Summary
Burada bir protokol proton taşıma dış membran cytochromes Shewanella Corynebacterium Bay-1'karmaşık yoluyla ekstraselüler elektron taşıma oranı katkısını çalışmaya bütün hücreli elektrokimyasal deneyler mevcut.
Abstract
Doğrudan celektrokimyasal tespiti-yazın bakteriyel dış membran gömülü sitokrom kompleksleri (dış membran c-sitokrom kompleksleri; yazın OM c- Cyts) son zamanlarda roman bütün hücreli analitik yöntem bakteriyel hücre dış elektron ulaşım solunum zincirindeki karakterize olarak ortaya, ekstrasellüler elektron taşıma (EET) anılacaktır. Yol ve Kinetik elektron akışı EET reaksiyon sırasında araştırdık iken, katyon taşıma EET ile ilişkili etkisini incelemek için bir bütün-hücre elektrokimyasal yöntem henüz oluşturulmadı. Bu da çalışmanın, döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) EET OM cile incelemek için biyokimyasal bir teknik - Cyts modeli mikrop, Shewanella Corynebacterium Bay-1, kullanarak açıklanan örneğidir. EET ile OM c- Cyts mikrobiyal geçerli üretim hızı sınırlaması adım olarak davranıyorsa KIE EET süreci üzerinde elde edilebilir. Bu amaçla, D2O, eklenmesi önce süpernatant çözüm elektron verici ters yönde metabolik reaksiyonların hızı desteği ve planktonik hücreleri bir üniforma kaldırmak için yeterli miktarda içeren taze medya ile değiştirildi monolayer biyofilm çalışma elektrot üzerinde. Hızı sınırlaması onaylamak için alternatif yöntemler adım mikrobiyal geçerli üretimde EET OM caracılığıyla olarak - Cyts da açıklanmaktadır. Proton taşıma Kinetik soruşturma için bütün hücreli elektrokimyasal testin bizim tekniği diğer electroactive mikrobiyal suşları için uygulanabilir.
Introduction
Doğrudan sağlam bir bakteri hücre bir Redoks protein karakterize etmek için elektrokimyasal teknikler S. Corynebacterium Bay-1 veya Geobacter sulfurreducens PCA gibi metal azaltarak mikrobiyal suşları keşfinden beri son zamanlarda ortaya çıkmıştır, hangi dış membran c tipi sitokrom kompleksleri (OM c-Cyts) hücre dış1,2,3,4,5' e maruz var. COM - Cyts solunum zinciri elektron taşıma extracellularly bulunan katı yüzeyler için aracılık. Bu aktarım için hücre dışı elektron taşıma (EET)1,6 adlandırılır ve mikrobiyal yakıt hücreleri6gibi gelişmekte olan biyoteknoloji için kritik bir süreçtir. Bu nedenle, temel EET kinetik ve mekanizmaları ve mikrobiyal Fizyoloji onun bağlantı anlamak için OM c -Cyts araştırdık mikroskobu ile birlikte bütün hücreli elektrokimya4,7, kullanma 8 , 9, spektroskopi10,11ve moleküler biyoloji2,4. Buna ek olarak, katyon EET ilişkili taşıma, Örneğin, proton, canlı hücreler EET Kinetik üzerinde etkisini araştırmak için yöntemleri pek, proton taşıma bakteri membranları kritik bir rol almakla genelinde rağmen kurulmuştur sinyal, Homeostazı, enerji üretim12,13,ve14. Mevcut çalışma, biz proton taşıma EET Kinetik hızı sınırlaması adımda tanımlaması gerektirir bütün hücreli elektrokimyasal ölçüler kullanarak S. Corynebacterium Bay-1 hücrenin üzerinde etkisini incelemek için bir teknik tarif mikrobiyal geçerli üretim15.
