Summary
Här presenterar vi ett protokoll av hela-cell elektrokemiska experiment för att studera bidrag proton transport till graden av extracellulära elektrontransport via de yttre-membran subfamiljen komplex i Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direkt elektrokemisk detektion av c-Skriv cytokrom komplex inbäddad i den bakteriella yttre membranen (yttre membran c-Skriv cytokrom komplex; OM c- Cyts) har nyligen dykt upp som en roman hela-cell analysmetod att karakterisera den bakteriella elektrontransport från luftvägarna kedjan på cell utsidan, kallad den extracellulära elektrontransport (EET). Medan de utbildningsavsnittet och kinetik av elektronflödet under EET reaktionen har undersökts, har en hela-cell elektrokemisk metod att undersöka effekterna av katjontransport som är associerad med EET ännu inte fastställts. I den aktuella studien, ett exempel på en biokemisk teknik för att undersöka deuterium kinetiska isotopen effekten (KIE) på EET genom OM c- Cyts använder en modell mikrob, Shewanella oneidensis MR-1, är beskriven. KIE på EET processen kan erhållas om EET genom OM c- Cyts fungerar som det hastighetsbegränsande steget i den mikrobiella aktuella produktionen. I detta syfte före tillsats av D2O, ersattes supernatanten med färska media som innehåller en tillräcklig mängd av elektron donator att stödja frekvensen av uppströms metaboliska reaktioner, och ta bort plankton cellerna från en enhetlig enskiktslager biofilm på arbetselektroden. Alternativa metoder för att bekräfta begränsa steg i mikrobiell nuvarande produktion som EET genom OM c- Cyts beskrivs också. Vår teknik med en hela-cell elektrokemisk analys för att undersöka proton transport kinetik kan tillämpas på andra elektroaktiva mikrobiell stammar.
Introduction
Elektrokemiska tekniker att direkt karakterisera en redox protein i en intakt bakteriecell har nyligen dykt upp sedan upptäckten av metall-minska mikrobiell stammar, såsom S. oneidensis MR-1 eller Geobacter sulfurreducens PCA, som har yttre membran typ c cytokrom komplex (OM c-Cyts) utsätts för cell exteriör1,2,3,4,5. OM c- Cyts medla elektrontransport från luftvägarna kedjan till fasta substrat ligger extracellularly. Denna transport kallas extracellulära elektrontransport (EET)1,6 och är en kritisk process för framväxande bioteknik, till exempel mikrobiella bränsleceller6. Därför, för att förstå den underliggande EET-kineticsen och mekanismer, och dess koppling till mikrobiell fysiologi, OM c -Cyts har undersökts med hjälp av hela-cell elektrokemi4,7, kombinerat med mikroskopi 8 , 9, spektroskopi10,11och molekylär biologi2,4. Däremot har metoder för att undersöka effekterna av EET-associerade katjontransport, t.ex., protoner, på EET kinetics i levande celler knappt fastställts, trots proton transport över bakteriell membran har en avgörande roll i signalering, homeostas och energi produktion12,13,14. I denna studie, beskriver vi en teknik för att undersöka effekterna av proton transport på EET kinetics i S. oneidensis MR-1 cellen använder hela-cell elektrokemiska mätningar, som kräver identifiering av det hastighetsbegränsande steget i mikrobiell nuvarande produktion15.
Ett direkt sätt att utvärdera bidraget av proton transporter på den associerade EET är effekten kinetiska isotopen deuterium (KIE). KIE är observerbar som förändringen i elektron överföring kinetik vid byte av protoner med deuterium joner, som representerar proton transporternas inverkan på elektron överföring kinetik16. Teorin om KIE själv har väl etablerad med elektrokemiska mätningar med renade enzymer17. Emellertid eftersom nuvarande produktion i S. oneidensis MR-1 resultat från flera olika och varierande processer18, identifiera inte ett helt enkelt EET som hastighetsbegränsning processen. För att observera KIE på proton processer tillsammans med EET, måste vi bekräfta att den mikrobiella aktuella produktionen begränsas av elektrontransport via OM c- Cyts till elektroden. För detta ändamål ersatte vi supernatanten med färska medium som innehåller en hög koncentration av laktat som en elektron donator vid optimalt pH och temperatur före KIE mätning; Detta utbyte serveras två roller: (1) den förbättrade graden av den uppströms metaboliska processer jämfört med EET och (2) utelämnas simning cellerna i supernatanten frigörs från den enskiktslager biofilmen av S. oneidensis MR-1 på den arbetande elektrod ( indium tin-dopade oxid (ITO) elektrod). Presenterade detaljerade protokollet är avsett att hjälpa nya utövare upprätthålla och bekräfta att EET processen är det kurs-bestämma steget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bildandet av en enskiktslager Biofilm av S. oneidensis MR-1 på en ITO elektrod (figur 1)
Obs: För att förhindra kontaminering av elektrokemiska reaktorn med andra mikrober, alla media, redskap, och komponenter av elektrokemiska reaktorn ska steriliseras i förväg. När du använder S. oneidensis MR-1 celler och konstruera de elektrokemiska reaktorerna, alla förfaranden bör utföras på en ren bänk.
