Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57584

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול של כל תא אלקטרוכימי ניסויים ללמוד את התרומה של פרוטון תחבורה לקצב התחבורה אלקטרון חוץ-תאית באמצעות cytochromes הממברנה החיצונית מתחם Shewanella oneidensis מר-1.

Abstract

ישיר זיהוי אלקטרוכימי של c-הקלד מתחמי ציטוכרום מוטבע בתוך הממברנה החיצונית חיידקי (הממברנה החיצונית c-הקלד ציטוכרום מתחמי; אום c- Cyts) יש לאחרונה הופיעו כשיטה הרומן השלם-תא אנליטי לאפיין התעבורה חיידקי אלקטרונים בשרשרת הנשימה אל החוץ תא, המכונה התעבורה אלקטרון חוץ-תאית (EET). בזמן מסלול וקינטיקה של זרימת אלקטרונים במהלך התגובה EET נחקרו, שיטה אלקטרוכימי תאים שלמים כדי לבחון את השפעת התחבורה הקטיון המשויך EET לא טרם הוקם. במחקר הנוכחי, דוגמה טכניקה הביוכימי לבחון את דאוטריום איזוטופ קינטי (KIE) על EET דרך אום c- Cyts באמצעות מודל ומה איתי, מר Shewanella oneidensis -1, הוא תיאר. ניתן להשיג את KIE על תהליך EET אם EET דרך אום c- Cyts משמש הצעד הגבלת קצב הייצור הנוכחי מיקרוביאלי. לשם כך, לפני התוספת של D2O, הפתרון supernatant הוחלף טריים המדיה המכילה כמות מספקת של התורם אלקטרון כדי לתמוך הקצב של תגובות חילוף החומרים במעלה הזרם, וכדי להסיר תאים פלנקטוניים מדים טפט biofilm על האלקטרודה עבודה. שיטות אלטרנטיביות כדי לאשר הגבלת הקצב את שלב הייצור הנוכחי מיקרוביאלית כמו EET דרך אום c- Cyts מתוארים גם. הטכניקה שלנו של assay אלקטרוכימי תאים שלמים על חקירת קינטיקה תחבורה פרוטון יכול להחיל על זני חיידקים אחרים electroactive.

Introduction

בטכניקות אלקטרוכימיות לאפיין ישירות חלבון חמצון-חיזור תא החיידק ללא פגע לאחרונה הופיעו מאז הגילוי להפחתת מתכת זני חיידקים, כגון oneidensis ס מר-1 או Geobacter sulfurreducens PCA, אשר יש מתחמי ציטוכרום c-type הממברנה החיצונית (OM c-Cyts) נחשפים תא חיצוני1,2,3,4,5. אום c- Cyts מתווכים התחבורה אלקטרונים בשרשרת הנשימה סובסטרטים מוצק ממוקם extracellularly. העברה זו נחשבת אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET)1,6 , תהליך קריטי עבור מנרב המתעוררים, כגון חיידקים בתאי דלק6. לכן, כדי להבין קינטיקה EET הבסיסית של מנגנונים ואת זיקתה פיזיולוגיה מיקרוביאלי, אום c -Cyts נחקרו באמצעות תאים שלמים אלקטרוכימיה4,7, בשילוב עם מיקרוסקופ 8 , 9,10,ספקטרוסקופיה11וביולוגיה מולקולרית2,4. לעומת זאת, שיטות כדי לחקור את השפעת התחבורה הקטיון הקשורים EET, למשל, פרוטונים, על EET קינטיקה בתאים חיים בקושי הוקמו, למרות פרוטון תחבורה מעבר ממברנות חיידקי יש תפקיד קריטי איתות, הומאוסטזיס ואנרגיה ייצור12,13,14. בהווה ללמוד, נתאר טכניקה כדי לבחון את השפעת התחבורה פרוטון-קינטיקה EET בתא oneidensis ס מר-1 באמצעות כל-תא אלקטרוכימי מדידות, המחייב את הזיהוי של הצעד הגבלת קצב חיידקים הנוכחי הפקה15.