Proton taşıma ilişkili EET Tarih katkısını değerlendirmek için bir doğrudan döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) yoludur. KIE elektron transferi Kinetik proton taşıma elektron transferi Kinetik16etkisini temsil eden yedek proton döteryum iyonları ile üzerine değişiklik gözlemlenebilir gibidir. KIE kendisi teori de arıtılmış enzimler17ile elektrokimyasal ölçüler kullanarak kurulan olmamıştı. Geçerli üretim S. Corynebacterium Bay-1 birden çok, farklı ve dalgalanan işlemleri18sonuç beri Ancak, biri sadece EET hızı sınırlaması işlem olarak belirleyemez. KIE proton taşıma süreçleri EET ile birleştiğinde gözlemlemek için biz mikrobiyal geçerli üretim ile elektron taşıma OM cile sınırlıdır onaylamanız gerekir - Cyts elektrot için. Bu amaçla, biz taze orta laktat yüksek bir konsantrasyon en uygun pH ve sıcaklık koşullarında KIE ölçüm önce bir elektron donör olarak içeren süpernatant çözüm yerine; Bu değiştirme iki rolden servis: (1) için EET göre ters yönde metabolik süreçleri oranı gelişmiş ve (2) S. Corynebacterium Bay-1 üzerinde çalışma elektrot (monolayer biyofilm serbest süpernatant Yüzme hücrelerde ihmal indiyum teneke katkılı oksit (ITO) elektrot). Sunulan ayrıntılı iletişim kuralı korumak ve EET işlem oranı belirleme adım olduğunu doğrulayın yeni uygulayıcıları yardımcı olmak içindir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. S. Corynebacterium Bay-1 bir Ito elektrot (şekil 1)'in Monolayer biyofilm oluşumu
Not: elektrokimyasal reaktör diğer mikroplar ile kontaminasyonu önlemek için tüm medya, uygular ve elektrokimyasal reaktör bileşenlerini önceden sterilize. Ne zaman tüm yordamları S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri kullanarak ve elektrokimyasal reaktörler inşa, temiz bir bankta yapılmalıdır.
- S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri tarımı
Not: S. Corynebacterium Bay-1 monolayer biyofilm kuruldu bir ITO koşulları aşağıdaki elektrot daha önce4bildirdi.- S. Corynebacterium Bay-1 hücrelerin büyümesine S. Corynebacterium Bay-1 LB orta (20 g/L) 160 rpm'de sallayarak ile aerobik koşullarda 24 h 30 ° C'de 15 mL içine Luria-Bertani (LB) (20 g/L) ve bacto agar (15 g/L) oluşan bir agar plaka üzerinde yetiştirilen bir koloni ekleyin.
- Hücre süspansiyon vasıl 6000 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve sonuç hücre Pelet tanımlanmış orta (pH 7.8) 15 mL resuspend (DM: NaHCO3 [2.5 g/M], CaCl2·2H2O [0,08 g/M], NH4Cl [1.0 g/M], MgCl2· 6 H2O [0.2 g/M], NaCl [10 g/L] ve 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic asit [HEPES; 7.2 g/M]), 10 mM laktat ve 0.5 g/L Maya ekstresi, karbon kaynağı olarak ilave ve eser elementler S. Corynebacterium Bay-1 için , sırasıyla.
- Daha fazla 160 rpm'de sallayarak ile hücre süspansiyon tükenmesiyle 30 ° C'de 12 h için yetiştirmek ve tekrar 6000 × g 10 dk. yıkama için de sonuç hücre Pelet DM orta ile iki kez 6000 × g elektrokimyasal önce de 10 dakika aralıklarla tarafından santrifüj kapasitesi deneme.
- Üç elektrot elektrokimyasal reaktör (şekil 1) İnşaatı
- ITO substrat reaktör altındaki çalışma elektrot olarak koymak.
- Daha sonra bir cam silindir (çapı 2 cm) ve politetrafloroetilin (PTFE) kapak yerleştirin. Sonra Ag/AgCl (doymuş KCl) ve platin tel santraline başvuru ve sayaç elektrotlar, sırasıyla ekleyin.
Not: çözüm ve hava kaçağı önlemek için her bir bileşen arasındaki Bütil kauçuk sayfası ekleyin. - DM 4.0 mL 10 mM laktat ile desteklenmiş ve 0.5 g/L Maya elektrokimyasal santraline ayıklamak ekleyin.
- Elektrokimyasal reaktör üzerinden hiçbir sızıntı olduğunu onayladıktan sonra azot gazı elektrokimyasal reaktör üzerinde 20 dk anaerobik koşullar elektrokimyasal reaktör içinde korumak için içine akışı.
Not: elektrokimyasal santraline akar önce diğer mikroplar ile kontaminasyonu önlemek için gaz filtre. - Elektrokimyasal reaktör bir potansiyostat bağlamak ve 0,4 V uygulamak (Standart hidrojen elektrodu karşı o) ITO elektrot için elektrokimyasal reaktör sıcaklığı 30 ° C'de bir harici su dolaşım sistemi kullanarak tutmak.
Not: harici elektrik alan etkisini önlemek için elektrokimyasal reaktör Faraday kafesi içinde yer almalıdır.
- S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri (Resim 1 ve Şekil 2) elektrokimyasal ekimi
- Adım 1.1 1.43 600 optik bir yoğunluğunun elde süspansiyon hücre yoğunluğu ayarlamak nm (OD600) 10 mM laktat ve 0.5 g/L Maya tarafından desteklenen DM ile ayıklayın.
Not: doğru OD600elde etmek için OD600 ≤ 0,8 hücre süspansiyon 1.43 OD600 ayarlama önce UV-VIS Spektrometre için geçerli. - Bir Ģırınga kullanarak enjeksiyon bağlantı noktası üzerinden elektrokimyasal reaktör içine hücre süspansiyon 0.3 mL ekleyin: reaktör içinde OD600 0,1 için değiştirir.
Not: 0.3 mL hücre süspansiyon OD600 ile eklenmesi elektrokimyasal reaktör 4.3 ml 4.0 mL orta sonuçlarını bir OD600 ile çözüm içeren içine 1.43 = 0,1 =. Diğer reaktörler farklı birimleri ile kullanırken, hücre yoğunluğu hesaplanması gereklidir. - 0,4 V (SHE karşı) 25 h ITO elektrot, potansiyel uygulama devam.
Not: üretilen geçerli Şekil%2 50 daha az bir sapma sergileyen bir ITO elektrot üzerinde monolayer biyofilm oluşumu için emin olun.
- Adım 1.1 1.43 600 optik bir yoğunluğunun elde süspansiyon hücre yoğunluğu ayarlamak nm (OD600) 10 mM laktat ve 0.5 g/L Maya tarafından desteklenen DM ile ayıklayın.
2. yedek süpernatant ile 10 mM laktat (şekil 3) ile taze DM orta
- Potansiyel uygulamayı durdurmak ve elektrokimyasal reaktör potansiyostat ve su dolaşım sistemi çekin.
- Süpernatant ile 10 mM ile taze DM orta yerine laktat
- Oksijen ortamından kaldırmak için 10 mM laktat 20 dk ile DM içeren bir şişe içine azot gazı akışı.
- Yavaş yavaş tüm süpernatant akan altında bir Ģırınga kullanarak elektrokimyasal reaktör içinde kaldırmak azot gazı (şekil 3a, b).
Not: biyofilm ITO elektrot azot gazı tarafından bozulmaması için gaz sıvı yüzeyi üzerinde akışı gerekir. - Taze DM 10 mM laktat (şekil 3 c) kullanarak içeren 4.0 mL ekleyin.
Not: ITO elektrot biyofilm bozulmaması için yavaş yavaş elektrokimyasal reaktör duvar boyunca orta enjekte et. Islak biyofilm tutmak için orta hemen kaldırılması süpernatant sonra eklenmesi gerekir. Orta upto 1dk enjeksiyon süpernatant çıkarıldıktan sonra biyofilm geçerli üretimden S. Corynebacterium Bay-1'in etkisi yoktur. - Tüm elektrokimyasal reaktör duvarına bitişik süpernatant kaldırmak için elektrokimyasal reaktör eğik.
- Adımları 2.2.2-2.2.4 toplamda üç kez tekrarlayın.
- Gaz akışını durdurmak ve yeniden, 303 K., ITO elektrot 0,4 V (SHE karşı) uygulamak potansiyostat elektrokimyasal reaktör bağlanmak
3. KIE EET süreci (şekil 4) ölçmek için döteryum su ilavesi
- S. Corynebacterium Bay-1 monolayer biyofilm geçerli üretimden kararlı ve hızlı bir şekilde artırmaz onaylayın. Geçerli dik artarsa, geçerli bir %5 artış 10 dk içinde stabilize kadar bekleyin.
Not: Diğer mikrobiyal suşları kirlenme olmadan bir ITO elektrot üzerinde monolayer biyofilm oluşumu rDNA dizileri ve biyofilm bir ITO elektrot üzerinde bir tarama elektron mikroskobik görüntü olarak daha önce4rapor doğrulandı. Hızı sınırlama EET işlem tarafından onay için mekik elektron arabulucu 100 µM anthraquinone-1-Sülfonat (α-AQS) gibi ekleme etkisini izlemek. Temsilcisi sonuçları bölümüne bakın ve15 daha fazla bilgi için başvuru. - Anoksik (v/v) % 50 D2O 40 µL konsantrasyonu % 0,5 (v/v) D2O reaktör içinde öyle ki bir Ģırınga kullanarak elektrokimyasal reaktör içine ekleyin.
Not: D2O Ayrıca biyofilm için zarar görmesini önlemek için D2O drop-wise enjekte. - Cari sağlamlaştırmak bekleyin ve daha sonra D2O kadar %4.0 (v/v) ekler.
Not: aynı birimin H2O ek geçerli üretim üzerinde etkisini KIE değer (D2O ve H2O geçerli üretim oranı) elde etmek için kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
0,4 V (SHE karşı) potansiyel uygulamasının 25 h sonra monolayer biyofilm çalışma elektrot daha önce bir tarama elektron mikroskobu ya da bir confocal mikroskobu4tarafından doğrulandı ITO cam kuruldu. S. Corynebacterium Bay-1'den geçerli üretim monolayer biyofilm oluşumu sırasında temsilcisi zaman tabii Şekil 2' de gösterilmiştir. Her ne kadar mevcut her ölçüm değiştirir, eğer monolayer biyofilm eşit oluşturulur üretilen geçerli Şekil 2 değeri üzerinden % 50 oranında bir sapma göstermez.
Sonra yedek süpernatant ile 10 mM laktat ile taze DM metabolik süreçleri hızını en üst düzeye çıkarmak ve monolayer biyofilm (şekil 3) yıkamak, istikrarlı anodik akım (yaklaşık 10 dakika içinde %5 artış) 0,4 V (karşı o altında görülebilir ) uygulaması (şekil 4a). Anodik geçerli dik artarsa, geçerli stabilize kadar bekleyin. Bölüm 2'de açıklanan süpernatant değiştirme yordamları biyofilm zarar verebilir ve yeniden yapılanma oluşabilir son derece mümkündür.
Şekil 4a düz çizgi D2O ek tarafından indüklenen mikrobiyal geçerli değişikliği için temsilcisi sonucudur. %1.0 (v/v) D2O eklenmesi keskin mikrobiyal mevcut 10 içinde azalmıştır s, süre H2O ( şekil 4anoktalı çizgi)15ek tarafından neredeyse hiçbir geçerli azalma gözlendi. Aynı eğilim en az dört ayrı deneylerde yeniden. D2O son konsantrasyonlarda %0,5 %2.0 (v/v) açıkça sergilenen güçlü bastırma geçerli üretim (şekil 4a)15arasında değişen sıralı eklenmesi. Mikrobiyal geçerli üretim yavaş yavaş büyük olasılıkla nedeniyle fizyolojik etkisi19,20kurtarıldı çünkü KIE yakında D2O. eklenmesinden sonra geçerli azaltmak için atanmalıdır Bir önceki rapora eklenmesi ile KIE15değerini hesaplamak için D2O sonra yaklaşık 10 dk üretim geçerli toplanan.
İki yöntem kullanarak, D2O toplama tarafından gözlenen geçerli azalma OM c- Cyts kompleksi aracılığıyla EET Tarih KIE atfedilebilecek olduğunu doğruladı. Birincisi, biz 1 µM riboflavin (RF) veya flavin mononucleotide (FMN) elektrokimyasal santraline öncesi ve sonrası EET S. Corynebacterium Bay-1 eğitim için kullanılan D2O ek eklenir. S. Corynebacterium Bay-1 olması durumunda, flavins özellikle bağlama OM cile tarafından EET sürecini hızlandırmak - Cyts bir kaç saniye, kovalent olmayan bağlama Kofaktörler21,22, flavins işlevi 23. bu nedenle, OM cüzerinden EET işlem tarafından hızı sınırlama flavin ek tarafından bir anlık anodik geçerli artış gösterir - Cyts (şekil 5). Biz daha fazla elektron arabulucu KIE üzerinde mekik etkisini doğruladı. Küçük Redoks molekülleri, örneğin, anthraquinone-1-Sülfonat (α-AQS), OM c- Cyts15 ile doğrudan elektron taşıma yerine elektrot mikrobiyal elektron taşıma zinciri Difüzyon tarafından EET işlemi sonlandırmak , 24. burada, buna ek olarak 100 µM α-AQS tarafından geçerli üretim daha fazla 5-fold geliştirilmiş (şekil 4b), hangi gösterir Kinetik metabolik reaksiyonların hızı sınırlaması adım işlemek EET yapmak için yeterince hızlı. Sürekli olarak, geçerli üretim α-AQS tarafından aracılı D2O ek (4b rakam), D2O tarafından metabolik reaksiyonlarda olası gecikme şekil 4a gözlenen büyük KIE neden olmaz gösteren tarafından etkilenmemiş kaldı .
Kasanın üzerinde elektron taşıma OM cile KIE gözlemlemek için bu iki yaklaşım - Cyts kritik nokta bu raporun biridir ve özellikle, elektron arabulucu mekik diğer electroactive biyofilmler için geçerli olabilir. Geçerli değişikliği EET işleme atanan onayladıktan sonra buna ek olarak, biz bir kısmi silme mutant OM cetkisini değerlendirmek - Cyts veya OM cile ilişkili bir flavin Cyts - proton üzerinde Kinetik KIE karşılaştırarak transferi Her iki durumda15. Ne zaman D2O FMN huzurunda eklendi böyle FMN FMN bağlama proton taşıma yolu ve onun Kinetik (şekil değişmiş gösteren, onsuz daha küçük OM cile bağlama - Cyts, geçerli azalma düşürüldü 4 c)15.
Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan elektrokimyasal reaktör. Elektrokimyasal hücre inşaat (bir) önce ve sonra inşaat (b) fotoğrafı. (c) elektrokimyasal reaktör 0,4 V, elektrokimyasal aşılama 25 h sonra şematik vs o. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir ITO elektrot monolayer biyofilm oluşumu sırasında S. Corynebacterium Bay-1'den temsilci geçerli üretim. Bir ok hücre süspansiyon ek elektrokimyasal reaktör içine süresini gösterir. Aynı eğilim en az beş bireysel deneylerde yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: süpernatant temiz tanımlanmış orta (DM) 10 mM laktat ile değiştirilmesi. (bir) azot gazı akışı sıvı yüzeyi yukarıda. (b) süpernatant elektrokimyasal reaktör üzerinden kaldırılması. (c) 4.0 mL taze DM içeren ek 10 mM laktat. Orta eklenmesinden sonra reaktör reaktör duvarına bitişik süpernatant kaldırmak için eğimli. Bu yordam (bir-c) toplamda üç kez yapmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: D2O ek monolayer biyofilm geçerli üretimden S. Corynebacterium Bay-1'in üzerinde etkisini. Geçerli üretim karşı süre monolayer biyofilm S. Corynebacterium Bay-1 10 mM laktat (bir), bir ek 100 µM anthraquinone-1-Sülfonat içeren bir elektrokimyasal sisteminde (α- AQS) (b), ya da bir ek 2 µM flavin mononucleotide (FMN) (c). Aynı eğilim en az dört bireysel deneylerde yeniden. Oklar zaman D2O (düz çizgi) veya H2O eklenmesi (noktalı çizgi) gösterir. Noktalı çizgi için karşılık gelen veri veri noktası hemen önce D2O düz çizgi veri eklenmesi için normalleştirilmiş. D2O elektrokimyasal reaktör içinde konsantrasyon belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: değerlendirme oranı belirleme buna ek olarak flavins tarafından S. Corynebacterium Bay-1 bir monolayer biyofilm geçerli üretimde adım. Geçerli üretimden monolayer biyofilm S. Corynebacterium Bay-1 10 mM laktat (düz çizgi), 1.0 mM laktat (kesik çizgi) ve 0,1 mM laktat (noktalı çizgi) huzurunda karşısında anda. Bir ok hangi 1 µM flavin mononucleotide (FMN) elektrokimyasal reaktörler eklendi zaman noktası gösterir. 10 mM laktat huzurunda FMN yanı sıra büyük ölçüde A'dan C'yeekstraselüler elektron taşıma (EET) bu gösteren geçerli üretimi arttı-yazın bakteriyel dış membran gömülü sitokrom kompleksleri (OM c - Cyts) oranı belirlenmesi. Laktat daha az konsantrasyon elektrokimyasal reaktör daha küçük bir geçerli geliştirme tarafından FMN ek olarak gösteren, elektron kaynağı neden ters yönde metabolik reaksiyonlar OM cden - Cyts yavaş yavaş EET hızından daha yavaş oldu. Aynı eğilim en az iki bireysel deneylerde yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim bütün hücreli elektrokimyasal tahlil protein elektrokimya ile karşılaştırıldığında çeşitli teknik avantajları vardır. Protein saflaştırma Multi-step zaman alıcı yordamlar gerektirir, bizim bütün hücreli yöntemi hücre kültürü sonra kendi kendine organize biyofilm oluşumu bir gün alır. OM carasında istikrarlı bir etkileşim elde etmek için - Cyts ve elektrot, biz sadece sterilizasyon ve elektrot yüzeyi Temizleme proteinler4, örneğin, Corynebacterium S. Bay-1 yönünü özünde organize elektrot cOM yönlendirme sırasında verdiği için elektrot değişiklik gerektirmez - Cyts aynı yönde25 , 26 , 27. buna ek olarak, proteinlerin elektrokimyasal reaksiyonlara hassas Redoks siteleri protein ve elektrot; arasındaki mesafe etkilenir Böylece, saf protein dikkatle odaklı28,29olması gerekir. Daha da önemlisi, tüm hücreli elektrokimyasal tahlil doğrudan bir lipid membran diğer membran proteinler ile olası etkileşim ile gömülü OM c- Cyts kompleksleri karakterize ve çok yerli proton yansıtır OM yönetiminde c - Cyts (Bu kez saf protein kullanarak taklit zor).
Ancak, bizim tekniği D2O. metabolik süreçleri ve büyüme19D2O konsantrasyonları potansiyel yavaşlatmak yüksek konsantrasyon ile ilgili bir sınırlama yoktur; Bu nedenle, daha az %4 (v/v) Bu protokole düşüktü D2O konsantrasyonları kullanarak deneyler yaptı. Ayrıca, çünkü mikrop gen ifade karmaşık bir şekilde düzenlenmiştir, küçük koşullu farklılıklar şiddetle mikrobiyal fenotip ve hatta elektron taşıma Kinetik etkileyebilir. Özellikle, S. Corynebacterium Bay-1 biyofilm geçerli üretim sırasında laktat konsantrasyonu azalır; Bu nedenle, önce hızı sınırlaması işlemi ters yönde metabolik reaksiyonlar vardiya KIE deney önemlidir.
