Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в Shewanella oneidensis MR-1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

Summary

Здесь мы представляем протокол поклеточного электрохимических экспериментов для изучения вклада протонного транспорта по ставке внеклеточного переноса электронов через внешней мембраны цитохромов комплекс в Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

Прямых электрохимических обнаружения c-типа цитохрома комплексы, встроенных в бактериальной внешней мембраны (внешней мембраны c-типа цитохрома комплексов; ОМ c- Cyts) имеет недавно возникла как Роман поклеточного аналитического метода характеризовать бактериальной переноса электронов от дыхательной цепи на улицу клетки, называют внеклеточного переноса электронов (EET). Хотя были исследованы пути и кинетика электронов потока во время реакции EET, поклеточного Электрохимический метод для изучения воздействия транспорта катион, связанные с EET еще не созданы. В настоящем исследовании примером биохимического метода рассмотреть воздействие кинетической изотопа дейтерия (ки) на EET через ом c- Cyts, используя модель микробом, Shewanella oneidensis MR-1, описан. КИ на процесс EET могут быть получены, если EET через ом c- Cyts действует как тариф ограничивая шаг в микробной текущего производства. С этой целью, перед добавлением D2O супернатанта решения был заменен свежие средства массовой информации, содержащие достаточное количество электронов доноров поддержать уровень вверх метаболических реакций и удалить планктонных клетки из единой однослойная биопленки на рабочем электроде. Альтернативные методы для подтверждения ограничения скорости шаг в микробной текущего производства как EET через ом c- Cyts также описаны. Наш метод поклеточного электрохимического анализа для изучения кинетики протонного транспорта может быть применен к другим Электроактивные микробных штаммов.

Introduction

Электрохимические методы непосредственно характеризуют редокс белка в нетронутыми бактериальной клетке недавно появились после обнаружения металла сокращение микробных штаммов, например S. oneidensis MR-1 или Geobacter sulfurreducens СПС, которые имеют внешняя мембрана тип c тситохрома комплексы (ом c-Cyts) подвергается ячейку внешней1,2,3,4,5. ОМ c- Cyts посредником переноса электронов от дыхательной цепи для твердых субстратов внеклеточно расположенных. Этот транспорт называется внеклеточного переноса электронов (EET)1,6 и представляет собой критический процесс для новых биотехнологий, в частности микробные топливные элементы6. Таким образом чтобы понять основной EET кинетики и механизмов и ее связь с микробной физиологии, ом c -Cyts были исследованы с помощью поклеточного электрохимии4,7, в сочетании с микроскопией 8 , 9,10,спектроскопии11и молекулярной биологии2,4. Напротив методы для изучения последствий EET-связаны катионов транспорта, например, протонов, на кинетику EET в живых клетках едва созданы, несмотря на протонного транспорта через бактериальной мембраны, что решающую роль сигнализации, гомеостаза и энергии производство12,,1314. В настоящем исследовании, мы опишем технику для изучения воздействия протонного транспорта на кинетику EET в ячейке S. oneidensis MR-1 с помощью поклеточного электрохимических измерений, которая требует идентификации тариф ограничивая шаг в микробные текущего производства15.

Прямой способ оценить вклад протонного транспорта на связанные EET является эффект кинетическая изотопа дейтерия (ки). КИЕ наблюдается как изменения в кинетика электронов передачи после замена протонов с ионы дейтерия, который представляет воздействия транспорта протон электрон передачи кинетики16. Теория KIE, сама была создана хорошо с использованием электрохимических измерений с очищенной ферментов17. Однако, поскольку текущее производство в S. oneidensis MR-1 результаты из нескольких, разнообразных и меняющихся процессы18, один не может идентифицировать просто EET как процесс ограничения скорости. Соблюдать KIE на Протон транспортных процессов в сочетании с EET, мы должны подтвердить, что микробные текущего производства ограничивается переноса электронов через ом c- Cyts к электроду. Для этой цели мы заменили супернатанта решение с свежей средой, с высокой концентрацией лактата как донора электрона на оптимальный рН и температурные условия перед KIE измерения; Эта замена служил две роли: (1) повысить уровень вверх метаболических процессов, по сравнению с EET и (2) опущены плавательный клетки в надосадке освобожден от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 на рабочих электродом ( Индия легированный оловом оксид (ITO) электрод). Представлен подробный протокол призван помочь новичкам сохранить и подтвердить, что процесс EET курс определение шаг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. формирование монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 на Ито электрода (рис. 1)