- Odling av S. oneidensis MR-1 celler
Obs: En enskiktslager biofilm av S. oneidensis MR-1 bildades på en ITO elektrod efter villkor som tidigare rapporterats4.- För att växa S. oneidensis MR-1 celler, lägga till en koloni av S. oneidensis MR-1 odlas på en agarplatta bestående av Luria-Bertani (LB) (20 g/L) och bacto-agar (15 g/L) i 15 mL LB medium (20 g/L) vid 30 ° C under 24 h i aeroba förhållanden med skakningar vid 160 rpm.
- Centrifugera cellsuspension vid 6000 × g i 10 min och återsuspendera cellpelleten resulterande i 15 mL definierade medium (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L], och 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic syra [HEPES; 7,2 g/L]), kompletterad med 10 mM laktat och 0,5 g/L jästextrakt som källa av kol, och spårämnen för S. oneidensis MR-1 , respektive.
- Ytterligare odla cellsuspensionen aerobt vid 30 ° C i 12 h med skakningar vid 160 rpm och centrifugera igen vid 6 000 × g i 10 min. tvätta den resulterande cellpelleten två gånger med DM medium genom centrifugering för 10 min vid 6000 × g innan de elektrokemiska experimentera.
- Byggandet av en tre-elektrod elektrokemiska reaktor (figur 1)
- Sätta en ITO substrat som arbetselektroden längst ned i reaktorn.
- Därefter infoga en glas cylinder (diameter 2 cm) och en cover av polytetrafluoreten (PTFE). Sedan infoga Ag/Granulatfyllda (mättad KCl) och en platina tråd i reaktorn som referens och counter elektroderna, respektive.
Obs: För att förhindra läckage av luft och lösning, infoga ett butylgummi blad mellan varje komponent. - Lägga till 4,0 mL av DM kompletteras med 10 mM laktat och 0,5 g/L jästextrakt elektrokemiska reaktorn.
- När du har bekräftat att det finns inget läckage från elektrokemiska reaktorn, flöde av kvävgas elektrokemiska reaktorn över 20 min att upprätthålla anaeroba förhållanden inuti elektrokemiska reaktorn.
Obs: För att förhindra kontaminering med andra mikrober, gasen bör filtreras innan den flyter in i elektrokemiska reaktorn. - Anslut den elektrokemiska reaktorn till en potentiostat och tillämpa 0,4 V (kontra standard väte-elektrod, hon) till ITO elektroden, att hålla temperaturen av elektrokemiska reaktorn vid 30 ° C med en yttre vatten cirkulationssystem.
Obs: För att förhindra effekten av ett yttre elektriskt fält, elektrokemiska reaktorn bör placeras i en Faradays bur.
- Elektrokemiska odling av S. oneidensis MR-1 celler (figur 1 och figur 2)
- Justera cell densiteten av suspensionen erhölls i steg 1,1 till en optisk densitet av 1,43 på 600 nm (OD600) med DM kompletteras med 10 mM laktat och 0,5 g/L jäst extrakt.
Obs: För att få den rätta OD600, gäller cellsuspensionen OD600 ≤ 0,8 en UV-vis spektrometer före justera OD600 till 1,43. - Lägga till 0,3 mL av cellsuspensionen elektrokemiska reaktorn via injektionsporten med hjälp av en spruta: OD600 i reaktorn ändras till 0,1.
Obs: Tillägg av 0,3 mL cellsuspension med OD600 = 1,43 in elektrokemiska reaktorn som innehåller 4,0 mL medium resultaten i 4.3 mL av lösningen med en OD600 = 0,1. När du använder andra reaktorer med olika volymer, krävs beräkning av cell densiteten. - Fortsätta den potentiella tillämpningen på 0,4 V (kontra hon) till ITO elektroden för 25 h.
Anmärkning: För bildandet av en enskiktslager biofilm på en ITO elektrod, se till att den producerade strömmen uppvisar en avvikelse som är mindre än 50% från figur 2.
- Justera cell densiteten av suspensionen erhölls i steg 1,1 till en optisk densitet av 1,43 på 600 nm (OD600) med DM kompletteras med 10 mM laktat och 0,5 g/L jäst extrakt.
2. byte av supernatanten med färska DM Medium med 10 mM laktat (figur 3)
- Stoppa det potentiella programmet och koppla elektrokemiska reaktorn från potentiostaten och vatten cirkulationssystemet.
- Byte av supernatanten med färska DM medium med 10 mM laktat
- Flöde av kvävgas in en flaska innehållande DM med 10 mM laktat över 20 min för att avlägsna syre från mediet.
- Ta långsamt bort alla supernatanten inuti elektrokemiska reaktorn med hjälp av en spruta, under rinnande kvävgas (figur 3a, b).
Obs: För att undvika att bryta biofilmen på ITO elektroden av kvävgas, gasen ska flyta ovanför vätskeytan. - Tillsätt 4,0 mL färsk DM som innehåller 10 mM laktat med en spruta (figur 3 c).
Obs: För att undvika att bryta biofilmen på ITO elektroden, injicera långsamt medium längs väggen av elektrokemiska reaktorn. För att hålla den biofilm som våt, bör medium läggas omedelbart efter avlägsnande av supernatanten. Injektion av det medium upp till 1 min efter avlägsnande av supernatanten påverkar inte den aktuella produktionen från biofilmen på S. oneidensis MR-1. - Slant elektrokemiska reaktorn för att ta bort alla av supernatanten fäst på väggen av elektrokemiska reaktorn.
- Upprepa de steg 2.2.2-2.2.4 tre gånger sammanlagt.
- Stoppa gasflödet och ansluta elektrokemiska reaktorn till den potentiostat igen, gäller ITO elektroden på 303 K. 0,4 V (kontra hon)
3. tillägg av Deuterium vatten att mäta KIE på EET processen (figur 4)
- Bekräfta att den aktuella produktionen från en enskiktslager biofilm på S. oneidensis MR-1 är stabil och ökar inte snabbt. Om nuvarande ökar kraftigt, vänta tills aktuellt stabiliserar inom en ökning med 5% över 10 min.
Obs: Bildandet av en enskiktslager biofilm på en ITO elektrod utan kontaminering av andra mikrobiella stammar bekräftades av rDNA sekvenser och en scanning electron mikroskopisk bild av biofilmen på en ITO elektrod, som rapporterats tidigare4. För bekräftelse av hastighet begränsning av EET processen, övervaka effekten av att lägga till shuttling elektron mediatorer såsom 100 µM antrakinonderivat-1-sulfonat (α-AQS). Se avsnittet av Representativa resultat och referens15 för ytterligare detaljer. - Tillsätt 40 µL av anoxiska 50% (v/v) D2O elektrokemiska reaktorn med hjälp av en spruta så att koncentrationen är 0,5% (v/v) D2O i reaktorn.
Obs: För att förhindra skador på biofilm genom D2O tillägg, injicera den D2O drop-wise. - Vänta för aktuellt att stabilisera och därefter tillägga den D2O upp till 4,0% (v/v).
Obs: För att få värdet KIE (förhållandet av den nuvarande produktionen i närvaro av D2O och H2O), kontrollera effekten av samma volym av H2O dessutom på den aktuella produktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 25 h av potentiella ansökan vid 0,4 V (kontra hon) bildades en enskiktslager biofilm på arbetselektroden ITO glas, vilket bekräftades tidigare av antingen en scanning electron microscopy eller en konfokalmikroskopi4. Representativa tidsförloppet för aktuell produktion från S. oneidensis herr-1 under bildandet av en enskiktslager biofilm visas i figur 2. Även om nuvarande förändrar i varje mätning, uppvisar den producerade strömmen inte en avvikelse över 50% från värdet i figur 2 om en enskiktslager biofilm bildas jämnt.