En kritik başarıyla KIE elde etmek için nokta netleştirmek ve içinde elektron taşıma OM c- Cyts sınırları bütün hücreli elektrokimyasal tahlil tarafından izlenen geçerli üretim oranı durumu onaylamak için var. Bu protokol için biz EET oranını sınırlayan ve mikrobiyal geçerli üretim yansıtır onaylamak nasıl açıklar. Biz iki yöntem bir arada tanıttı; Geçerli değişikliği flavin ek23ve D2O ek bir akışkanın elektron arabulucu, örneğin, α-AQS15 (şekil 4 ve şekil 5) huzurunda tarafından gözlenmesi. Bir işlem EET hızı sınırlaması yapamıyorsanız, en muhtemel nedeni eksik oluşumu veya fiziksel dekolmanı monolayer biyofilm veya diğer mikroplar tarafından kirlenme olurdu. Monolayer biyofilm oluşumu elektron mikroskopi veya confocal mikroskobu tarama tarafından onaylanması önerilir. Orta değiştirme işleminin biyofilm zarar son derece mümkündür; Bu nedenle, kaldırma ve enjeksiyon orta yavaş yavaş yapılmalıdır ve azot gazı sıvı yüzey (şekil 3) akışı gerekir. Bir Tekdüzen monolayer biyofilm işlemek EET hızı sınırlaması yapmaz, orta bileşenleri ve ölçüm koşulları, örneğin, 10 mM, daha yüksek bir konsantrasyon, laktat takviyesi için daha fazla ivme reexamine en iyisi ters yönde metabolik süreçleri. Bu konuları da EET özellikli mikroplar başka tür önemlidir. Elektron arabulucu özellikle EET işlem hızı sınırlaması EET özellikli mikrop bakteri suşlarının karışımlar dahil olmak üzere diğer türleri olduğunu doğrulamak için kullanılabilir; Böylece, bu iletişim kuralını protonlar bakteri/elektrot arayüz doğrudan elektron taşıma Kinetik etkisini araştırmak için genel bir yöntem olarak düşünün. EET işlem hızı sınırlaması göre EET diğer mikrobiyal suşları ve konsorsiyumlar, gözlenen göz önüne alındığında, bu iletişim kuralını anaerobik demir korozyon ve metan-oksidasyon süreçleri mikrobiyal solunum yanı sıra bu eğitim için geçerlidir 30,31mikrobik yakıt hücreleri.
Sistemimiz S. Corynebacterium Bay-1 monolayer biyofilm EET hızı sınırlaması oluşum yolu ile OM cile - Cyts sadece OM cbiyokimyasal karakterizasyonu için de KIE deneyler için kullanılabilir - Cyts. Örneğin, farklı konsantrasyonlarda OM ckofaktör olarak bağlamak flavins ilavesi flavin bağlı OM coluşumu için ayrışma sabiti (Kd ~ 10 µM) elektrokimyasal miktar - Cyts izin verir misiniz- Cyts kompleksleri32,33,34. Ayrıca, son iş ters elektron geri tepme oluşum yolu ile OM c- Cyts olabilir gösterdi Katodik geçerli üretim33,34ile karakterize. Elektron geri tepme OM chemiosmotic ATP sentezi35için bir kaynak olarak proton alma ile ilişkili olduğunu önerilmiştir; Bu nedenle, proton elektron geri tepme Kinetik OM cüzerindeki etkisini incelemek için büyük ilgi olduğunu - Cyts.
Sonuç olarak, biz teknikleri döteryum KIE OM c- Cyts S. Corynebacterium Bay-1 yaşayan kullanarak üzerinden EET Tarih incelemek için geliştirilmiştir. Teknik kullanılabilir karakterizasyonu OM c- Cyts gibi KIE gözlem ve bu electrogenic diğer mikroplar için potansiyel olarak uygulanabilir. Bu yöntem-ebilmek var olmak doğrudan doğruya yolu ile OM c- Cyts içinde vivoEET araştırmak için genel bir teknik inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser mali özel olarak terfi araştırma--dan Japonya toplum için bilim promosyon (JSP'ler) KAKENHI Grant sayı 24000010, 17 H 04969 ve JP17J02602, bizi Office, deniz araştırma Global (N62909-17-1-2038) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir. Y.T. JSP'ler araştırma görevlisi ve önde gelen lisansüstü okulları (hak) için Program sayesinde JSP'ler tarafından desteklenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