Примечание: Для предотвращения загрязнения электрохимических реактора с другими микробами, все средства массовой информации, внедряет и компонентов электрохимических реактора должны быть простерилизованы заранее. Когда с использованием клеток S. oneidensis MR-1 и строительства электрохимического реакторов, все процедуры должны проводиться на лавочке чистой.

  1. Культивирование клеток S. oneidensis MR-1
    Примечание: Однослойная биопленки S. oneidensis MR-1 был сформирован на Ито электрода условий сообщалось ранее4.
    1. Рост клеток S. oneidensis MR-1, добавьте один колонии S. oneidensis MR-1 выросла на плите агар составе Бертани Лурия (LB) (20 г/Л) и bacto агар (15 г/Л) в 15 мл среды фунтов (20 г/Л) на 30 ° C в течение 24 ч в аэробных условиях встряхивании в 160 об/мин.
    2. Центрифуга суспензию клеток на 6000 × g за 10 мин и Ресуспензируйте Пелле результирующая ячейка в 15 мл определенной среды (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 г/Л], CaCl2·2H2O [0,08 г/Л], NH4Cl [1,0 г/Л], MgCl2· 6 H2O [0,2 г/Л], [10 г/Л], NaCl и 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic кислоты [HEPES; 7,2 г/Л]), с 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт как источник углерода и микроэлементов для S. oneidensis MR-1 , соответственно.
    3. Далее культивировать суспензию клеток высокоусвояемого при 30 ° C в течение 12 ч при встряхивании в 160 об/мин и центрифуги снова на 6000 × g для 10 минут вымыть результирующая ячейка Пелле дважды с DM среднего центрифугированием 10 мин на 6000 × g перед электрохимические эксперимент.
  2. Строительство 3 электрод электрохимических реактора (рис. 1)
    1. Ставлю ITO подложке рабочих электродом в нижней части реактора.
    2. Впоследствии вставьте стеклянный цилиндр (диаметром 2 см) и крышкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Затем вставьте Ag/AgCl (KCl насыщенных) и провод платины реактора как ссылка и Счетчик электродов, соответственно.
      Примечание: Для предотвращения утечки воздуха и решения, вставьте лист бутилкаучука между каждого компонента.
    3. Добавление 4.0 мл дм, дополненные лактат 10 мм и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт в электрохимических реактора.
    4. После подтверждения, что нет никакой утечки из электрохимических реактора, поток газ азот в электрохимических реактора более 20 мин для поддержания анаэробных условий внутри электрохимических реактора.
      Примечание: Для предотвращения загрязнения с другими микробами, газ должны быть отфильтрованы прежде, чем она впадает в электрохимических реактора.
    5. Подключите электрохимических реактора к потенцио и применять 0,4 V (по сравнению с стандартным водорода электрода, она) к электроду Ито, сохраняя температуру электрохимических реактора при 30 ° C, с помощью системы циркуляции воды внешнего.
      Примечание: Чтобы предотвратить эффект внешнего электрического поля, электрохимических реактора должны помещаться в клетку Фарадея.
  3. Электрохимические культивирования клеток S. oneidensis MR-1 (рис. 1 и рис. 2)
    1. Отрегулируйте плотность ячеек подвески, полученные на этапе 1.1 оптической плотности 1.43 600 Нм (600OD) с DM, дополнен 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжей экстракт.
      Примечание: Чтобы получить правильный ОД600, примените суспензию клеток ОД600 ≤ 0,8 UV-vis-спектрометр до корректировки ОД600 до 1,43.
    2. Добавление 0,3 мл суспензии клеток в электрохимический реактор через порт впрыска, с помощью шприца: OD600 в реакторе изменяется до 0,1.
      Примечание: Добавление 0,3 мл суспензии клеток с ОД600 = 1.43 в электрохимических реактора, содержащие 4.0 мл средние результаты в 4.3 мл раствора с ОД600 = 0.1. При использовании других реакторов с различными объемами, расчет плотности ячейки не требуется.
    3. Продолжить потенциальное применение на 0,4 V (или она) Ито электрод для 25 ч.
      Примечание: Для образования монослоя биопленки на Ито электрода, убедитесь, что произведенные ток exhibits отклонение меньше, чем 50% из рисунка 2.