Efter byte av supernatanten med färska DM med 10 mM laktat att maximera andelen av metaboliska processer och tvätta den enskiktslager biofilmen (figur 3), kan en stabil anodisk ström (cirka 5% ökning i 10 min) observeras under 0,4 V (kontra hon ) ansökan (figur 4a). Om den anodisk nuvarande ökar kraftigt, vänta tills aktuellt stabiliserar. Det är mycket möjligt att förfarandena för supernatant ersättning som beskrivs i avsnitt 2 kan skada biofilmen och återuppbyggnad kan uppstå.
Den heldragna linjen i figur 4a är det representativa resultatet för mikrobiell aktuella ändringen induceras av D2O tillägg. Tillägg av 1,0% (v/v) D2O kraftigt minskade den mikrobiella strömmen inom 10 s, medan nästan inga aktuella minskningen observerades genom tillsats av H2O (streckade linjen i figur 4a)15. Samma tendens reproducerades i minst fyra separata experiment. Sekventiell tillägg D2O på slutliga koncentrationer från 0,5% till 2,0% (v/v) tydligt uppvisade stark dämpning i nuvarande produktion (figur 4a)15. Eftersom den mikrobiella aktuella produktionen återhämtade sig gradvis sannolikt på grund av de fysiologiska effekt19,20, bör KIE tilldelas den aktuella minskningen snart efter tillsats av D2O. I en tidigare rapport samlat vi aktuell produktion på cirka 10 min efter tillsats av D2O att beräkna värdet av KIE15.
Använder två metoder, bekräftat vi att den observerade nuvarande minskningen av D2O tillägg är hänförlig till KIE på EET genom OM c- Cyts komplex. Först, vi lagt till 1 µM riboflavin (RF) eller flavin mononucleotide (FMN) in i elektrokemiska reaktorn före och efter D2O tillägg, som kan användas för att studera EET i S. oneidensis MR-1. När det gäller S. oneidensis MR-1, flaviner specifikt påskynda EET genom bindning med OM c- Cyts i några sekunder, eftersom flaviner fungera som icke-kovalent bindning kofaktorer21,22, 23. därför en omedelbar anodisk nuvarande ökning av flavin tillägg anger hastighet begränsning av EET processen via OM c- Cyts (figur 5). Vi bekräftade ytterligare effekten av shuttling elektron medlare på KIE. Liten redoxmolekyler, t.ex., antrakinonderivat-1-sulfonat (α-AQS), avsluta EET processen genom att sprida från mikrobiell elektron transportkedjan till elektroden, i stället för direkt elektrontransport via OM c- Cyts15 , 24. här, tillägg av 100 µM α-AQS förstärkt den aktuella produktionen av mer än 5 gånger (figur 4b), vilket visar att kinetiken för de metaboliska reaktionerna är tillräckligt snabbt för att göra EET utföra hastighetsbegränsande steget. Konsekvent, förblev nuvarande produktion medieras av α-AQS opåverkad av D2O tillägg (figur 4b), visar att metaboliska reaktioner av D2O potentiella förseningen inte orsakar den stora KIE observerats i figur 4a .
Kombinationen av dessa två metoder att observera KIE på elektrontransport med OM c- Cyts är den kritiska punkten i detta betänkande, och särskilt shuttling elektron medlare kan vara tillämpliga på andra elektroaktiva biofilmer. Dessutom, när vi bekräftat att den aktuella ändringen har tilldelats EET processen, vi kunde bedöma effekten av en partiell radering mutant OM c- Cyts eller av en flavin som är associerad med OM c- Cyts på protonen överföra kinetik genom att jämföra KIE i båda fall15. När D2O lades i närvaro av FMN bindande med OM c- Cyts, nuvarande minskningen reducerades sådan att det var mindre än utan FMN, som anger att bindningen av FMN ändras proton transport vägen och dess kinetik (figur 4 c)15.