דרך ישירה אחת כדי להעריך את התרומה של פרוטון הובלה על EET המשויך הוא אפקט קינטי איזוטופ דאוטריום (KIE). KIE הוא מקהים השינוי ב קינטיקה העברת אלקטרונים על החלפת פרוטונים עם יונים דאוטריום, אשר מייצג את השפעת התחבורה פרוטון אלקטרון העברה קינטיקה16. התיאוריה של KIE עצמה הוכח גם באמצעות מדידות אלקטרוכימי עם אנזימים מטוהרים17. עם זאת, מאז הייצור הנוכחי ב ס oneidensis מר-1 היא תוצאה של תהליכים מגוונים, המשתנות מרובים,18, אחד יכול פשוט לזהות EET כתהליך הגבלת קצב. כדי לבחון את KIE על פרוטון תחבורה תהליכים בשילוב עם EET, עלינו לוודא כי ההפקה הנוכחית חיידקים מוגבל על ידי אלקטרון תחבורה באמצעות אום c- Cyts אל האלקטרודה. למטרה זו, החלפנו את הפתרון supernatant בינונית טריים המכילים ריכוז גבוה של חומצת החלב כמו תורם אלקטרון pH אופטימלי, בתנאי טמפרטורה לפני המדידה KIE; החלפת הזה שימש שני תפקידים: (1) קצב התהליכים המטאבוליים במעלה בהשוואה EET לבין (2) הושמט התאים שחיה תגובת שיקוע שוחררו את biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 ב (אלקטרודה העבודה אינדיום בדיל-מסטול אוקסיד (ITO) אלקטרודה). פרוטוקול מפורט הציג מיועדת לסייע מתרגלים חדשים לשמור, לאשר כי התהליך EET הוא השלב שקובעים שיעור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. היווצרות ממבנה Biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 באלקטרודה איטו (איור 1)

הערה: כדי למנוע את הזיהום של הכור אלקטרוכימי עם חיידקים אחרים, כל התקשורת, סככה, ו רכיבים של הכור אלקטרוכימי צריכים לעקר מראש. כאשר באמצעות תאים oneidensis ס מר-1, בניית הכורים אלקטרוכימי, כל ההליכים וצריך להתנהל על ספסל נקי.

  1. הטיפוח של oneidensis ס מר-1 תאים
    הערה: ממבנה biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 הוקמה ב איטו אלקטרודה בעקבות התנאים דיווח בעבר4.
    1. לגדול oneidensis ס מר-1 תאים, להוסיף מושבה אחת של מר ס oneidensis -גדל על צלחת אגר הכוללת לוריא-Bertani (ליברות) (20 גרם/ליטר) מה נשארתי אגר (15 גר'/ליטר) לתוך 15 מ"ל של מדיום ליברות (20 גרם/ליטר) ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה בתנאים אירוביים ברעידות-160 סיבובים לדקה 1.
    2. Centrifuge התליה תא ב 6,000 × g למשך 10 דקות ולאחר resuspend בגדר תא תוצאות ב-15 מיליליטר מוגדר בינוני (pH 7.8) (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6-אייץ '2O [0.2 g/L], NaCl [10 גרם/L], ו- 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] חומצה ethanesulfonic [HEPES; 7.2 g/L]), שהושלם עם תמצית שמרים 0.5 g/L כמקור פחמן, ו 10 מ מ לקטט ויסודות עבור מר ס oneidensis -1 , בהתאמה.
    3. עוד יותר לטפח התליה תא aerobically ב 30 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות ברעידות-160 סיבובים לדקה, centrifuge שוב ב 6,000 × g עבור 10 דקות לשטוף בגדר תא הנובעת פעמיים עם מיט בינוני על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב g 6,000 × לפני אלקטרוכימי הניסוי.
  2. הקמת כור אלקטרוכימי שלוש-אלקטרודה (איור 1)
    1. לשים על מצע איטו כמו האלקטרודה עבודה בחלק התחתון של הכור.
    2. לאחר מכן, הוסף גליל זכוכית (קוטר של 2 ס מ), כיסוי טפלון (PTFE). ואז להוסיף Ag/AgCl (אשלגן כלורי רווי) ו חוט פלטינה לתוך הכור האלקטרודות הפניה, מונה, בהתאמה.
      הערה: כדי למנוע דליפת אוויר, פתרון, הכנס סדין גומי בוטיל בין כל אחד מהרכיבים.
    3. להוסיף מ 4.0 ל DM בתוספת 10 מ מ לקטט ולחלץ 0.5 g/L שמרים לתוך הכור אלקטרוכימי.
    4. לאחר שנוכח שיש אין זליגות הכור אלקטרוכימי, זרימת הגז חנקן לתוך הכור אלקטרוכימי מעל 20 דקות כדי לשמור על תנאים אנאירוביים בתוך הכור אלקטרוכימי.
      הערה: כדי למנוע זיהום, עם חיידקים אחרים, הגז לסנן לפני זורם לתוך הכור אלקטרוכימי.
    5. להתחבר הכור אלקטרוכימי potentiostat ולהחיל +0.4 V (לעומת אלקטרודת מימן סטנדרטי, היא) אל האלקטרודה איטו, שמירה על הטמפרטורה של הכור אלקטרוכימי ב 30 מעלות צלזיוס, באמצעות מערכת מחזור מים חיצוני.
      הערה: כדי למנוע את ההשפעה של שדה חשמלי חיצוני, הכור אלקטרוכימי צריך להיות ממוקם בתוך כלוב פאראדיי.
  3. טיפוח אלקטרוכימי של תאים מר-1 ס' oneidensis (איור 1 ו- 2 איור)
    1. להתאים את צפיפות התאים ההשעיה שהושג בשלב 1.1 צפיפות אופטית של 1.43 על 600 nm (OD600) עם מיט בתוספת שמרים ו לקטט 0.5 g/L 10 מ מ לחלץ.
      הערה: כדי לקבל את יתר הנכון600, חלות על השעיית תא OD600 ≤ 0.8 ספקטרומטר UV-vis לפני התאמת ה OD600 ל 1.43.
    2. להוסיף mL 0.3 של התליה תא לתוך הכור אלקטרוכימי דרך היציאה הזרקת באמצעות מזרק: ה OD600 לכור משתנה ל- 0.1.
      הערה: התוספת של 0.3 mL התליה תא עם יתר600 = 1.43 לתוך הכור אלקטרוכימי המכילה תוצאות בינוניות 4.0 מ"ל ב- 4.3 mL פתרון עם יתר600 = 0.1. כשמשתמשים אחרים כורים עם אמצעי אחסון שונה, חישוב צפיפות תא נדרש.
    3. המשך היישום פוטנציאליים-+0.4 V (לעומת היא) אל האלקטרודה איטו עבור 25 h.
      הערה: להיווצרות ממבנה biofilm חד שכבתי על אלקטרודה איטו, ודא כי הזרם המיוצר תערוכות של סטיית פחות מ 50% מאיור 2.

2. החלפת תגובת שיקוע בינונית מיט טריים עם 10 מ מ לקטאט (איור 3)

  1. עוצרים את פוטנציאל היישום, נתק את הכור אלקטרוכימי של potentiostat ואת מערכת מחזור מים.
  2. לקטט החלפת תגובת שיקוע בינונית מיט טריים עם 10 מ מ
    1. זרימת הגז חנקן לתוך בקבוק המכיל מיט עם לקטט 10 מ מ מעל 20 דקות כדי להסיר את החמצן של המדיום.
    2. הסר כל תגובת שיקוע בתוך הכור אלקטרוכימי באמצעות מזרק, תחת זורם גז חנקן (איור 3 א, ב').
      הערה: כדי למנוע את שבירת את biofilm על האלקטרודה איטו על ידי גז חנקן, הגז צריך לזרום מעל פני השטח נוזלי.
    3. להוסיף מ 4.0 ל DM טריים המכילים לקטט 10 מ מ באמצעות מזרק (איור 3 c).
      הערה: כדי למנוע את שבירת את biofilm על האלקטרודה איטו, להזריק לאט המדיום לאורך החומה של הכור אלקטרוכימי. כדי לשמור את biofilm רטוב, יש להוסיף את המדיום מיד לאחר הסרת תגובת שיקוע. הזרקה של עד בינוני 1 דקות לאחר הסרת תגובת שיקוע לא משפיע על הייצור הנוכחי מ biofilm של מר ס oneidensis -1.
    4. שיפוע-הכור אלקטרוכימי כדי להסיר כל תגובת שיקוע מחובר לקיר של הכור אלקטרוכימי.
    5. חזור על צעדים 2.2.2-2.2.4 שלוש פעמים בסך הכל.
  3. לעצור את זרימת הגז ולהתחבר הכור אלקטרוכימי potentiostat שוב, החלה +0.4 V (לעומת היא) על האלקטרודה איטו-303 K...

3. תוספת של דאוטריום מים כדי למדוד את KIE על תהליך EET (איור 4)

  1. לאשר כי הייצור הנוכחית החל ממבנה biofilm טפט של oneidensis ס מר-1 הינה יציב, אין להגדיל במהירות. אם הזרם עולה בתלילות, המתן עד הנוכחי מייצבת תוך העלאה של 5% מעל 10 דקות.
    הערה: היווצרות של ממבנה biofilm חד שכבתי על אלקטרודה איטו ללא זיהום של זני חיידקים אחרים אושר ע י רצפים rDNA ותמונה סריקה אלקטרון מיקרוסקופיות של biofilm על אלקטרודה איטו, כפי שדווח בעבר4. עבור אישור של המגבלה קצב על ידי תהליך EET, לנטר את ההשפעה של הוספת והצוות מגשרים אלקטרונים כגון מיקרומטר 100 anthraquinone-1-סולפונאט (α-AQS). עיין בסעיף של נציג תוצאות וצור הפניה15 לפרטים נוספים.
  2. להוסיף 40 µL של אנאוקסיים 50% (v/v) ד2O לתוך הכור אלקטרוכימי באמצעות מזרק כך הריכוז הוא 0.5% (v/v) ד2O לכור.
    הערה: כדי למנוע נזק biofilm על ידי תוספת2O D, להזריק את D2O drop-wise.
  3. המתן הנוכחי לייצב, ולאחר להוסיף לאחר מכן D2O עד 4.0% (v/v).
    הערה: כדי לקבל את הערך KIE (היחס בין הייצור הנוכחי בנוכחות D2O ו- H2O), לבדוק את השפעת באותו אמצעי אחסון של H2O בנוסף על ההפקה הנוכחית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר 25 h של פוטנציאל היישום ב- +0.4 V (לעומת היא), ממבנה biofilm טפט הוקמה ב האלקטרודה עבודה של זכוכית ITO, אשר אושר קודם לכן ע י או של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה או מיקרוסקופיה קונפוקלית4. המסלול הפעם נציג של הייצור הנוכחי של ה- S. oneidensis מר-1 במהלך היווצרות ממבנה biofilm טפט מוצג באיור2. למרות הנוכחי הפיצולים במדידה כל, המיוצר הנוכחי לא להפגין סטייה מעל 50% מהערך באיור 2 אם ממבנה biofilm טפט נוצר בצורה אחידה.

לאחר החלפת תגובת שיקוע עם מיט טריים עם 10 מ מ לקטט למקסם את שיעור של תהליכים מטבוליים. ולשטוף את biofilm חד שכבתי (איור 3), זרם אנודי יציב (כ-5% עלייה ב- 10 דקות) יכול להיות שנצפו תחת +0.4 V (לעומת היא ) יישום (איור 4a). אם הזרם אנודי עולה בתלילות, המתן עד הנוכחי מייצבת. . זה מאוד אפשרי כי הליכי החלפת supernatant המתוארים בסעיף 2 עלולה לגרום נזק את biofilm, שחזור יכול להתרחש.

הקו המלא באיור 4a היא התוצאה נציג לשינוי הנוכחי מיקרוביאלי המושרה על ידי הוספת2O D. התוספת של 1.0% (v/v) D2O ירד בחדות הנוכחית חיידקים בתוך 10 s, בעוד כמעט ירידה הנוכחי נצפתה על ידי התוספת של H2O (קו מנוקד ב איור 4a)15. אותה מגמה שוחזר לפחות ארבעה ניסויים נפרדים. תוספת רציפים של D2O בריכוזים סופי הנע בין 0.5% ל- 2.0% (v/v) בבירור הציג הדיכוי הנוכחי הפקה (איור 4a)15. כי ההפקה הנוכחית חיידקים התאוששה בהדרגה ככל הנראה עקב השפעה פיזיולוגית19,20, KIE להקצותם כדי הירידה הנוכחית זמן קצר לאחר התוספת של D2O. בדוח הקודם, אספנו את הייצור הנוכחי כ- 10 דקות לאחר התוספת של D2O כדי לחשב את הערך של KIE15.

אנחנו באמצעות שתי שיטות, אישר כי הירידה הנוכחי שנצפו על ידי הוספת2O D היא לייחס KIE על EET דרך המתחם - Cyts cOM. ראשית, הוספנו 1 מיקרומטר ריבופלבין (RF) או פלווין mononucleotide (FMN) לתוך הכור אלקטרוכימי לפני ואחרי התוספת2O D, אשר יכול לשמש כדי לחקור EET ב ס oneidensis מר-1. במקרה של מר ס oneidensis -1, flavins במיוחד להאיץ את תהליך EET על-ידי איגוד עם אום c- Cyts בעוד כמה שניות, כי flavins לתפקד כמו איגוד קשרי ערכיות cofactors21,22, 23. לכן, עלייה הנוכחי אנודי מיידית על ידי תוספת פלווין מציין הגבלת קצב על ידי תהליך EET באמצעות אום c- Cyts (איור 5). אנחנו עוד יותר אישר את ההשפעה של הליכה הלוך ושוב אלקטרון מגשרות על KIE. מולקולות קטנות חמצון-חיזור, למשלanthraquinone-1-סולפונאט (α-AQS), לסיים את התהליך EET מאת לשדר בשרשרת מיקרוביאלי אלקטרון תחבורה אל האלקטרודה, במקום תחבורה ישירה אלקטרון באמצעות אום c- Cyts15 , 24. כאן, התוספת של 100 מיקרומטר α-AQS משופרת לייצור הנוכחי על ידי יותר מ 5 פי (איור 4b), אשר מציין כי קינטיקה של תגובות חילוף החומרים אינם מהירים מספיק כדי להפוך את EET לעבד את הצעד הגבלת קצב. באופן עקבי, הייצור הנוכחי מתווכת על-ידי α-AQS נותרה מושפע D2O תוספת (איור 4b), הוכחת כי העיכוב הפוטנציאלי תגובות חילוף החומרים על ידי D2O אינו גורם את KIE גדול שנצפתה איור 4a .

השילוב של שתי גישות אלה כדי לבחון את KIE בתחבורה אלקטרון עם אום c- Cyts היא הנקודה הקריטית של דו ח זה, וניתן באופן ספציפי, הליכה הלוך ושוב אלקטרון מגשרים החלים biofilms electroactive אחרים. בנוסף, ברגע לנו אישר כי השינוי הנוכחי מוקצה לתהליך EET, אנחנו יכולים להעריך את ההשפעה של מוטציה חלקית מחיקה של אום c- Cyts או של פלווין המשויך אום c- Cyts על הפרוטון להעביר קינטיקה על-ידי השוואת את KIE ב בשני המקרים15. כאשר D2O נוספה בנוכחות FMN קשירה עם אום c- Cyts, הירידה הנוכחית צומצם כך זה היה קטן יותר בלי FMN, המציין כי הכריכה של FMN שינו מסלול התחבורה פרוטון וקינטיקה שלה (איור 4 c)15.

Figure 1
איור 1: הכור אלקטרוכימי השתמשו במחקר זה. תצלום של תא אלקטרוכימי לפני הבנייה () ואחרי בנייה (b). (ג) איור סכמטי של הכור אלקטרוכימי לאחר 25 h של חיסון אלקטרוכימי-+0.4 V vs היא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הייצור הנוכחי נציג מ ס oneidensis מר-1 במהלך היווצרות biofilm חד שכבתי על אלקטרודה איטו. חץ מציין את הזמן של התוספת של התליה תא לתוך הכור אלקטרוכימי. אותה מגמה שוחזר לפחות חמישה ניסויים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: החלפת תגובת שיקוע לבינוני מוגדר טריים (DM) עם לקטט 10 מ מ. () גז חנקן זרימה מעל פני השטח נוזלי. (b) הסרת תגובת שיקוע של הכור אלקטרוכימי. (ג) תוספת של 4.0 מ"ל המכיל מיט טריים לקטט 10 מ מ. לאחר התוספת בינוני, הכור צריך להיות מלוכסנות כדי להסיר את תגובת שיקוע מחובר לקיר של הכור. לנהל הליך האלה (c) שלוש פעמים בסך הכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ההשפעה של תוספת2O D על הייצור הנוכחית החל ממבנה biofilm טפט של מר ס oneidensis -1- זמן מול הייצור הנוכחי ממבנה biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 בכל מערכת אלקטרוכימי המכיל 10 מ מ לקטאט (), מיקרומטר 100 נוספים anthraquinone-1-סולפונאט (α- AQS) (b), או של מיקרומטר 2 נוספים פלווין mononucleotide (FMN) (c). אותה מגמה שוחזר לפחות ארבעה ניסויים בודדים. החצים מצביעים על הזמן של התוספת של D2O (קו רציף) או H2O (קו מנוקד). הנתונים המתאימים על הקו המנוקד היו מנורמל לנקודת נתונים בדיוק לפני התוספת של D2O נתונים לקו אחיד. הריכוז של D2O לכור אלקטרוכימי מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הערכה של שקובעים הקצב שלב הייצור הנוכחית החל ממבנה biofilm טפט של oneidensis ס מר-1 על ידי התוספת של flavins. הגיע הזמן מול הייצור הנוכחי החל ממבנה biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 בנוכחות 10 מ מ (קו רציף), לקטט 1.0 מ מ (קו מקווקו), ו לקטט לקטט 0.1 מ מ (קו מנוקד). חץ מצביע על נקודת זמן על איזה 1 מיקרומטר פלווין mononucleotide (FMN) נוספה לתוך הכורים אלקטרוכימי. בנוכחות לקטט 10 מ מ, התוספת של FMN באופן דרסטי גדל הייצור הנוכחי, והוכח כי התחבורה אלקטרון (EET) חוץ-תאית באמצעות c-הקלד מתחמי ציטוכרום מוטבע בתוך הממברנה החיצונית חיידקי (OM c - Cyts) הוא קביעת קצב. פחות לקטט ריכוז לכור אלקטרוכימי שנגרמו הנוכחי שיפור קטן FMN תוספת, המציין את אספקת אלקטרון מן התגובות מטבולית במעלה הנהר אום c- Cyts בהדרגה איטי יותר מאשר הקצב EET. אותה מגמה שוחזר לפחות שני ניסויים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלנו assay אלקטרוכימי של תאים שלמים יש כמה יתרונות טכניים לעומת חלבון אלקטרוכימיה. בעוד טיהור חלבון דורש הליכים גוזלת זמן רב שלבי, השיטה כולה-תא שלנו לוקח יום אחד של ביופילמים עצמית מאורגן לאחר תרבית תאים. כדי להשיג את האינטראקציה יציב בין אום c- Cyts האלקטרודה, אנחנו זקוקים רק עיקור, ניקוי של פני האלקטרודה; . זה לא דורש שינוי אלקטרודה עבור ארגון את הכיוון של חלבונים4, למשל, ס' oneidensis מר-1 ממהותם מצרף אל האלקטרודה, תוך המכוונת אום c- Cyts הכיוון אותו25 , 26 , 27. לעומת זאת, התגובות אלקטרוכימי של חלבונים ברגישות מושפעים המרחק בין אתרים חמצון-חיזור החלבון האלקטרודה; לפיכך, החלבונים מטוהרים חייב להיות מונחה בקפידה28,29. וחשוב מכך, כל תא אלקטרוכימי וזמינותו ישירות מאפיינת אום c- Cyts מתחמי מוטבע בתוך קרום ליפיד עם האינטראקציות האפשריות עם חלבונים אחרים ממברנה, והוא אז משקף פרוטונים יליד ניהול אום c - Cyts (זה לעיתים קרובות קשה לחקות באמצעות חלבונים מטוהרים).

עם זאת, הטכניקה שלנו יש הגבלה לגבי ריכוז D2O. גבוהה ריכוזי D2O להאט תהליכים מטבוליים וצמיחה19; לכן, ערכנו ניסויים באמצעות ריכוזים של2O D שהיו פחות מ 4% (v/v) של פרוטוקול זה. בנוסף, כי ביטוי גנים בחיידקים מוסדר בצורה מורכבת, הבדלים קטנים מותנה עשוי להשפיע על פנוטיפ מיקרוביאלי וקינטיקה אפילו את התחבורה אלקטרון. בפרט, ריכוז חומצת החלב פוחתת במהלך הייצור הנוכחי של biofilm מר-1 oneidensis ש ; לכן, חשוב לערוך את הניסויים KIE לפני תהליך הגבלת קצב נוטה תגובות חילוף החומרים במעלה הזרם.

נקודה קריטית ביותר להשיג בהצלחה את KIE היא להבהיר ולאשר את המצב שבו האלקטרון להעביר דרך אום c- Cyts מגבלות קצב הייצור הנוכחי המנוטרת על-ידי כל-תא אלקטרוכימי וזמינותו. ב פרוטוקול זה, נסביר כיצד לוודא כי הקצב של EET מגביל ומשקף את ההפקה הנוכחית חיידקים. הצגנו בשילוב של שתי השיטות; התבוננות על השינוי הנוכחי על ידי תוספת פלווין23, תוספת2O D בנוכחות באמצעי אלקטרון מתווך, למשלα-AQS15 (איור 4 , איור 5). אם אחד לא יכול להפוך את EET לעבד הגבלת קצב, הסיבה הסביר ביותר יהיה מערך לא שלם או ניתוק פיזי של טפט biofilm או זיהום על ידי חיידקים אחרים. אנו ממליצים בחום המאשרת את היווצרות biofilm חד שכבתי על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים או מיקרוסקופיה קונפוקלית. יתכן מאוד כי תהליך החלפת בינוני נזקים של biofilm; לכן, הסרה של הזרקה של המדיום צריך להתנהל באיטיות, גז חנקן צריך לזרום מעל פני השטח נוזלי (איור 3). אם ממבנה biofilm טפט אחיד לא הופך את EET לעבד הגבלת קצב, מומלץ לבחון מחדש את הרכיבים בינוני והתנאים מדידה, למשלתוספת של חומצת החלב-ריכוז גבוה יותר מאשר 10 מ"מ, עבור האצה נוספת של תהליכים מטבוליים במעלה הזרם. שיקולים אלה חשובים גם בסוגים אחרים של חיידקים EET בעל יכולת. מגשרים אלקטרון יכול לשמש באופן ספציפי כדי לוודא התהליך EET הגבלת קצב בסוגים אחרים של חיידקים בעלי יכולת EET כולל תערובות של זני חיידקים; לפיכך, אנו רואים פרוטוקול זה כשיטה כללית כדי לחקור את השפעת לפרוטונים ב תחבורה ישירה אלקטרון-הממשק חיידקים/אלקטרודה קינטי. בהתחשב EET נצפית זני חיידקים אחרים, קונסורציומים, ככל תהליך EET הוא הגבלת קצב, פרוטוקול זה הוא ישים ללמוד על נשימה מיקרובית ברזל אנאירובית קורוזיה ותהליכים מתאן-חמצון וכן כי חיידקים דלק תאים30,31.

המערכת שלנו של מר ס oneidensis -1 biofilm חד שכבתי עם הגבלת קצב תהליך של EET באמצעות אום c- Cyts יכול לשמש לא רק עבור הניסויים KIE אלא גם עבור איפיון ביוכימי של אום c- Cyts. לדוגמה, התוספת של ריכוזים שונים של flavins לאגד כמו cofactors אום ° c- Cyts יאפשר כימות אלקטרוכימי של קבוע דיסוציאציה (Kd ~ 10 מיקרומטר) להיווצרות פלווין מכורך אום c- Cyts מתחמי32,33,34. יתר על כן, העבודה האחרונה שלנו הוכיח כי התהליך זרם אחורי אלקטרון ההופכית באמצעות אום c- Cyts יכול להיות מאופיין דרך cathodic הנוכחי הפקה33,34. הוצע כי זרם אלקטרונים אחורי קשורה פרוטון הייבוא על פני ונגזרותיה כמקור עבור סינתזת ATP chemiosmotic35; לכן, זה עניין רב כדי לבחון את ההשפעה של פרוטונים-קינטיקה זרם אחורי אלקטרון אום c- Cyts.

לסיכום, פיתחנו שיטות לבחון את דאוטריום KIE על EET דרך cOM - Cyts באמצעות חיים מר ס oneidensis -1. הטכניקה יכולה לשמש עבור אפיון של אום c- Cyts וכן תצפית KIE, וזה הוא להחלה חיידקים electrogenic אחרים. אנו מאמינים כי מתודולוגיה זו יכולה להיות שיטה כללית כדי לחקור את EET ישירות באמצעות אום c- Cyts vivo בתוך...

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק הסיוע במיוחד קידום מחקר החברה יפן של קידום המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר 24000010, 17H. 04969, ו JP17J02602, אותנו למשרד של חיל הים המחקר העולמי (N62909-17-1-2038). Y.T. היא עמיתת מחקר JSPS ונתמך על-ידי JSPS דרך התוכנית עבור המובילים לתואר שני בתי ספר (הצטיינות).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

ביוכימיה בעיה 134 אלקטרוכימיה כל תא cytochromes מתכת הפחתת חיידקים העברת פרוטון פלווין bioelectrochemistry תאי דלק מיקרוביאלי electroactive biofilm
אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר <em>Shewanella oneidensis</em> -1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, More

Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter