Summary
ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.
Abstract
直接cの電気化学的検出-細菌の外膜に埋め込まれているシトクロム複合体を入力 (外膜c-シトクロム複合体; を入力OM c- 假) が最近セル外部へ呼吸の鎖からの細菌の電子輸送を特徴付ける新規細胞分析法として登場、細胞外の電子輸送 (EET) と呼ばれます。経路と EET 反応の間に電子流の動態を調べた、一方 EET に関連付けられている陽イオン輸送の影響を調べる全細胞の電気化学的手法はまだ確立されていません。本研究では、重水素同位体効果 (キエ) EET の OM cを調べる生化学的手法の例 - 假モデル微生物、シェワネラ oneidensis氏-1, を使用して、説明します。OM cを介して EET - 假微生物の現在の生産の率制限ステップとして機能する場合、EET プロセスに KIE を取得できます。そのため、D2O は、加算の前に上澄みが上流の代謝反応の速度をサポートし、ユニフォームから浮遊性のセルを削除する電子供与体の十分な量が含まれている新鮮なメディアに置き換えられました作用電極上の単分子膜バイオ フィルム。レート制限を確認する方法は、微生物の現在の生産のステップ - 假 OM cを介して EET として述べる。プロトン輸送の動力学を調査するため細胞の電気化学的アッセイの我々 の手法は、他の電気活性微生物系統に適用できます。
Introduction
S. oneidensis氏 1、 Geobacter sulfurreducens 、PCA など、金属還元微生物菌株が発見されて以来そのままの細菌の細胞の酸化還元タンパク質を直接特徴付けるため電気化学的手法が近年します。外膜 c 型チトクロム複合体 (OM c 假) セル外観1,2,3,4、5の露出があります。OM c- 假は、呼吸鎖から細胞外に位置する固体基板上への電子輸送を仲介します。このトランスポートは、細胞外の電子輸送 (EET)1,6と呼ばれ、新興のバイオ テクノロジー、微生物燃料電池6などの重要なプロセスです。したがって、基になる EET の速度論と機構、および微生物生理学へのリンクを理解する OM c -假を用いて調べた細胞電気化学4、7顕微鏡と組み合わせて8,9、分光10、11、および分子生物学2,4。対照的に、EET 関連する陽イオン輸送など陽子 EET 細胞内動態の影響を調査する方法確立されているやっとのこと重要な役割を持つ細菌の膜を渡るプロトン輸送にもかかわらずシグナリング、恒常性とエネルギー生産12,13,14。本研究で、細胞電気化学測定法を使用しての率制限ステップの id を必要とするs. oneidensis氏 1 セルの EET 動力学に関するプロトン輸送の影響を調査する手法について述べる微生物現在生産15。
関連付けられた EET のプロトン輸送の貢献を評価する直接方法の 1 つは重水素同位体効果 (キエです)。KIE 電子転送速度16プロトン輸送の影響を表す重水素イオン、プロトンの交換時に電子伝達速度の変化として観察可能であります。KIE 自体の理論定着させてきた電気化学測定法を用いた精製酵素17。しかし、以来、 s. oneidensis氏-1 の現在の生産の結果、複数の多様なと変動プロセス18から、レート制限プロセスとして EET を識別できない単に 1 つ。EET と相まってプロトン輸送過程の KIE を観察する我々 は OM cを介して電子輸送によって微生物の現在の生産が制限されることを確認する必要があります - 電極に假。この目的のため最適 pH と KIE 測定前に温度条件を電子供与体として乳酸の高濃度を含む新鮮な培地と培養上清中のソリューションを置き換えこの交換は、2 つの役割を提供しています: (1) これに EET と比較して上流の代謝プロセスのレートを強化、(2) 作業電極 ( s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから発売清スイミング セルの省略インジウム スズ添加酸化物 (ITO) 電極)。提示の詳しいプロトコルを新しい実務を維持し、EET プロセスが、律速段階であることを確認します。
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Protocol
1. s. oneidensis氏-1 ITO 電極 (図 1) 上の単分子膜バイオ フィルムの形成
注: 他の微生物の電気化学リアクターの汚染を防ぐためには、すべてのメディア、実装、および電気化学リアクターのコンポーネント殺菌を行う事前に。ときにすべてのプロシージャをクリーン ベンチで行うべきs. oneidensis氏 1 セルを使用し、電気化学リアクターを構築します。
- S. oneidensis氏 1 細胞の培養
注: s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムが形成された ITO 電極条件を以下報告以前4。- S. oneidensis氏 1 細胞を成長するには、 s. oneidensis氏-1 ルリア ベルターニカミラ (LB) (20 g/L) を有し、15 mL の LB 培地 (20 g/L) 160 rpm で振とうしながら好気性条件で 24 h の 30 ° c になる寒天 (15 g/L) 寒天プレート上に成長のコロニーを追加します。