2. Замена супернатант со свежими DM средний с лактат 10 мм (рис. 3)

  1. Остановить потенциальное применение и отсоедините электрохимический реактор от потенцио и системы циркуляции воды.
  2. Замена супернатант со свежими DM средний с 10 мм лактата
    1. Поток газа азота в бутылку, содержащие DM с 10 мм лактата более 20 мин для удаления кислорода из среды.
    2. Медленно извлеките все супернатант внутри электрохимических реактора с помощью шприца, под проточной газ азот (Рисунок 3А, b).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито азот газ, газ должна течь над поверхностью жидкости.
    3. Добавление 4.0 мл свежего дм, содержащие 10 мм лактат, с помощью шприца (рис. 3 c).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито, медленно вводить среднего вдоль стены электрохимических реактора. Чтобы сохранить влажные биопленки, носитель следует добавить сразу же после удаления супернатант. Инъекции средних по 1 мин после удаления супернатант не влияет на текущее производство от биопленки S. oneidensis MR-1.
    4. Наклонной электрохимических реактора для удаления всех супернатант прикреплена к стене электрохимических реактора.
    5. Повторите шаги 2.2.2-2.2.4 три раза в общей сложности.
  3. Остановить поток газа и подключить электрохимических реактора к потенцио снова, применяя 0,4 V (или она) к электроду Ито в 303 K.

3. добавление воды дейтерия для измерения KIE на процесс EET (рис. 4)

  1. Убедитесь, что текущее производство от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 является стабильным и не быстро увеличиваться. Если ток резко увеличивается, подождите, пока тока стабилизируется в течение 5% увеличение свыше 10 мин.
    Примечание: Формирование монослоя биопленки на Ито электрода без загрязнения других микробных штаммов был подтвержден рДНК последовательности и сканирования электрона микроскопических изображений биопленки на Ито электрода, как сообщалось ранее,4. Для подтверждения ставки ограничения в процессе EET контролировать эффект добавления челночные электрона посредников например 100 мкм присутствии антрахинона-1-сульфонат (α-AQS). В разделе Представитель результаты и ссылки15 для более подробной информации.
  2. 40 мкл аноксии 50% (v/v) D2O, в электрохимический реактор с помощью шприца, таким образом, чтобы концентрация составляет 0,5% (v/v) D2O в реакторе.
    Примечание: Чтобы предотвратить повреждение биопленки добавлением D2O, придать D2O каплям.
  3. Подождите для тока стабилизации и впоследствии добавить Д2O до 4,0% (v/v).
    Примечание: Чтобы получить значение Ки (отношение текущего производства при наличии D2O и H2O), проверьте эффект такой же объем H2O Добавление текущего производства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После 25 h потенциальных приложений на 0,4 V (или она) однослойная биопленки был сформирован на рабочем электроде стекла ITO, который ранее был подтвержден confocal микроскопии4или растровая электронная микроскопия. Представитель время курс текущего производства во время образования монослоя биопленки от S. oneidensis MR-1 показано на рисунке 2. Хотя текущий изменяет в каждом измерении, производимых ток не exhibit отклонение более 50% от стоимости на рисунке 2 , если равномерно формируется монослой биопленки.

После замены супернатант с свежими DM с 10 мм лактат максимально увеличить скорость метаболических процессов и мыть монослоя биопленки (рис. 3) под 0,4 V (по сравнению с она может наблюдаться стабильной анодного тока (около 5% увеличение в 10 мин) ) приложения (рис. 4a). Если анодного тока резко увеличивается, подождите, пока тока стабилизируется. Это весьма возможно, что процедуры супернатанта замены, описанные в разделе 2 может повредить биопленки и реконструкции может произойти.

Сплошная линия в рисунке 4a является представителем результат для микробной текущие изменения, вызванные добавлением2O D. Добавление 1,0% (v/v) D2O резко снизился микробной ток в течение 10 сек, в то время как почти не текущее снижение наблюдалось путем добавления H2O (пунктирная линия на рисунке 4a)15. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере четыре отдельных экспериментов. Последовательное Добавление D2O в окончательном концентрациях от 0,5% до 2,0% (v/v) явно выставлены сильное подавление в текущем производства (рис. 4a)15. Потому что микробной текущего производства постепенно восстановился вероятно из-за физиологического эффекта19,20, Ки следует назначить текущее снижение вскоре после добавления D2O. В предыдущем докладе мы собрали текущего производства в примерно 10 мин после добавления D2O для вычисления значения KIE15.

С помощью двух методов, мы подтвердили, что наблюдаемое уменьшение текущей путем добавления2O D объясняется KIE на EET через ом c- Cyts комплекс. Во-первых мы добавили 1 мкм рибофлавин (RF) или Флавинмононуклеотид (FMN) в электрохимических реактора до и после добавления D2O, которые могут быть использованы для изучения EET в S. oneidensis MR-1. В случае S. oneidensis MR-1, flavins специально ускорить процесс EET путем связывания с ом c- Cyts в течение нескольких секунд, потому что flavins функционировать как non ковалентные связывание кофакторов21,22, 23. Таким образом, мгновенное анодное нарастание добавлением Флавин указывает ограничение скорости EET процессом через ом c- Cyts (рис. 5). Мы далее подтвердил эффект челночные электрона посредников на ки. Редокс малых молекул, например, присутствии антрахинона-1-сульфонат (α-AQS), завершить процесс EET, диффундирующих от микробной электрон-транспортной цепи к электроду, вместо прямого переноса электронов через ом c- Cyts15 , 24. здесь, помимо 100 мкм α-AQS расширение текущего производства с более чем 5 раз (рис. 4b), который указывает, что кинетика метаболических реакций достаточно быстро, чтобы сделать процесс ограничения скорости шаг EET. Последовательно текущее производство, при посредничестве α-AQS остались незатронутыми D2O сложения (Рисунок 4b), демонстрируя, что потенциальные задержки в метаболических реакциях, D2O не вызывает больших KIE, наблюдается в рисунок 4a .

Сочетание этих двух подходов к наблюдать KIE на переноса электронов с ом c- Cyts является критической точкой настоящего доклада, и конкретно, челночные электрона посредников могут быть применимы к другим Электроактивные биопленки. Кроме того, после того как мы подтвердили, что текущее изменение назначен процесс EET, мы могли бы оценить эффект частичного удаления мутантов ом c- Cyts или Флавин, связанные с ом c- Cyts на Протон денежных кинетики, сравнивая ки в обоих случаях15. Когда D2O был добавлен в присутствии ФМн привязки с ом c- Cyts, текущее снижение был сокращен таким образом, чтобы он был меньше, чем без ФМн, указывающее, что привязка ФМн изменены протонного транспорта путь и его кинетика (Рисунок 4 c)15.