Figur 1: elektrokemisk reaktorn används i denna studie. Fotografi av den elektrokemiska cellen innan konstruktion (en) och efter konstruktion (b). (c), Schematisk illustration av elektrokemiska reaktorn efter 25 h av elektrokemiska inympning på 0,4 V vs hon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa strömproduktionen från S. oneidensis MR-1 under enskiktslager biofilm bildandet på en ITO elektrod. En pil anger tiden för tillägg av cellsuspensionen elektrokemiska reaktorn. Samma tendens reproducerades i minst fem individuella experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: byte av supernatanten till färska definierade medium (DM) med 10 mM laktat. (en) kvävgas flöde ovanför vätskeytan. (b) avlägsnande av supernatanten från elektrokemiska reaktorn. (c) tillägg av 4,0 mL färsk DM som innehåller 10 mM laktat. Efter det medium, bör reaktorn vara sneda för att avlägsna supernatanten fäst på väggen av reaktorn. Genomföra dessa förfarande (en–c) tre gånger totalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekten av D2O dessutom på den aktuella produktionen från en enskiktslager biofilm på S. oneidensis MR-1. Tid jämfört med nuvarande produktion för en enskiktslager biofilm av S. oneidensis MR-1 i ett elektrokemiskt system innehållande 10 mM laktat (en), en ytterligare 100 µM antrakinonderivat-1-sulfonat (α- AQS) (b), eller en ytterligare 2 µM Flavin mononucleotide (FMN) (c). Samma tendens reproducerades i minst fyra individuella experiment. Pilarna anger tiden för tillägg av D2O (heldragen linje) eller H2O (streckad linje). De uppgifter som motsvarar den prickade linjen var normaliserade till datapunkten strax före tillsats av D2O i heldragen linjedata. Koncentrationen av D2O i elektrokemiska reaktorn är indicerat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bedömning av den ränta-avgörande steg i den aktuella produktionen från en enskiktslager biofilm av S. oneidensis MR-1 genom tillsats av flaviner. Tid jämfört med nuvarande produktion från en enskiktslager biofilm av S. oneidensis MR-1 i närvaro av 10 mM laktat (heldragen linje), 1,0 mM laktat (streckad linje) och 0,1 mM laktat (streckad linje). En pil anger den tidpunkt vid vilken 1 µM flavin mononucleotide (FMN) lades de elektrokemiska reaktorer. I närvaro av 10 mM laktat, tillägg av FMN drastiskt ökade den aktuella produktionen, visar att den extracellulära elektrontransport (EET) genom c-Skriv cytokrom komplex inbäddad i den bakteriella yttre membranen (OM c - Cyts) är kurs-bestämma. Mindre laktat koncentrationen i elektrokemiska reaktorn orsakade en mindre förbättring av nuvarande av FMN tillägg, som anger att electron leverans från uppströms metaboliska reaktionerna på OM c- Cyts gradvis blev långsammare än EET. Samma tendens reproducerades i minst två individuella experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår hela-cell elektrokemisk analys har flera tekniska fördelar jämfört med protein elektrokemi. Medan protein rening kräver flera steg tidsödande förfaranden, tar vår hela-cell metoden en dag i självorganiserade biofilm bildning efter cellodling. För att uppnå en stabil interaktion mellan OM c- Cyts och elektroden, vi behöver bara sterilisering och rengöring av elektrod ytan; det inte kräver ändringar av elektrod för organisera orienteringen av proteiner4, t.ex., S. oneidensis MR-1 egensäkra fäster på elektroden, medan orientera OM c- Cyts i samma riktning25 , 26 , 27. De elektrokemiska reaktionerna av proteiner påverkas däremot känsligt avståndet mellan redox platser i proteinet och elektroden; de renade proteinerna måste således vara noga orienterad28,29. Viktigare, hela-cell elektrokemiska analysen direkt karaktäriserar OM c- Cyts komplex inbäddade i en lipid membranet med möjliga interaktioner med andra membranproteiner, och så reflekterar de infödda protonen hantering i drifthandboken c - Cyts (detta är ofta svårt att imitera med renade proteiner).
