Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direto de deteção eletroquímica de c-tipo complexos citocromo embutidos na membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complexos citocromo; OM c- Cyts) tem recentemente emergiu como um método analítico de células inteiras romance para caracterizar o bacteriano transporte de elétrons da cadeia respiratória para o exterior da célula, referido como o transporte de elétrons extracelular (EET). Enquanto o caminho e a cinética do fluxo de elétrons durante a reação de EET têm sido investigados, um método eletroquímico de células inteiras para examinar o impacto do transporte de cátion associado com EET não ainda foi estabelecido. No presente estudo, um exemplo de uma técnica bioquímica para examinar o efeito de cinética isótopo deutério (KIE) sobre EET através de OM c- Cyts usando um micróbio de modelo, Shewanella oneidensis MR-1, é descrita. A KIE sobre o processo EET pode ser obtido se a EET através de OM c- Cyts atua como o passo limitante na produção atual microbiana. Para o efeito, antes da adição de D2O, o sobrenadante foi substituído com mídia fresca contendo uma quantidade suficiente do doador de elétron para suportar a taxa de upstream reações metabólicas e para remover as células planctônicas de um uniforme monocamada biofilme sobre o eletrodo de trabalho. Métodos alternativos para confirmar o limitante passo na produção atual microbiana como EET através de OM c- Cyts também são descritos. Nossa técnica de um ensaio eletroquímico células inteiras para investigar a cinética de transporte de prótons pode ser aplicada a outras cepas microbianas eletroativos.
Introduction
Surgiram recentemente Técnicas eletroquímicas para caracterizar diretamente uma proteína redox em uma célula bacteriana intacta desde a descoberta de cepas microbianas redução de metal, como S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, que tem complexos de citocromo c-tipo de membrana externa (c-Cyts OM) expostos à célula exterior1,2,3,4,5. O OM c- Cyts mediar o transporte de elétrons da cadeia respiratória para substratos sólidos localizado extracelularmente. Este transporte é referido como transporte de elétrons extracelular (EET)1,6 e é um processo crítico para biotecnologias emergentes, tais como células de combustível microbianas6. Portanto, para entender a cinética EET subjacente e mecanismos e a sua ligação à fisiologia microbiana, OM c -Cyts foram investigados usando toda a célula eletroquímica4,7, combinado com microscopia 8 , 9, espectroscopia de10,11e biologia molecular2,4. Em contraste, métodos para investigar o impacto do transporte de cátion EET-associados, por exemplo, os prótons, na cinética EET em células vivas foram mal estabelecidos, apesar do transporte de protões através das membranas bacterianas, tendo um papel crítico sinalização, homeostase e energia produção12,13,14. No presente estudo, descrevemos uma técnica para examinar o impacto do transporte de prótons na cinética EET em S. oneidensis MR-1 célula usando medições eletroquímicas célula inteira, que requer a identificação da etapa limitante de produção atual de microbiana15.
Uma maneira direta para avaliar a contribuição do transporte de prótons sobre a EET associado é o efeito de cinética isótopo deutério (KIE). A KIE é observável como a mudança na cinética de transferência de elétrons sobre a substituição de prótons com íons de deutério, que representa o impacto do transporte de prótons na transferência de elétrons cinética16. A teoria de KIE em si bem estabeleceu usando medições eletroquímicas com enzimas purificada17. No entanto, desde que a produção atual em S. oneidensis MR-1 resulta do múltiplo, processos diversos e flutuação18, um não pode simplesmente identificar EET como o processo limitante. Para observar o KIE em processos de transporte de prótons juntamente com EET, precisamos confirmar que a atual produção microbiana é limitada pelo transporte de elétrons através de OM c- Cyts para o eletrodo. Para este efeito, substituímos a solução sobrenadante por meio fresco, que contém uma alta concentração de lactato como doador de elétron no pH ideal e as condições de temperatura antes da medição KIE; Esta substituição serviu dois papéis: (1) reforçada a taxa dos processos metabólicos montante em comparação com a EET e (2) omitido as células de natação no sobrenadante libertado o biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 sobre o trabalho do eléctrodo ( eletrodo de estanho dopado com óxido (ITO) índio). O protocolo detalhado apresentado destina-se a ajudar novos praticantes manter e confirmar que o processo EET é o passo determinante de taxa.
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Protocol
1. formação de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 em um eletrodo de ITO (Figura 1)
Nota: Para evitar a contaminação do reator eletroquímico com outros micróbios, toda a mídia, Implementos e componentes do reator eletroquímico devem ser esterilizadas com antecedência. Quando usando células S. oneidensis MR-1 e construir os reatores eletroquímicos, devem efectuar-se todos os procedimentos em uma bancada limpa.
- Cultivo de células de S. oneidensis MR-1
Nota: Um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 foi formado em um ITO eletrodo as condições a seguir relatado anteriormente4.- Para o cultivo de células de S. oneidensis MR-1, adicione uma colônia de S. oneidensis MR-1 cultivadas em uma placa de ágar compreendendo Luria-Bertani (LB) (20 g/L) e bacto ágar (15 g/L) em 15 mL de meio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h em condições aeróbias, com agitação a 160 rpm.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 6.000 × g por 10 min e resuspenda o pellet de células resultante em 15 mL de meio definido (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], O [0,08 g/L], CaCl2·2H2NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] e 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido etanesulfónico [HEPES; 7,2 g/L]), completados com lactato de 10 mM e 0,5 g/L de extrato de levedura como fonte de carbono e oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.
- Além disso, cultivar a suspensão de eritrócitos por via aeróbia a 30 ° C, por 12 h com agitação a 160 rpm e centrifugar novamente a 6.000 × g por 10 min. Lave o centrifugado resultante duas vezes com DM médio por centrifugação por 10min a 6.000 g × antes da eletroquímica experimento.
- Construção de um reator eletroquímico do três-elétrodo (Figura 1)
- Colocar um substrato ITO como o eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.
- Posteriormente, inserir um cilindro de vidro (diâmetro de 2 cm) e um cover de politetrafluoretileno (PTFE). Em seguida inserir Ag/AgCl (KCl saturado) e um fio de platina no reator como os eletrodos de referência e contador, respectivamente.
Nota: Para evitar o vazamento de ar e solução, insira uma folha de borracha butílica entre cada componente. - Adicione 4,0 mL de DM suplementado com lactato de 10 mM e extracto de levedura 0,5 g/L no reator eletroquímico.
- Depois de confirmar que não há nenhum vazamento do reator eletroquímico, fluxo do gás do nitrogênio no reator eletroquímico mais 20 min para manter condições anaeróbicas dentro do reator eletroquímico.
Nota: Para evitar a contaminação com outros micróbios, o gás deve ser filtrado antes de ela flui para o reator eletroquímico. - Conectar o reator eletroquímico para um potentiostat e aplicar 0,4 V (contra eletrodo padrão de hidrogênio, ela) para o eletrodo de ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico a 30 ° C, usando um sistema de circulação de água externa.
Nota: Para evitar o efeito de um campo elétrico externo, o reator eletroquímico deve ser colocado em uma gaiola de Faraday.
- Eletroquímico cultivo de S. oneidensis MR-1 células (Figura 1 e Figura 2)
- Ajustar a densidade da célula da suspensão obtida na etapa 1.1 para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) com DM, complementada pela levedura de lactato e 0,5 g/L de 10mm extrair.
Nota: Para obter o correto OD600, aplica a suspensão de células de OD600 ≤ 0.8 a um espectrómetro de UV-vis antes de ajustar o OD600 para 1,43. - Adicionar 0,3 mL de suspensão de células no reator eletroquímico através do orifício de injeção usando uma seringa: o OD600 no reator muda para 0,1.
Nota: A adição de 0,3 mL de suspensão de células com OD600 = 1,43 em reator eletroquímico contendo 4,0 mL resultados médios em 4,3 mL de solução com uma OD600 = 0.1. Ao utilizar outros reactores com volumes diferentes, o cálculo da densidade celular é necessário. - Continue a aplicação potencial em 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO para 25 h.
Nota: Para a formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, certifique-se que a corrente produzida apresenta um desvio inferior a 50% da Figura 2.
- Ajustar a densidade da célula da suspensão obtida na etapa 1.1 para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) com DM, complementada pela levedura de lactato e 0,5 g/L de 10mm extrair.
2. substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com lactato de 10 mM (Figura 3)
- Interromper o aplicativo potencial e desconecte o potentiostat e o sistema de circulação de água do reator eletroquímico.
- Substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com 10 mM de lactato
- Fluxo do gás do nitrogênio em um frasco contendo DM com 10 mM de lactato mais 20 min para remover o oxigênio do meio.
- Remova lentamente todo o sobrenadante dentro do reator eletroquímico, usando uma seringa, fluindo sob o gás nitrogênio (Figura 3a, b).
Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo ITO pelo gás do nitrogênio, o gás deve fluir acima da superfície do líquido. - Adicione 4,0 mL de DM fresco contendo lactato de 10 mM, usando uma seringa (Figura 3C).
Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo de ITO, injete lentamente o médio ao longo da parede do reator eletroquímico. Para manter o biofilme molhado, o meio deve ser adicionado imediatamente após a remoção do sobrenadante. Injeção do médio até 1 min após a remoção do sobrenadante não afeta a produção atual do biofilme de S. oneidensis MR-1. - Inclinar o reator eletroquímico para remover todo o sobrenadante fixado na parede do reator eletroquímico.
- Repita as etapas 2.2.2-2.2.4 três vezes no total.
- Parar o fluxo de gás e conectar o reator eletroquímico para a potentiostat novamente, aplicando 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO no 303 K.
3. adição de água de deutério para medir a KIE sobre o processo EET (Figura 4)
- Confirme que a produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 é estável e não aumenta rapidamente. Se a corrente aumenta abruptamente, espere até que a corrente se estabiliza em um aumento de 5% mais de 10 min.
Nota: A formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, sem contaminação de outras cepas microbianas foi confirmada por sequências de rDNA e uma imagem de elétrons varredura microscópica do biofilme sobre um eletrodo de ITO, como relatado anteriormente4. Para confirmação da limitação taxa pelo processo de EET, monitore o efeito da adição de shuttling mediadores de elétrons como a 100 µM antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Consulte a seção de Resultados de representante e referência15 para maiores detalhes. - Adicione 40 µ l de 50% (v/v) anóxica D2O no reator eletroquímico utilizando uma seringa de tal forma que a concentração é de 0,5% (v/v) D2O no reator.
Nota: Para evitar danificar o biofilme por adição de2O D, injete o D2O drop-wise. - Esperar a corrente estabilizar e posteriormente adicionar a D2O até 4,0% (v/v).
Nota: Para obter o valor KIE (a taxa de produção atual na presença de D2O e H2O), verificar o efeito do mesmo volume de adição de H2O na produção atual.
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Representative Results
Após 25 h de potencial aplicação em 0,4 V (contra ela), formou-se um biofilme monocamada sobre o eletrodo de trabalho de vidro de ITO, que anteriormente foi confirmado por uma microscopia eletrônica ou uma microscopia confocal4. O curso de tempo representativa da atual produção do S. oneidensis MR-1 durante a formação de um biofilme monocamada é mostrado na Figura 2. Embora a corrente altera em cada medição, a corrente produzida não apresentam um desvio de mais de 50% do valor na Figura 2 se um biofilme monocamada uniformemente é formado.
Após a substituição do líquido sobrenadante com DM fresco com lactato de 10 mM para maximizar a taxa de processos metabólicos e lavar o biofilme monocamada (Figura 3), uma corrente anódica estável (aproximadamente 5% de aumento em 10 min) pode ser observada sob 0,4 V (contra ela ) aplicação (figura 4a). Se a corrente anódica aumenta abruptamente, espere até que a corrente estabiliza. É muito provável que os procedimentos para substituição de sobrenadante descrito na secção 2 podem danificar o biofilme e reconstrução pode ocorrer.
A linha contínua na figura 4a é o resultado representativo para a mudança atual microbiana induzida através da adição de2O D. A adição de 1,0% (v/v) D2O diminuiu acentuadamente a corrente microbiana dentro de 10 s, enquanto quase sem diminuição atual foi observada pela adição de H2O (linha pontilhada na figura 4a)15. A mesma tendência foi reproduzida pelo menos quatro experimentos separados. A adição sequencial de D2O em concentrações finais variando de 0,5% para 2,0% (v/v) claramente exibida forte supressão da atual produção (figura 4a)15. Porque a atual produção microbiana gradualmente recuperado provavelmente devido ao efeito fisiológico de19,20, KIE deve ser atribuído à diminuição atual logo após a adição de D2O. Em um relatório anterior, a atual produção em cerca de 10 min após a adição de D2O para calcular o valor de KIE15foram coletados.
Usando dois métodos, confirmamos que a diminuição observada atual por meio da adição de2O D é imputável a KIE sobre a EET através do complexo de Cyts - cOM. Primeiro, nós adicionamos 1 riboflavina µM (RF) ou o mononucleótido de flavina (FMN) no reator eletroquímico antes e após a adição de2O D, que pode ser usada para estudar EET em S. oneidensis MR-1. No caso de S. oneidensis MR-1, flavinas especificamente aceleram o processo EET por ligação com OM c- Cyts em poucos segundos, porque as flavinas funcionam como ligação não-covalente cofactores21,22, 23. por conseguinte, um aumento de corrente anódico instantâneo por adição de flavin indica limitação de taxa pelo processo de EET através de OM c- Cyts (Figura 5). Confirmamos ainda mais o efeito de vaivém mediadores de elétron na KIE. Moléculas pequenas redox, por exemplo, antraquinona-1-sulfonato (α-AQS), finalizar o processo EET pela difusão da cadeia de transporte de elétrons microbiana para o eletrodo, em vez de transporte de elétrons direto via OM cCyts -15 , 24. aqui, a adição de 100 µM α-AQS reforçada a produção atual por mais de 5-fold (figura 4b), que indica que a cinética das reações metabólicas são rápidos o suficiente para fazer a EET processar o passo limitante. Consistentemente, a atual produção mediada por α-AQS permaneceu inalterada por D2O adição (figura 4b), demonstrando que o potencial atraso em reações metabólicas por D2O não faz com que o grande KIE observada em figura 4a .
A combinação dessas duas abordagens para observar a KIE no transporte de elétrons com OM c- Cyts é o ponto crítico deste relatório, e especificamente, shuttling mediadores de elétrons pode ser aplicável a outros eletroativos biofilmes. Além disso, uma vez que nós confirmamos que a mudança atual é atribuída ao processo EET, nós poderia avaliar o efeito de um mutante de exclusão parcial de OM c- Cyts ou de uma flavina associada com OM c- Cyts sobre o próton transferência cinética, comparando a KIE em ambos os casos,15. Quando O D2foi adicionado na presença de FMN vinculação com OM c- Cyts, a atual diminuição foi reduzida tal que foi menor do que sem FMN, indicando que a ligação do FMN alterada a via de transporte de prótons e sua cinética (Figura 4 c)15.
Figura 1: reator eletroquímico utilizado neste estudo. Fotografia da célula eletroquímica, antes da construção (uma) e após a construção (b). (c) ilustração esquemática do reator eletroquímico após 25 h de inoculação eletroquímica em 0,4 V vs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: produção atual representante de S. oneidensis MR-1 durante a formação de biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO. Uma seta indica o momento da adição da suspensão de células no reator eletroquímico. A mesma tendência foi reproduzida pelo menos cinco experimentos individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: substituição do líquido sobrenadante de meio fresco definido (DM) com lactato de 10 mM. (um) gás nitrogênio fluxo acima da superfície do líquido. (b) remoção do sobrenadante de reator eletroquímico. (c) adição de 4,0 mL fresco DM contendo lactato de 10 mM. Após a adição de médio, o reator deve ficar inclinado para remover o sobrenadante fixado na parede do reator. Realizar esses procedimento (um–c) três vezes no total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito da adição de2O D sobre a produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1. Tempo versus produção atual para um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 em um sistema eletroquímico contendo 10 mM lactato (um), um adicional de 100 µM antraquinona-1-sulfonato (α- AQS) (b), ou um adicional de 2 µM o mononucleótido de flavina (FMN) (c). A mesma tendência foi reproduzida pelo menos quatro experimentos individuais. As setas indicam a hora da adição de D2O (linha contínua) ou H2O (linha pontilhada). Os dados correspondentes à linha pontilhada foram normalizados para o ponto de dados apenas antes da adição de D2O nos dados de linha sólida. A concentração de D2O no reator eletroquímico é indicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: avaliação da taxa-determinando um passo na produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 pela adição de flavinas. Tempo versus produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1, na presença de lactato 10mm (linha contínua), lactato de 1.0 mM (linha tracejada) e lactato de 0,1 mM (linha pontilhada). Uma seta indica o ponto de tempo no qual 1 µM o mononucleótido de flavina (FMN) foi adicionado para os reatores eletroquímicos. Na presença de lactato de 10 mM, a adição de FMN drasticamente aumentada a produção atual, demonstrando que o transporte de elétrons extracelular (EET) através da c-tipo complexos citocromo embutidos na membrana externa bacteriana (OM c - Cyts) é a determinante de taxa. Menos lactato concentração no reator eletroquímico causado um realce menor atual por adição de FMN, indicando que o suprimento de elétrons das reacções metabólicas upstream para OM c- Cyts tornou-se gradualmente mais lento do que a taxa EET. A mesma tendência foi reproduzida pelo menos dois experimentos individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso ensaio eletroquímico de célula inteira tem várias vantagens técnicas em comparação com eletroquímica de proteína. Enquanto a purificação de proteínas requer várias etapas procedimentos demorados, nosso método de célula inteira leva um dia de formação de biofilmes auto-organizado após a cultura de células. Para obter uma interacção estável entre OM c- Cyts e o eletrodo, precisamos apenas de esterilização e limpeza da superfície do eletrodo; não exige modificação de eletrodos para organizar a orientação das proteínas4, por exemplo, s. oneidensis MR-1 intrinsecamente prende-se o eletrodo, enquanto orientando o OM c- Cyts na mesma direção25 , 26 , 27. em contrapartida, as reações eletroquímicas de proteínas com sensibilidade são afetadas pela distância entre sites de redox na proteína e o eletrodo; assim, as proteínas purified devem ser cuidadosamente orientada28,29. Mais importante, o ensaio eletroquímico células inteiras diretamente caracteriza complexos de - Cyts cOM incorporados em uma membrana lipídica com possíveis interacções com outras proteínas de membrana e então reflete o proton nativo gerenciamento no OM c - Cyts (isto é muitas vezes difícil de imitar usando proteínas purified).
No entanto, nossa técnica tem uma limitação no que diz respeito à concentração de D2High O. concentrações de D2O potencialmente retardar processos metabólicos e crescimento19; Portanto, foi realizado os experimentos com as concentrações de2O D que foram menos de 4% (v/v) no presente protocolo. Além disso, porque a expressão gênica em micróbios é regulada de forma complexa, pequenas diferenças condicionais podem afetar fortemente o fenótipo microbiano e até mesmo a cinética de transporte de elétrons. Em particular, a concentração de lactato diminui durante a produção atual do S. oneidensis MR-1 biofilme; Portanto, é importante conduzir os experimentos KIE antes do processo limitante desloca-se para montante reações metabólicas.
Mais o ponto crítico para obter com sucesso a KIE é para esclarecer e confirmar a condição em que o elétron transporte através de limites de - Cyts cOM a taxa de produção atual, monitorizada por meio de ensaio eletroquímico o célula inteira. Neste protocolo, vamos explicar como confirmar que a taxa da EET limita e reflete a atual produção microbiana. Introduzimos uma combinação dos dois métodos; Observação da mudança atual por flavin adição23e a adição de2O D na presença de um mediador elétron difusão, por exemplo, α-AQS15 (Figura 4 e Figura 5). Se um não pode fazer a EET processo limitante, a razão mais provável seria formação incompleta ou distanciamento físico do biofilme monocamada ou contaminação por outros micróbios. Recomendamos vivamente que confirmando a formação de biofilme a monocamada por varredura, microscopia eletrônica ou microscopia confocal. É muito provável que o processo de substituição de médias danifica o biofilme; Portanto, a remoção e a injeção do meio devem ser conduzidas lentamente e gás nitrogênio devem fluir sobre a superfície líquida (Figura 3). Se um biofilme monocamada uniforme não faz o EET processo limitante, é melhor reexaminar os componentes médias e condições de medição, por exemplo, suplementação de lactato em uma concentração maior do que 10 mM, para maior aceleração do montante processos metabólicos. Estas considerações são igualmente importantes em outros tipos de micróbios capazes de EET. Mediadores de elétron especificamente podem ser usados para confirmar que o processo EET é limitante em outros tipos de micróbios capaz de EET, incluindo misturas de cepas bacterianas; assim, consideramos este protocolo como um método geral para investigar o impacto cinético de prótons no transporte de elétrons direto na interface eletrodo/bactérias. Considerando que a EET é observado em outras cepas microbianas e consórcios, tanto quanto o processo EET é limitante, este protocolo é aplicável para estudar a respiração microbiana em processos de metano-oxidação e corrosão anaeróbica do ferro, assim como em 30,31de células de combustível microbiana.
Nosso sistema de biofilme de monocamada S. oneidensis MR-1 com o processo limitante de EET através de OM c- Cyts pode ser usado não só para os experimentos KIE mas também para a caracterização bioquímica da OM c- Cyts. Por exemplo, a adição de diferentes concentrações de flavinas que ligam como cofatores para OM c- Cyts permite a quantificação eletroquímica da constante de dissociação (Kd ~ 10 µM) para a formação de flavin-limite OM c- Cyts complexos32,33,34. Além disso, nosso trabalho recente demonstrou que o processo de refluxo de elétron inversa através de OM c- Cyts poderia ser caracterizada através da produção corrente catódica33,34. Tem sido proposto que o retorno do elétron está associado a importação de prótons através da OM como uma fonte para síntese de ATP quimiosmótica35; Portanto, é de grande interesse para examinar o impacto de prótons sobre a cinética de refluxo de elétron em OM c- Cyts.
Em conclusão, desenvolvemos técnicas para examinar o deutério KIE sobre a EET através de cOM - Cyts usando vivendo S. oneidensis MR-1. A técnica pode ser usada para a caracterização da OM c- Cyts, bem como observação KIE e é potencialmente aplicáveis a outros micróbios electrogenic. Acreditamos que essa metodologia pode ser uma técnica geral para investigar a EET diretamente via OM c- Cyts em vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado financeiramente por um subsídio para investigação especialmente promovido da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) número de concessão KAKENHI 24000010, 17H 04969, Japão e JP17J02602, nos escritório do Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. é um pesquisador de JSPS e apoiado por JSPS através do programa para liderar graduação escolas (mérito).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
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