Figure 1
Рисунок 1: электрохимический реактор, используемые в данном исследовании. Фотография для электрохимической ячейки до строительства () и после строительства (b). (c) схематическая иллюстрация электрохимических реактора после 25 h электрохимических прививка на 0,4 V против она. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель текущее производство от S. oneidensis MR-1 во время образования биопленки монослоя на электроды ITO. Стрелка указывает время добавления суспензию клеток в электрохимических реактора. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере пять отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: замена супернатант свежие определенный средний (DM) с 10 мм лактат. () газ азот потока над поверхностью жидкости. (b) удаление супернатант из электрохимических реактора. (c) Добавление 4.0 мл свежего DM содержащий 10 мм лактат. После среднего сложения реактор следует наклонные удалить супернатант прикреплена к стене реактора. Проводить эти процедуры (–c) три раза в общей сложности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Эффект добавления2O D на текущее производство от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1. Времени по сравнению с текущего производства для монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 в электрохимические системы, содержащие 10 мм лактата (), дополнительные 100 мкм присутствии антрахинона-1-сульфонат (α- AQS) (b), или дополнительные 2 мкм Флавинмононуклеотид (FMN) (c). Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере четыре отдельных экспериментов. Стрелки указывают время добавления D2O (сплошная линия) или H2O (пунктирная линия). Данные, соответствующие пунктирной линии были нормализованы к точке данных перед добавлением D2O в сплошной линии данных. Указана концентрация D2O в электрохимических реактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: оценки определения ставки шаг в текущем производстве монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 путем добавления flavins. Времени по сравнению с текущей добычи монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 в присутствии 10 мм лактата (сплошная линия), 1,0 мм лактата (пунктирная линия) и 0,1 мм лактата (пунктирная линия). Стрелка указывает точку времени, в котором 1 мкм Флавинмононуклеотид (FMN) была добавлена в электрохимических реактора. При наличии 10 мм лактат, добавлением ФМн резко увеличился текущего производства, демонстрируя, что внеклеточного переноса электронов (EET) через c-типа цитохрома комплексы, встроенных в бактериальной внешней мембраны (OM c - Cyts) является определение курса. Менее лактат концентрация в электрохимических реактора вызванных меньше текущего повышение ФМн сложения, указывая, что электрон питания от вверх по течению метаболических реакций к ом c- Cyts постепенно стал медленнее, чем уровень EET. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере два отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наши поклеточного электрохимических пробирного имеет ряд технических преимуществ, по сравнению с белка электрохимии. В то время как очищение протеина требует длительных процедур многоступенчатый, наши поклеточного метод принимает один день самоорганизации биопленки после клеточной культуры. Для достижения стабильного взаимодействия между ом c- Cyts и электродом, нам нужно только стерилизации и очистка поверхности электрода; она не требует модификации электрода для Организации ориентации белки4, например, S. oneidensis MR-1 неразрывно придает на электроде, при этом ориентируясь ом c- Cyts в том же направлении25 , 26 , 27. В отличие от этого, электрохимических реакций белков, чутко подвержены расстояние между редокс сайтов в протеине и электродом; Таким образом очищенные белки должны быть тщательно ориентированной28,29. Что еще более важно, поклеточного электрохимических непосредственно характеризует ом c- Cyts комплексы внедрены в мембранных липидов с возможным взаимодействиями с другими белками мембраны и таким образом отражает родной Протон управления в OM c - Cyts (это часто трудно имитировать с помощью очищенные белки).

Однако наша техника имеет ограничение в отношении концентрации D2O. высокой концентрации D2O потенциально замедлить метаболических процессов и роста19; Таким образом мы провели эксперименты с использованием D2O концентрации, которые были меньше чем 4% (v/v) в настоящем Протоколе. Кроме того потому что экспрессии генов в микробы регулируется сложным образом, небольшие условного различия могут сильно повлиять на микробной фенотипа и даже кинетики электронов транспорта. В частности уменьшается концентрация лактата в ходе текущего производства от S. oneidensis биопленки MR-1; Таким образом важно проводить эксперименты KIE, прежде чем процесс ограничения скорости сдвигает вверх метаболических реакций.