Vår teknik har dock en begränsning med avseende på koncentrationen av D2O. höga koncentrationer av D2O potentiellt metaboliska processer och långsammare tillväxt19; Därför genomförde vi de experiment som använder D2O koncentrationer som var mindre än 4% (v/v) i detta protokoll. Dessutom, eftersom genuttryck i mikrober regleras på ett komplext sätt, påverka små villkorlig skillnader starkt den mikrobiella fenotypen och även elektrontransport kinetik. I synnerhet minskar laktat koncentrationen under nuvarande produktionen från de S. oneidensis MR-1 biofilmen; Det är därför viktigt att genomföra KIE experimenten innan processen anslutningshastighet skiftar till uppströms metaboliska reaktioner.
Den mest kritiska punkten att framgångsrikt få KIE är att klargöra och bekräfta villkoret där elektronen transport genom OM c- Cyts gränser nuvarande produktionstakten övervakas av den hela-cell elektrokemisk analysen. I detta protokoll förklarar vi hur du bekräftar att andelen av EET begränsar och återspeglar den mikrobiella aktuella produktionen. Vi introducerade en kombination av två metoder. observation av den aktuella ändringen flavin tillägg23, och D2O tillägg i närvaro av en diffuserande elektron medlare, t.ex., α-AQS15 (figur 4 och figur 5). Om man inte kan göra EET bearbeta anslutningshastighet, skulle den mest troliga orsaken vara ofullständig bildning eller fysiska avlossning av enskiktslager biofilm eller kontaminering av andra mikrober. Vi rekommenderar starkt att bekräfta bildandet av den enskiktslager biofilmen genom scanning electron microscopy eller konfokalmikroskopi. Det är mycket möjligt att medium utbyte processen skadar biofilmen; Därför, bortforsling och injektion av medium bör ske långsamt, och kvävgas ska flyta ovanför vätskeytan (figur 3). Om en enhetlig enskiktslager biofilm inte gör EET bearbeta anslutningshastighet, är det bäst att omvärdera de medelstora komponenter och mätning villkor, t.ex., tillskott av laktat vid en högre koncentration än 10 mM, för ytterligare acceleration av uppströms metaboliska processer. Dessa överväganden är också viktiga i andra typer av EET-kapabla mikrober. Electron medlare kan särskilt användas för att bekräfta att EET processen är hastighetsbegränsande i andra typer av EET-kapabla mikrober inbegripet blandningar av bakteriestammar; Således anser vi detta protokoll som en generell metod att undersöka den kinetisk effekten av protons på direkta elektrontransport på gränssnittet bakterierna/elektrod. Med tanke på att EET följs i andra mikrobiella stammar och konsortier, såvitt EET processen är anslutningshastighet, är detta protokoll tillämpligt att studera mikrobiell respirationen i anaerob järn korrosion och metan-oxidering processer samt att i mikrobiella bränsleceller30,31.
Vårt system av S. oneidensis MR-1 enskiktslager biofilm med hastighetsbegränsning processen av EET via OM c- Cyts kan användas inte bara för KIE experiment men också för biokemisk karakterisering av OM c- Cyts. Till exempel tillägg av olika koncentrationer av flaviner som binder som kofaktorer till OM c- Cyts skulle tillåta elektrokemiska kvantifiering av dissociationskonstant (Kd ~ 10 µM) för bildandet av flavin-bundna OM c- CYTS komplex32,33,34. Dessutom vårt senaste arbete visat att omvänd elektron återflödet processen via OM c- Cyts kunde vara kännetecknas genom katodiskt nuvarande produktion33,34. Det har föreslagits att elektronen återflödet är associerad med proton import över OM som en källa för kemiosmotisk ATP syntes35; Det är därför av stort intresse att undersöka effekterna av protons på elektron återflödet kinetik i OM c- Cyts.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat tekniker för att undersöka deuterium KIE på EET genom OM c- Cyts använder lever S. oneidensis MR-1. Tekniken kan användas för karaktärisering av OM c- Cyts samt KIE observation, och det är potentiellt tillämpliga på andra electrogenic mikrober. Vi anser att denna metod kan vara en allmän teknik för att undersöka EET direkt via OM c- Cyts i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av ett bidrag för speciellt främjat forskning från Japan sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI licensnummer 24000010, 17H 04969, och JP17J02602, den oss Office av Naval Research globala (N62909-17-1-2038). Y.T. är JSPS forskarassistent och stöds av JSPS genom Program för ledande Graduate skolor (MERIT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