- 6,000 × g , 10 分間の細胞懸濁液を遠心し、15 mL の培地 (pH 7.8) で得られた細胞ペレットを再懸濁します (DM: NaHCO3 【 2.5 g/L CaCl2·2H2O [0.08 g/L]、NH4Cl 【 1.0 g/L MgCl2·6 H2O 【 0.2 g/L 塩化ナトリウム 10 g/L と 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] [HEPES; 7.2 g/L] ethanesulfonic 酸) 10 mM 乳酸と 0.5 g/L 酵母エキス、炭素源として補われた、 s. oneidensis氏 - 1 微量元素、それぞれ。
- さらに 160 rpm で振とうしながら 12 h 30 ° C で好気性細胞懸濁液を育成、遠心力場再び 6,000 × g 10 分洗浄で DM 媒体で 2 回結果細胞ペレットの電気化学的前に 6,000 × g で 10 分間遠心分離によって実験。
- 3 電極電気化学リアクター (図 1) の建設
- 原子炉の下部に作用電極として ITO 基板を置きます。
- その後、ガラス シリンダー (直径 2 cm)、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) カバーを挿入します。銀/塩化銀 (飽和 KCl) と白金線に挿入原子炉参照とカウンター電極としてそれぞれ。
注: 空気およびソリューションの漏れを防ぐためには、各コンポーネント間にブチルゴム シートを挿入します。 - 10 mM 乳酸を添加した DM の 4.0 mL と 0.5 g/L 酵母エキス電気化学リアクターに追加します。
- 電気化学リアクターからの漏れがないことを確認した後、窒素ガスを電気化学リアクター電気化学リアクター内の嫌気的条件を維持するために 20 分以上に流れ込みます。
注: 他の微生物による汚染を防ぐためには、ガスがフィルターされ、電気化学リアクターに流れる前に、。 - 電気化学リアクターを電気化学測定装置に接続し、0.4 V を適用 (標準的な水素の電極対彼女) ITO 電極に外部の水循環システムを使用して 30 の ° C で電気化学リアクターの温度を維持します。
注: 外部電界の影響を防ぐためには、電気化学リアクターはファラデーケージの中に配置する必要があります。
- (図 1および図 2) s. oneidensis氏 1 セルの電気化学的栽培
- 手順 1.1 600 1.43 の光学密度で得られた懸濁液の細胞密度を調整 10 mM 乳酸と 0.5 g/L 酵母によって補われる DM の nm (外径600) を抽出します。
注: 正しい外径600を得るためには、OD600 ≦ 0.8 細胞懸濁液を調整 1.43 に OD600前に紫外可視分光光度計に適用します。 - 注射器を使って注入ポートを介して電気化学リアクターに細胞懸濁液 0.3 mL を追加: 原子炉で OD600は 0.1 に変更します。
注: 外径600 0.3 mL 細胞懸濁液の添加外径600ソリューション 4.3 ml 4.0 mL 中結果を含む電気化学リアクターに 1.43 を = = 0.1。別のボリュームとその他の原子炉を使用している場合、細胞密度の計算が必要です。 - 25 h ITO 電極に (彼女) と 0.4 V で潜在的なアプリケーションを続行します。
注: ITO 電極上の単分子膜バイオ フィルムの形成、作り出された電流を示す偏差が図 2の 50% 未満の場合ことを確認します。
- 手順 1.1 600 1.43 の光学密度で得られた懸濁液の細胞密度を調整 10 mM 乳酸と 0.5 g/L 酵母によって補われる DM の nm (外径600) を抽出します。
2. 10 mM 乳酸 (図 3) と新鮮な DM 媒体と上澄みの交換
- 潜在的なアプリケーションを停止し、電気化学リアクターをポテンショスタットと水循環システムから外します。
- 10 ミリメートルと新鮮な DM 媒体と上澄みの交換乳酸します。
- 10 mM 乳酸 20 分以上で DM を含む媒体から酸素を取り除くボトルに窒素ガスを流れ。
- ゆっくりと流れる下、注射器を使用して電気化学反応器内培養上清を削除 (図 3 a, b) の窒素ガス。
注: 窒素ガスによる ITO 電極上のバイオ フィルムを破損しないよう、ガスは液体表面上フローする必要があります。 - 注射器 (図 3 c) を使用して 10 mM 乳酸を含む新鮮な DM の 4.0 mL を追加します。
注: ITO 電極上のバイオ フィルムを破損しないよう、電気化学リアクターの壁に沿って媒体をゆっくりと挿入します。濡れているバイオ フィルムを保つためには、上清を除去した後すぐに媒体を追加する必要があります。上清を除去した後の中の最大 1 分の注入は、 s. oneidensis氏 1 のバイオから現在の生産には影響しません。 - 電気化学リアクターの壁に付着した上清のすべてを削除する電気化学リアクターを傾けます。
- 合計で 3 回の手順 2.2.2-2.2.4 を繰り返します。
- ガスの流れを停止し、電気化学リアクターを 303 K で ITO 電極に 0.4 V (彼女) の対を適用するもう一度、ポテンシオスタットに接続
3. EET プロセス (図 4) に KIE を測定する重水素水の添加
- S. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから現在の生産は安定している、急速に増加しませんを確認します。電流が急激に増加、現在安定して ± 5% 増加 10 分以上までを待ちます。
注:4を既に報告されている、他の微生物の系統の混入しない ITO 電極上の単分子膜バイオ フィルムの形成が rdna 塩基配列と ITO 電極上のバイオ フィルムの走査型電子顕微鏡像で確認をしました。EET プロセスによる速度制限の確認、往復の電子メディエーター 100 μ M アントラキノン-1-スルホン酸 (α-AQS) などの追加の効果を監視します。代表結果のセクションを参照してください、詳細については、15を参照します。 - 濃度は 0.5% (v/v) D2O 原子炉のような注射器を使用して電気化学リアクターに無酸素 50% (v/v) D2O の 40 μ L を追加します。
注: D2O 添加によるバイオ フィルムへの損傷を防ぐため、注入 D2O drop-wise。 - 安定し、現在待って、その後 D2O 4.0% (v/v) を追加します。
注: KIE 値 (D2O と H2O の存在下で現在の生産に対する比率) を得るためには、同じ現在の生産における H2O 添加量の効果を確認します。
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Representative Results
(彼女) と 0.4 V で潜在的なアプリケーションの 25 時間後単分子膜バイオ フィルムは ITO ガラス、走査型電子顕微鏡や共焦点顕微鏡4で確認された以前の作用電極に形成されました。単分子膜バイオ フィルムの形成の間にs. oneidensis氏 1 から現在の生産の代表的な時間コースを図 2に示します。現在の生産は現在の間隔で変更される単分子膜バイオ フィルムが均一に形成される場合など偏差図 2の値から 50% 以上を示しません。
(彼女と 0.4 V 代謝過程の速度を最大化し、単分子膜バイオ フィルム (図 3) を洗って 10 mM 乳酸と新鮮な DM と上澄みの交換後安定した陽極電流 (約 10 分で 5% 増) で観察でき) アプリケーション (図 4 a)。陽極電流が急激に増加した場合は、電流が安定するまで待ちます。清交換セクション 2 で説明されている手順は、バイオ フィルムを損傷することが、復興することが発生する可能性が高いです。
図4aに実線 D2O 添加による微生物の現在の変更の代表的なもので。10 の内で現在の微生物が著しく減少した 1.0% (v/v) D2O の追加 s、H2O (図 4 aの点線)15の追加でほとんどない電流の減少を認めながら。同様の傾向は、少なくとも 4 つの独立した実験で再現しました。D2O 現在生産 (図 4 a)150.5% 2.0% (v/v) を明確に示した強い抑制に至る最終濃度で添加の連続。D2o. の付加の後ですぐに電流の減少するため微生物の現在の生産は次第に回復可能性が高い生理的効果19、20KIE を割り当てる必要があります。以前のレポートで D2O KIE15の値を計算するための付加の後の約 10 分で現在の生産を集めました。
2 つのメソッドを使用して、D2O 添加により観測された電流の減少が OM c- 假複合体を介して EET の KIE に起因することを確認した.まず、我々 前後 1 μ M リボフラビン (RF) またはフラビンモノヌクレオチド (FMN) 電気化学リアクターに D2O さらに、 s. oneidensis氏 - 1 EET を調査する使用することができます。S. oneidensis氏 - 1、フラビンは特に OM cの結合による EET プロセスを加速 - 假は数秒で、フラビンは非共有結合因子21,22,として機能するので23. したがって、フラビン添加によるインスタント陽極電流増加は、OM cを介して EET プロセスによって速度制限を示します - 假 (図 5)。KIE の電子メディエーターを往復の効果を確認しながら進める。小型レドックスの分子、例えばアントラキノン-1-スルホン酸 (α AQS)、OM c- 假15を介して直接電子輸送ではなく、電極に微生物の電子輸送チェーンから拡散 EET プロセスを終了,24します。 ここでは、100 μ m α AQS の追加は拡張によって現在の生産よりも 5 倍 (図 4 b)、代謝反応の速度論が高速で EET の率制限ステップの処理を行うことを示します。一貫して、α AQS を介した現在の生産に残った D2O 添加 (図 4 b)、D2O による代謝反応の潜在的な遅延が図 4 a で観測された大規模な KIE を引き起こさないことを示すによる影響を受けない.
組み合わせ OM cと電子輸送の KIE を観察するこれらの 2 つのアプローチ - 假はこのレポートの重要なポイントと、具体的には、他のゲルロボットのバイオ フィルムに適用することができます電子メディエーターを往復します。さらに、一度現在の変更は EET プロセスに割り当てられていることを確認、我々 は OM cの部分的な削除の突然変異の効果を評価できる - 假または OM cに関連付けられているフラビンの陽子に假 - 転送速度で KIE を比較することによって両方の場合の15。FMN の存在下で D2O が追加された OM cバインディング - 假、電流の減少は、FMN、プロトンの運搬経路とそのキネティクス (図に FMN のバインドが変更されることを示すことよりも小さいというように減った4 c)15。
図 1: 本研究で使用される電気化学リアクター 。電気化学セル (、) の建設前に、と建設 (b) 後の写真。0.4 V で電気化学的接種の 25 時間後電気化学リアクターの模式図 (c) vs 彼女。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な現在産s. oneidensis氏-1 ITO 電極の膜バイオ フィルム形成時。矢印は、電気化学リアクターに細胞懸濁液の添加時間を示します。同様の傾向は、少なくとも 5 つの個々 の実験で再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 10 mM 乳酸と新鮮な培地 (DM) に清の交換。液体表面上 (、) 窒素ガスの流れ。(b) 電気化学リアクターからの上清除去。(c) 4.0 mL 新鮮な DM を含む添加 10 mM 乳酸。培地添加後原子炉は、原子炉の壁に付着した上清を除去する傾斜する必要があります。合計で 3 回のこれらのプロシージャ (、-c) を行います。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから現在の生産における D2O 添加効果。(、)、10 mM 乳酸アントラキノン-1-スルホンの追加 100 μ M を含む電気化学系のs. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムの現在の生産対時間 (α- AQS) (b)、または追加の 2 μ Mフラビンモノヌクレオチド (FMN) (c)。同様の傾向は、少なくとも 4 つの個々 の実験で再現しました。矢印は、D2O (実線) または H2O を追加 (点線) の時間を示します。点線の行に対応するデータは、直前の D2O 線データの追加データ ポイントに正規化されました。D2O 電気化学リアクターの濃度が示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 律の評価は、フラビンの添加による s. oneidensis 氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから現在の生産のステップです。S. oneidensis氏-1 10 mM 乳酸 (実線)、1.0 mM 乳酸 (破線) と 0.1 mM 乳酸 (点線) の存在下での単分子膜バイオ フィルムから現在の生産対時間。矢印は、1 μ M でフラビンモノヌクレオチド (FMN) が電気化学リアクターに追加された時点を示します。10 mM 乳酸の存在下で FMN の大幅に増加示す現在の生産cを介して細胞外の電子輸送 (EET)-細菌の外膜に埋め込まれているシトクロム複合体を入力 (OM c- 假) 律です。乳酸少ない電気化学リアクターの集中によって引き起こされる小さい電流向上 FMN また、ことを示す電子供給 OM c上流の代謝反応から - 假は徐々 に EET 率より低くなった。同様の傾向は、少なくとも 2 つの個々 の実験で再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 の全細胞の電気化学的分析タンパク質電気化学と比較していくつかの技術的な利点があります。蛋白質の浄化には、多段階の時間のかかる手続きが必要ですが、本全体セル手法で自己組織化バイオ フィルム形成細胞培養後 1 日は。OM cの安定した相互作用を達成するために - 假と電極、必要がありますのみ殺菌と電極表面のクリーニングOM cを定位しながら、電極上にアタッチ蛋白質4、例えば、 S の oneidensis氏-1 の向きを本質的に整理のため電極の修飾は必要ありません - 同じ方向25假,26,27します対照的に、タンパク質の電気化学反応は敏感に蛋白質の酸化還元サイトと、電極間の距離によって影響を受ける。したがって、浄化された蛋白質は慎重に指向28,29をする必要があります。もっと重要なは、細胞の電気化学的アッセイ直接他の膜蛋白質と相互作用の可能性を持つ脂質膜に埋め込まれた OM c- 假錯体の特徴し、ネイティブのプロトンが反映されますので OMの管理 c- 假 (これは浄化された蛋白質を使用して模倣することは困難では多くの場合)。
ただし、本手法は D2D2O の濃度低下可能性があります代謝過程と成長19; o. 高濃度に関して制限したがって、このプロトコルで未満 4% (v/v) であった D2O 濃度を使用して実験を行った。さらに、微生物における遺伝子発現は、複雑な方法で調整されるため、条件付きの小さな相違点かもしれない微生物表現型と電子輸送の運動論も影響強く。S. oneidensis氏 1 バイオ フィルム; から現在生産中の乳酸濃度の減少特に、したがって、レート制限プロセスを上流の代謝反応にシフトする前に KIE 実験を実施することが重要です。
KIE を正常に取得する最も重要なポイントは、明らかにし、電子輸送 OM c- 假限界を全細胞の電気化学的アッセイによって監視の現在の生産の率の状態を確認することです。このプロトコルでは、EET のレート制限し、微生物の現在の生産を反映していることを確認する方法をについて説明します。我々 は 2 つの方法の組み合わせを導入フラビン追加23、および拡散電子仲介者、例えば、α AQS15 (図 4および図 5) 存在下で D2O 添加による現在の変化の観察。1 つ作れない処理 EET レート制限、最も可能性の高い原因は不完全な形成や単分子膜バイオ フィルム、またはその他の微生物による汚染の物理的な剥離でしょう。走査型電子顕微鏡や共焦点顕微鏡による単分子膜バイオ フィルムの形成を確認することを強くお勧めします。それはバイオ フィルム; を培地交換プロセスに損害可能性が高いしたがって、除去と媒体の注入、ゆっくりう、窒素ガスが液体の表面 (図 3) 上記フローします。メディア コンポーネントおよび測定条件、例えば、10 mM 以上の濃度で乳酸の添加、さらに加速を再検討をお勧めしない場合は均一な単層バイオ処理 EET レート制限、上流の代謝プロセス。これらの考慮事項が重要 EET できる微生物の他の種類にも。EET プロセスが他細菌の緊張の混合物を含む EET できる微生物の種類のレート制限であることを確認する、電子メディエーターが具体的に使えるしたがって、細菌/電極界面の直接電子輸送上のプロトンの運動への影響を調査するための一般的な方法としてこのプロトコルを検討します。限り EET プロセスは律 EET は他の微生物の系統とコンソーシアム、観測されている事を考えると、このプロトコルは嫌気性の鉄の腐食とメタン酸化プロセスで微生物の呼吸だけでなく、その研究に適用されます。微生物燃料電池30,31です。
我々 のシステムも OM cの生化学的解析の KIE 実験用だけでなく、OM cEET のレート制限プロセスにs. oneidensis氏-1 単分子膜バイオ フィルムの - 假を使用できます - 假。たとえば、OM c因子としてバインド フラビンの異なる濃度添加 - 假を許せばフラビン バインド OM c- の形成のための解離定数 (Kd ~ 10 μ M) の電気化学的定量假錯体32,33,34。さらに、私たちの最近の仕事を示したこと OM cを介して逆電子逆流プロセス - 假ことができるカソード現在生産33,34特徴付けられます。それは電子の逆流に関連付けられている陽子インポート OM 全体 chemiosmotic ATP 合成35のためのソースとして提案されています。したがって、それは OM c電子逆流動態上のプロトンの影響を調査する偉大な関心 - 假。
結論として、我々 は重水素を使って OM c- 假生活s. oneidensis氏 1 EET の KIE を調べる技術を開発しました。テクニックを使用することができます - 假と同様 KIE 観測、それは他無k 微生物に適用可能な OM cの特性のため。この方法論が OM c- 假の生体内で直接 EET を調査するための一般的なテクニックをすることができます考えています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品の財政上支えられる補助金・特別推進研究の科学振興費助成番号 24000010、17 H 04969、日本社会からの JP17J02602、米国オフィスの海軍研究のグローバル (N62909-17-1-2038)。保は、日本学術振興会特別研究員、プログラムを通じて日本学術振興会での主要な大学院の学校 (メリット) をサポートします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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