Наиболее критическая точка успешно получить KIE-для уточнения и подтверждения состояния, в котором электрон транспорта через ом c- Cyts ограничения темпов текущего производства контролируется поклеточного электрохимического анализа. В этом протоколе мы объясним, как подтвердить что размере EET ограничивает и отражает микробной текущего производства. Мы ввели комбинация двух методов; наблюдение за изменения тока Флавин-дополнение23, и D2O сложение присутствии диффундирующих электрона посредника, например, α-AQS15 (рис. 4 и 5). Если одно не может сделать процесс EET ограничения скорости, наиболее вероятная причина будет неполным формирования или физической отряд монослоя биопленки, или заражения другими микробами. Мы настоятельно рекомендуем, подтверждающие формирование монослоя биопленки путем сканирования электронной микроскопии или confocal микроскопии. Это весьма возможно, что процесс замены средний ущерб биопленки; Таким образом удаление и инъекции среды следует проводить медленно, и газ азот должна течь над поверхностью жидкости (рис. 3). Если форма монослоя биопленки не сделать EET процесс ограничения скорости, то лучше пересмотреть компонентов среды и измерения условиях, например, дополнения лактата в более высокой концентрации, чем 10 мм, для дальнейшего ускорения вверх по течению метаболические процессы. Эти соображения важны также в других типах EET-способных микробов. Электрон посредников может использоваться специально для подтверждения, что процесс EET ограничение скорости в других типах EET-способных микробов, включая смеси бактериальных штаммов; Таким образом мы рассматриваем этот протокол как общий метод для расследования кинетического воздействия протонов на прямого переноса электронов в интерфейсе бактерий/электрода. Учитывая, что EET наблюдается в других микробных штаммов и консорциумов, насколько процесс EET, ограничения скорости, этот Протокол применяется для изучения микробной дыхания в анаэробных железа коррозии и метана окислительные процессы, а также в микробные топлива клеток30,31.

Наша система биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 с ограничения скорости процесса EET через ом c- Cyts может использоваться не только для KIE экспериментов, но и для биохимических характеристик ом c- Cyts. Например добавление различных концентраций flavins, которые связывают как кофакторов до ом c- Cyts бы количественной электрохимических константы диссоциации (Kd ~ 10 мкм) для формирования Флавин прыгните ом c- CYTS комплексы32,,3334. Кроме того, наши последние работы показали, что процесс обратного обратный электронов через ом c- Cyts можно охарактеризовать через катодной текущего производства33,34. Было предложено, что обратный поток электронов связан с протонной импорта через ом как источник для синтеза АТФ Хемиосмотическая35; Таким образом, она представляет большой интерес для изучения воздействия протонов на кинетику обратного потока электронов в ом c- Cyts.

В заключение мы разработали методы для изучения дейтерия KIE на EET через ом - Cyts cпомощью живущих S. oneidensis MR-1. Этот метод может использоваться для характеристики ом c- Cyts KIE наблюдения, а также он потенциально применимых к другим electrogenic микробы. Мы считаем, что эта методология может быть общая техника расследовать EET непосредственно через ом c- Cyts в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была финансовой поддержке целевых субсидий для специально поощрять исследования от японского общества для поощрения науки (JSP) номер гранта KAKENHI 24000010, 17H 04969 и JP17J02602, нас управлением военно-морских исследований глобальных (N62909-17-1-2038). Ю.ц. научный сотрудник JSP-страницы и поддерживается JSP-страницы через программы для ведущих выпускников школ (ЗАСЛУГИ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

Биохимия выпуск 134 поклеточного электрохимии цитохромы металлические сокращения бактерий перенос протона Флавин bioelectrochemistry микробные топливные элементы Электроактивные биопленки
Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в <em>Shewanella oneidensis</em> MR-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, … More

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter