수송의 기여를 공부 하는 프로토콜.
Abstract
직접 c의 전기 화학 검출-시 토 크롬 단지 세균 외부 막에 포함 된 입력 (외부 막 c-입력 시 토 크롬 복합물; 톰 c-대련 청 려)는 최근 소설 전체 셀 셀 외관 호흡기 체인에서 세균성 전자 수송 특성 분석 방법으로, 세포 외 전자 전송 (동유럽 표준시)로. 통로 동유럽 표준시 반응 동안 전자 흐름의 속도, 조사 하는 동안 전체 셀 전기 메서드 동유럽 표준시와 관련 된 양이온 수송의 영향 검토를 하지 아직 설립 되었습니다. 현재 연구에서 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE) 동유럽 표준시에 옴 c를 검사 하는 생 화 확 적인 기술의 예-대련 청 려 모델 미생물, Shewanella oneidensis 미스터-1을 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 동유럽 표준시 프로세스에 KIE 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려 미생물 현재 생산에서 속도 제한 단계 역할을 하는 경우에 얻어질 수 있다. 끝으로, D2O의 추가 하기 전에 표면에 뜨는 솔루션 업스트림 신진 대사 반응의 속도 지원 하 고 유니폼에서 planktonic 세포를 제거 하는 전자 기증자의 충분 한 금액을 포함 하는 신선한 미디어로 대체 되었습니다. 작업 전극에 단층 biofilm입니다. 속도 제한 확인 대체 방법을 미생물 현재 생산에서 단계 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려도 설명 됩니다. 양성자 전송 속도 론 조사를 위한 전기 화학 분석 결과 전체 셀의 우리의 기술은 다른 electroactive 미생물 계통에 적용할 수 있습니다.
Introduction
직접 하는 그대로 세균 세포에서 산화 환 원 단백질 전기 기술을 최근 금속 감소 미생물 긴장, S. oneidensis 씨-1 등 Geobacter sulfurreducens PCA의 발견 이후 등장 외부 막 시 토 크롬 c 형 단지 (OM c-대련 청 려) 셀 외부1,2,3,,45에 노출 되어 있다. 톰 c-대련 청 려 호흡기 체인에서 extracellularly 있는 고체 기판에 전자 수송 중재. 이 전송 extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시)1,6 이라고 하 고 미생물 연료 전지6등 신흥 바이오에 대 한 중요 한 과정 이다. 따라서, 기본 동유럽 표준시 속도 론 및 메커니즘 및 미생물 생리학에 그것의 연결을 이해 하 옴 c-대련 청 려 되었습니다 조사 전체 셀 전기 화학4,7, 현미경과 결합을 사용 하 여 8 , 9, 분광학10,11, 그리고 분자 생물학2,4. 반면, 동유럽 표준시 관련 된 양이온 수송, 예를 들어, 양성자, 살아있는 세포에서 동유럽 표준시 활동에 미치는 영향을 조사 하는 방법 부족 하 게 설립 되어, 세균 막 중요 한 역할을가지고 걸쳐 양성자 수송에도 불구 하 고 신호, 항상성, 및 에너지 생산12,,1314. 현재의에서 연구, 우리는 양성자 수송 필요의 속도 제한 단계 식별 전체 셀 전기 화학 측정을 사용 하 여 S. oneidensis 씨-1 셀에 동유럽 표준시 활동에의 영향을 검사 하는 기법을 설명 미생물 현재 생산15.
1 직접 연결 된 동유럽 표준시에 양성자 수송의 기여를 평가 방법은 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE)입니다. 인기의 전자 전송 속도 론16양성자 교통 영향을 나타내는 중수소 이온, 양성자의 교체 시 전자 전송 속도에서 변화 관찰입니다. KIE 자체의 이론은 잘 설립 되었습니다 정제 효소17전기 화학 측정을 사용 하 여. 그러나, S. oneidensis 씨-1에 현재 생산, 여러 다양 한, 그리고 변동 과정18에서 결과, 이후 하나 확인할 수 없습니다 단순히 동유럽 표준시 속도 제한 과정으로. 관찰 하기 위해 동유럽 표준시 함께 양성자 전송 프로세스에 인기, 우리는 미생물 현재 생산 옴 c통해 전자 전송에 의해 제한 됩니다 확인 해야-대련 청 려 전극에. 이 목적을 위해 우리 신선한 매체에서 최적 pH 및 온도 조건 KIE 측정; 전에 전자 기증자로 젖 산의 높은 농도 포함 하는 표면에 뜨는 솔루션 대체 이 교체 봉사 두 역할: (1) 동유럽 표준시에 비해 업스트림 신진 대사 과정의 속도 향상 하 고 (2) 작업 전극 (에 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 발표 하는 상쾌한 수영 셀 생략 인듐 주석 첨가 산화물 (ITO) 전극). 새로운 실무자 유지 하 고 동유럽 표준시 프로세스 속도 결정 단계는 확인을 있도록 제시 상세한 프로토콜 것입니다.
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Protocol
1. ITO 전극 (그림 1)에 S. oneidensis 씨-1의 단층 Biofilm의 형성
참고: 다른 미생물과 전기 화학 반응 기의 오염을 방지 하기 위해, 모든 미디어, 구현 및 전기 화학 반응 기의 구성 한다 살 균 되어야 사전에. 때 깨끗 한 벤치에 모든 절차를 지휘 한다 S. oneidensis 씨-1 셀을 사용 하 고 전기 원자로 건설.
- S. oneidensis 씨-1 셀의 재배
참고: S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm 형성 되었다는 이토에는 조건에 따라 전극 보고 이전4.- S. oneidensis 씨-1 세포 성장, S. oneidensis 씨-1 파운드 매체 (20 g/L) 160 rpm에서 떨고 호 기성 조건에서 24 시간에 30 ° C에서의 15 mL에 Luria Bertani (파운드) (20 g/L) 및 bacto agar (15 g/L)로 구성 된 한 천 배지에서 성장 한 식민지를 추가 합니다.
- 10 분 동안 6000 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 및 정의 된 매체 (pH 7.8)의 15 mL에 결과 셀 펠 릿 resuspend (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L] MgCl2· 6 H2O [0.2 g/L], NaCl [10 g/L], 그리고 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] [HEPES; 7.2 g/L] ethanesulfonic 산), 젖 산 10 m m와 0.5 g/L 효 모 추출 물, 탄소 소스로 보충 및 S. oneidensis 씨-1에 대 한 추적 요소 각각.
- 또한 160 rpm에서 떨고와 12 h 30 ° C에서 aerobically 세포 현 탁 액을 배양 하 고 원심 다시 10 분 세척을 위한 6000 × g 에서 DM 매체와 두 번 결과 셀 펠 릿은 화학 전에 6000 × g에서 10 분 원심 분리 하 여 실험입니다.
- 3-전극 전기 화학 반응 (그림 1)의 건설
- 반응 기의 하단에 작업 전극으로 ITO 기판을 넣어.
- 그 후, 삽입 유리 실린더 (2 cm의 직경) 및 소계 (PTFE) 커버. 그런 다음 삽입 Ag/AgCl (포화 KCl)와 백 금 철사는 원자로에 참조 및 카운터 전극으로 각각.
참고: 공기 및 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 각 구성 요소 간의 부 틸 고무 시트를 삽입 합니다. - DM의 4.0 mL 10mm 젖 산으로 보충 하 고 0.5 g/L 효 모 추출 화학 반응 기에 추가 합니다.
- 전기 화학 반응 기에서 누설 확인, 전기 화학 반응 화학 반응 기 내부의 혐 기성 조건을 유지 하기 위해 20 분 이상으로 질소 가스 흐름.
참고: 다른 미생물 오염을 방지 하기 위해, 가스 한다 필터링 전에 그것은 전기 화학 반응으로 흐른다. - 전기 화학 반응 기는 potentiostat에 연결 하 고 적용 0.4 V (표준 수소 전극 대 그녀) ITO 전극에는 외부 물 순환 시스템을 사용 하 여 30 ° C에서 전기 화학 반응 기의 온도 유지.
참고: 외부 전기 분야의 영향을 방지 하기 위해, 전기 화학 반응 기는 패러데이 케이지에 배치 되어야 합니다.
- S. oneidensis 씨-1 세포 (그림 1 및 그림 2)의 전기 화학 경작
- 1.1 600 1.43의 광학 밀도에 단계에서 얻은 서 스 펜 션의 셀 밀도 조정 10 m m 0.5 g/L 및 젖 산 효 모에 의해 보충 하는 dm nm (OD600) 추출.
참고: 올바른 세600를, 1.43 OD600 조정 전에 대 한 UV 분석기에 OD600 ≤ 0.8의 세포 현 탁 액을 적용 됩니다. - 세포 현 탁 액의 0.3 mL 주사기를 사용 하 여 주입 포트를 통해 전기 화학 반응 기에 추가: 원자로에서 OD600 0.1로 변경.
참고: OD600 와 0.3 mL 셀 서 스 펜 션의 추가 = 1.43 OD600 와 솔루션의 4.3 ml에서 4.0 mL 중간 결과 포함 하는 전기 원자로에 0.1 =. 다른 원자로 사용 하 여 다른 볼륨, 셀 밀도의 계산이 필요 합니다. - 0.4 V (그녀) 대 25 h ITO 전극에 잠재적인 응용 프로그램을 계속 합니다.
참고: ITO 전극에 단층 biofilm의 형성에 대 한 생산된 전류 전시 그림 2에서 50% 미만의 편차 확인 합니다.
- 1.1 600 1.43의 광학 밀도에 단계에서 얻은 서 스 펜 션의 셀 밀도 조정 10 m m 0.5 g/L 및 젖 산 효 모에 의해 보충 하는 dm nm (OD600) 추출.
2. 젖 산 10 m m (그림 3)와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 교체
- 잠재적인 응용 프로그램을 중지 하 고 전기 화학 반응 기는 potentiostat와 물 순환 시스템에서 분리 합니다.
- 10 m m와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 대체 젖이 나올
- DM를 포함 하는 매체에서 산소를 제거 하 10mm 젖 산 20 분 이상으로 병에 질소 가스 흐름.
- 천천히 흐르는에서 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응 기 내부의 모든 상쾌한 제거 질소 가스 (그림 3a, b).
참고: 질소 가스에 의해 ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 가스 액체 표면 위의 흐름 해야 합니다. - (그림 3c) 주사기를 사용 하 여 10mm 젖 산을 포함 하는 신선한 DM의 4.0 mL를 추가 합니다.
참고: ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 전기 화학 반응 기의 벽을 따라 중간을 주사 천천히. 유지 하기 위해 젖은 biofilm, 매체 상쾌한의 제거 후 즉시 추가 되어야 합니다. 상쾌한의 제거 후 중간까지 1 분의 주입 S. oneidensis 씨-1는 biofilm에서 현재 생산을 영향을 주지 않습니다. - 전기 화학 반응 기의 벽에 부착 된 상쾌한의 모두 제거를 전기 화학 반응 기 경사
- 총에 세 번 단계 2.2.2-2.2.4를 반복 합니다.
- 가스 흐름을 중지 하 고 potentiostat 다시, 303 공화국에서 ITO 전극 (그녀) 대 0.4 V 적용에 전기 화학 반응 기를 연결
3. 동유럽 표준시 과정 (그림 4)에 인기를 측정 하는 중수소 물 추가
- S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 현재 생산 안정적 이며 빠른 속도로 증가 하지 않습니다 확인 합니다. 현재 가파르게 증가 하는 경우 현재 5% 증가 10 분 이상에서 안정화 될 때까지 기다립니다.
참고: 다른 미생물 긴장의 오염 없이 ITO 전극에 단층 biofilm의 형성 확인 되었다 rDNA 시퀀스와 ITO 전극에 biofilm의 스캐닝 전자 현미경 이미지를 보고 이전4. 동유럽 표준시 프로세스 속도 제한의 확인에 대 한 추가 왕복 전자 중재자 100 µ M 안트라퀴논-1-된 α-AQS () 등의 효과 모니터링 합니다. 15 대 한 자세한 내용은 참조 및 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오. - 농도 0.5% (v/v) D2O 원자로에 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응으로 무산 소 50% (v/v) D2O의 40 µ L를 추가 합니다.
참고: D2O 추가 의해는 biofilm 손상을 방지, 주사 D2O drop-wise. - 전류 안정화를 기다립니다 하 고 이후 추가 D2O 4.0% (v/v).
참고: KIE 값 (D2O 및 H2O의 현재 생산의 비율)를, 현재 생산에 H2O 추가의 동일한 볼륨의 효과 확인 하십시오.
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Representative Results
0.4 V (그녀) 대에서 잠재적인 응용 프로그램의 25 h, 후 단층 biofilm 이전 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는4confocal 현미경 검사 법 의해 확인 되었다 이토 유리의 작업 전극에 형성 되었다. 단층 biofilm의 형성 중 S. oneidensis 씨-1에서 현재 생산의 대표적인 시간 과정은 그림 2에 표시 됩니다. 비록 현재는 모든 측정에 변경, 단층 biofilm 형성 균일 하 게 되 면 생산된 전류 편차 그림 2에서 값에서 50% 이상 발생 하지 않습니다.
신진 대사 과정의 속도 극대화 하 고 단층 biofilm (그림 3) 세척을 10mm 젖과 신선한 dm 상쾌한의 교체, 후 안정적인 양극 전류 (10 분에 약 5% 증가) (그녀가 대 0.4 V에서 관찰 될 수 있다 ) 응용 프로그램 (그림 4a). 양극 전류는 가파르게 증가, 현재 안정화 될 때까지 기다립니다. 그것은 매우 가능한 표면에 뜨는 교체 제 2 항에서 설명 하는 절차는 biofilm를 손상 시킬 수 및 재건 발생할 수 있습니다.
그림 4a 에 실선 D2O 추가 의해 유발 미생물 전류 변화에 대 한 대표적인 결과 이다. 1.0% (v/v) D2O의 추가 급격히 감소 10 미생물 전류 s, 동안 거의 현재 감소 H2O ( 그림 4a에서 점선)15의 추가 의해 관찰 되었다. 같은 경향 적어도 4 개의 별도 실험에서 재현 했다. D2O 0.5% 2.0% (v/v) 명확 하 게 전시 강력한 억제는 현재 생산 (그림 4a)15에서 배열 하는 최종 농도에서 순차 또한. 있으므로 미생물 현재 생산 점차적으로 복구 된 가능성이 인해 생리 효과19,20, KIE D2o.의 추가 후에 곧 현재 감소에 할당 되어야 합니다. 이전 보고서에서 우리는 D2O KIE15의 값을 계산의 추가 후에 대략 10 분에서 현재 생산 수집.
두 가지 방법을 사용 하 여, 우리 확인 D2O 추가 의해 관찰 된 현재 감소 옴 c-대련 청 려 복잡 통해 동유럽 표준시에 인기에 기인. 첫째, 우리는 추가 1 µ M 리 보 플 라빈 (RF) 또는 플 라빈 mononucleotide (FMN) 전기 화학 반응에 전후에 D2O 또한, S. oneidensis 씨-1 동유럽 표준시를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. S. oneidensis 씨-1의 경우 flavins 특히 옴 c바인딩에서 동유럽 표준시 과정을 가속-대련 청 려 몇 초에서는 flavins 비 공유 바인딩 cofactors21,22, 로 작동 하기 때문에 23. 따라서, 플 라빈 또한 인스턴트 고 현재 증가 옴 c통해 동유럽 표준시 프로세스에 의해 속도 제한 표시-대련 청 려 (그림 5). 우리는 더 인기에 전자 중재자 였죠의 효과를 확인 했다. 작은 redox 분자, 예를 들어, 안트라퀴논-1-된 α-AQS (), 옴 c-대련 청 려15 통해 직접 전자 전송 대신 전극에 미생물 전자 전송 체인에서 확산 하 여 동유럽 표준시 프로세스를 종료할 , 24. 여기, 100 µ M α-AQS 추가 향상 된에 의해 현재 생산 이상 5-fold (그림 4b), 신진 대사 반응의 속도 론은 충분히 빠른 처리 속도-제한 단계 동유럽 표준시 수 있도록 나타냅니다. 일관 되 게, 현재 생산 α AQS 중재 D2O 대사 반응에 잠재적인 지연 그림 4a에서 큰 인기를 발생 하지 않습니다 보여주는 D2O 추가 (그림 4b)에 의해 영향을 받지 남아 .
조합 옴 c전자 전송에 인기를 관찰 하는 것이 두 가지 방법의-대련 청 려가이 보고서의 중요 한 포인트 이며 특히, 전자 중재자 였죠 것이 다른 electroactive biofilms에 적용 될 수 있습니다. 또한, 우리는 동유럽 표준시 프로세스에 현재 변경 지정 됩니다 확인, 일단 우리 옴 c의 부분 삭제 돌연변이의 효과 평가 수-대련 청 려 옴 c와 관련 된 플 라빈의 양성자에-대련 청 려에 인기를 비교 하 여 속도 론을 전송 또는 두 경우15. D2O FMN 존재 추가할 때 옴 c바인딩-대련 청 려, 현재 감소 감소 했다 그것이 FMN, FMN의 바인딩 변경 양성자 전송 통로 그 속도 론 (그림을 나타내는 없이 보다 작은 되도록 4 c)15.
그림 1:이 연구에 사용 된 전기 화학 반응 기. 전기 화학 셀 (a) 건설 전과 건설 (b) 후의 사진. (c) 후 25 h 0.4 V에서 전기 접종의 전기 화학 반응 기의 회로도 그림 대 그녀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ITO 전극에 단층 biofilm 형성 중 S. oneidensis 씨-1에서 대표 현재 생산. 화살표는 전기 화학 반응으로 세포 현 탁 액의 추가의 시간을 나타냅니다. 같은 경향 적어도 5 개의 개별 실험에 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 신선한 정의 보통 (DM) 10mm 젖으로 상쾌한의 교체. 액체 표면 위의 (가) 질소 가스 흐름. (b) 전기 화학 반응 기에서 상쾌한의 제거. (c) 4.0 mL 신선한 DM 포함의 추가 10 m m 젖 산. 중간 추가 후 원자로 반응 기의 벽에 부착 된 상쾌한 제거 하 경사 한다. 총 세 번이이 절차는는-(c) 실시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 효과 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 현재 생산에 D2O 추가의. S. oneidensis 씨-1 10 m m 젖 산 (a), 한 추가 100 µ M 안트라퀴논-1-된을 포함 하는 전기 화학 시스템의 단층 biofilm에 대 한 현재 생산 대 시간 (α-AQS) (b), 또는 추가 2 µ M 플 라빈 mononucleotide (FMN) (c) 같은 경향 적어도 4 개의 개별 실험에 재현 했다. 화살표 (점선) D2O (실선) 또는 H2O의 추가의 시간을 나타냅니다. 점선에 해당 하는 데이터는 D2O 실선 데이터에 추가 하기 전에 데이터 요소를 정규화 되었다. D2O 전기 화학 반응 기에서의 농도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 속도 결정의 평가 단계 flavins의 추가 의해 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 현재 생산에서. S. oneidensis 씨-1 10 mM 젖 산 (실선), 1.0 m m 젖 (파선), 그리고 젖 산 0.1 m m (점선)의 존재의 단층 biofilm에서 현재 생산 대 시간. 화살표는 1 µ M에서 플 라빈 mononucleotide (FMN) 전기 화학 반응에 추가 되었습니다 시간 포인트를 나타냅니다. 10mm 젖 산, 존재 FMN의 대폭 증가 보여주는 현재 생산 c세포 외 전자 전송 (동유럽 표준시)-시 토 크롬 단지 세균 외부 막에 포함 된 입력 (OM c -대련 청 려) 속도 결정 이다. 젖 덜 농도 전기 화학 반응에 기인한 작은 현재 향상 FMN 또한, 나타내는 전자 공급 옴 c업스트림 대사 반응에서-대련 청 려 점차적으로 되었다 동유럽 표준시 속도 보다 느립니다. 같은 경향 적어도 두 개의 개별 실험에 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리의 전체 셀 전기 화학 분석 결과 단백질 전기에 비해 몇 가지 기술적인 이점이 있다. 단백질 정화 다단계 시간이 걸리는 절차 필요, 우리의 전체 셀 메서드 자체 조직된 biofilm 형성 세포 배양 후의 어느 날 걸립니다. 톰 c간의 안정적인 상호 작용을 달성 하기 위해-대련 청 려 고 전극, 우리 필요만 살 균과 청소의 전극 표면; 톰 c를 향하는 동안, 전극에 부착 단백질4, 예를 들면, S. oneidensis 씨-1의 방향을 본질적으로 조직에 대 한 전극 수정 필요 하지 않습니다 그것은 같은 방향으로25 -대련 청 려 , 26 , 27. 대조적으로, 단백질의 전기 화학 반응을 민감하게 영향을 받는 단백질에서 산화 환 원 사이트와; 전극 사이의 거리 따라서, 순화 된 단백질은 신중 하 게 지향된28,29해야 합니다. 더 중요 한 것은, 전체 셀 전기 화학 분석 결과 직접 옴 c-대련 청 려 단지 가능한 상호 작용 다른 막 단백질로 지질 막에 포함 된 특징 및 그래서 네이티브 양성자를 반영 OM에서 관리 c -대련 청 려 (이것은 종종 어려운 순화 된 단백질을 사용 하 여 모방).
그러나, 우리의 기술 D2D2O의 농도 잠재적으로 대사 과정과 성장을19; 천천히 오 높은 농도 관하여 제한이 따라서, 우리 보다 4% (v/v)이이 프로토콜에서 D O2농도 사용 하 여 실험을 실시. 또한, 미생물에 유전자 발현은 복잡 한 방식으로 통제 된다, 때문에 작은 조건부 차이 수 강하게 영향을 미생물 형 전자 전송 속도 론. S. oneidensis 씨 1 biofilm;에서 현재 생산 중 젖 산 농도 감소 하는 특히, 따라서, 그것은 속도 제한 프로세스 업스트림 신진 대사 반응에 이동 하기 전에 KIE 실험을 수행 하는 것이 중요입니다.
명확히 하 고 있는 전자 수송 옴 c-대련 청 려 한계를 통해 현재 생산 전체 셀 전기 화학 분석 결과 의해 모니터링 속도 조건 확인 성공적으로 인기를 얻기 위해 가장 중요 한 포인트입니다. 이 프로토콜에서 우리는 동유럽 표준시의 속도 제한 하 고 미생물 현재 생산 반영을 확인 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 두 가지 방법;의 조합 도입 플 라빈 또한23, 그리고 D2O 추가 확산 전자 중재자, 예를 들어, α-AQS15 (그림 4 및 그림 5)의 존재에 의해 현재 변화 관찰. 하나는 속도 제한 처리 동유럽 표준시 만들 수 없다면, 가능성이 가장 높은 이유 불완전 형성 또는 단층 biofilm, 또는 다른 미생물에 의해 오염의 물리적 분리 것입니다. 전자 현미경 검사 법 또는 confocal 현미경 검사 법을 검사 하 여 단층 biofilm의 형성을 확인 하는 것이 좋습니다. 중간 교체 과정 biofilm; 손상 가능성이 따라서, 제거 및 매체의 주입 천천히, 실시 해야 하 고 질소 가스 (그림 3)의 액체 표면 위의 흐름 해야. 균일 한 단층 biofilm 만들지 않는다 동유럽 표준시 처리 속도 제한, 그것이 가장 중간 구성 요소 및 측정 조건, 예를 들어, 10 m m 보다 높은 농도에서 젖 산의 보충의 추가 가속에 대 한 재검토 업스트림 대사 프로세스입니다. 이러한 고려 사항은 또한 동유럽 표준시 가능한 미생물의 다른 종류에 중요 하다. 전자 중재자; 세균성 긴장의 혼합을 포함 하 여 동유럽 표준시 가능한 미생물의 다른 종류에서 속도 제한 동유럽 표준시 프로세스 인지 확인 하는 데 사용 특히 수 있습니다. 따라서, 우리는 박테리아/전극 인터페이스에서 직접 전자 전송에 양성자의 운동 영향을 조사 하는 일반적인 방법으로이 프로토콜을 고려 합니다. 동유럽 표준시 프로세스 속도 제한 이다 동유럽 표준시는 다른 미생물 긴장과 컨소시엄에서 관찰 고려,이 프로토콜은 혐 기성 철 부식 및 메탄 산화 공정에서 미생물 호흡 뿐만 아니라 그 연구에 적용 미생물 연료 셀30,31이 됩니다.
우리의 시스템 옴 c통해 동유럽 표준시의 속도 제한 과정 S. oneidensis 씨-1 단층 biofilm의-대련 청 려 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라 옴 c의 생 화 확 적인 특성에 대 한 인기 실험-대련 청 려. 예를 들어 옴 c공동 인자로 묶는 flavins의 다른 농도의 추가-대련 청 려 허용 플 라빈 바인딩된 옴 c-의 형성에 대 한 분리 상수 (Kd ~ 10 µ M)의 전기 화학 정량화 대련 청 려 단지32,,3334. 또한, 우리의 최근 작품 시연 옴 c통해 역 전자 역류 과정-대련 청 려 수 수 음극 현재 생산33,34통해 특징. 그것은 전자 역류는와 관련 된 양성자 가져오기 OM에 걸쳐 chemiosmotic ATP 합성35;에 대 한 원본으로 제시 되었다 따라서, 그것은 큰 관심 양성자 옴 c전자 혈 류 속도에 미치는 영향을 검토-대련 청 려.
결론적으로, 우리는 중수소 KIE 옴 c-대련 청 려 사용 S. oneidensis 씨-1 생활을 통해 동유럽 표준시에 검사 기술을 개발 했다. 기술을 사용할 수 있습니다 톰 c의 특성-대련 청 려로 KIE 관찰, 그리고 그것은 잠재적으로 다른 electrogenic 미생물에 적용. 우리는이 방법론 옴 c-대련 청 려 비보를 통해 직접 동유럽 표준시를 조사 하는 일반적인 기술 될 수 있습니다 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 24000010, 17 H 04969, 일본 사회에서 특별히 추진 연구 및 JP17J02602, 미국 사무실의 해군 연구 글로벌 (N62909-17-1-2038)는 선진적인 재정적으로 지원 했다. Y.T.는 JSP 연구원 이며 프로그램을 통해 JSP에 대 한 선도 대학원 학교 (공로) 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
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