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Developmental Biology

पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रसंस्कृत माउस अंडाशय के कूप ठहराव

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57593
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

Summary

यहां, हम धारावाहिक अनुभाग के बिना युवा चूहों के कल्चरल अंडाशय में रोम यों तो एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । पूरे अंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ऊतक समाशोधन का उपयोग करना, शारीरिक अनुभाग ऑप्टिकल अनुभाग के साथ बदल दिया है । नमूना तैयारी और दृश्यावलोकन का यह तरीका अंग अखंडता को बनाए रखता है और विशिष्ट कोशिकाओं के स्वचालित ठहराव की सुविधा देता है.

Abstract

स्तनधारी प्रजनन जीवविज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान अक्सर अंडाशय और परीक्षण के समग्र स्वास्थ्य का मूल्यांकन शामिल है । विशेष रूप से, महिलाओं में, डिम्बग्रंथि स्वास्थ्य अक्सर visualizing और मात्रा रोम और अंडाणुओं द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । क्योंकि अंडाशय एक अपारदर्शी तीन आयामी ऊतक है, पारंपरिक दृष्टिकोण laboriously की आवश्यकता होती है कई धारावाहिक वर्गों में ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया क्रम में पूरे अंग भर में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए । इसके अलावा, क्योंकि इस विधि द्वारा ठहराव आमतौर पर केवल एक oocyte के अनुमानित व्यास से अलग वर्गों का एक सबसेट स्कोरिंग जोर देता है, यह अशुद्धि से ग्रस्त है । यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है कि बजाय पूरे अंग ऊतक समाशोधन और माउस अंडाशय के धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रोम और अंडाणुओं कल्पना का इस्तेमाल करता है । अधिक पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में, इस प्रोटोकॉल कई कारणों के लिए अंडाशय के भीतर कोशिकाओं visualizing के लिए लाभप्रद है: 1) अंडाशय नमूना तैयारी और प्रसंस्करण भर में बरकरार रहता है; 2) छोटे अंडाशय, जो अनुभाग के लिए मुश्किल हैं, आसानी से जांच की जा सकती है; 3) सेलुलर ठहराव अधिक आसानी से और सही ढंग से हासिल की है; और 4) पूरे अंग छवि ।

Introduction

आदेश में सेलुलर संरचना और स्तनधारी अंडाशय के रूपात्मक सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए, वैज्ञानिकों अक्सर vivo में तेल एंबेडेड अंडाशय के धुंधला immunohistological के बाद प्रयोगों पर भरोसा करते हैं । हाल ही में हालांकि, पूरे अंडाशय अंग संस्कृति एक प्रभावी करने के लिए डिम्बग्रंथि समारोह1,2,3,4 क्योंकि तकनीक बेहतर दृश्य के साथ युग्मित किया जा सकता है और अध्ययन करने के लिए विकल्प साबित हो गया है ठहराव उपकरण । परंपरागत रूप से, डिंबग्रंथि आकृति विज्ञान का विश्लेषण आयल एंबेडेड धारावाहिक वर्गों से तीन आयामी डिम्बग्रंथि वास्तुकला के पुनर्निर्माण पर निर्भर करता है, लेकिन, श्रमसाध्य और समय लेने के लिए, प्रश्नपत्र अनुभागीय तेल एंबेडेड ऊतक होने के अलावा अंग के उचित पुनर्निर्माण की गारंटी नहीं है, और वर्गों अक्सर खो रहे हैं या गलत प्रक्रिया में आदेश दिया.

धारावाहिक अनुभागीकरण के साथ जुड़े तकनीकी चुनौतियों के अलावा, वहाँ भी नियमित रूप से अंडाशय5,6प्रति कूप संख्या मात्रा के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में बदलाव कर रहे हैं । methodological परिवर्तनशीलता वर्तमान में प्रयोग किया जाता है5,7के बीच डिंबग्रंथि आरक्षित के मेटा विश्लेषण । उदाहरण के लिए, विभिंन अनुसंधान लेख से कूप संख्या 10 गुना या एक विशिष्ट तनाव में समान विकास उंर के बीच अधिक से भिंन हो सकते है6। रिपोर्ट कूप ठहराव में इन बड़े मतभेद भ्रम पैदा कर सकते है और पार अध्ययन तुलना बाधा है । प्रयोग, धारावाहिक वर्गों से कूप ठहराव के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एक पूर्व के रोम गिनती वर्गों की संख्या निर्धारित (जैसे, हर पांचवें, दसवें, या अंय खंड) द्वारा किया जाता है । कूप में परिवर्तनशीलता गिनती इस दृष्टिकोण का उपयोग न केवल आवधिकता में जो वर्गों की गणना कर रहे हैं, लेकिन यह भी अनुभाग मोटाई में बदलाव से, और धारावाहिक वर्गों5पैदा करने में तकनीकी अनुभव से उठता है,6। अपनी परिवर्तनशीलता के अलावा, पारंपरिक ऊतक अनुभाग के एक और नुकसान यह है कि युवा जानवरों से छोटे अंडाशय के अनुभाग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है और ऊतक अभिविंयास8पर अत्यधिक निर्भर है ।

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक नियमित रूप से इस्तेमाल किया अंडाशय संस्कृति तकनीक1 लेकिन बहुत पारंपरिक कूप ठहराव पर सुधार के साथ शारीरिक अनुभाग के साथ ऊतक समाशोधन और ऑप्टिकल फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अनुभाग8 ,9. एक यूरिया में (transcranial छिड़काव या ट्रो के लिए आवश्यकता के बिना) ऊतक विसर्जन का उपयोग कर समाशोधन-और सोर्बिटोल-आधारित समाधान (जैसे, तराजू (0)10) immunostaining के साथ संगत साबित कर दिया और की कमी के लिए अनुमति दी इमेजिंग की गहराई से समझौता किए बिना समय समाशोधन । अन्य रिपोर्ट की गई विधियाँ (उदा., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, और ClearT212) या तो अधिक समय लेने वाले हैं या में गहराई ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन नमूने की अनुमति नहीं है । ऑप्टिकल खोदी लाभप्रद है क्योंकि यह कम श्रम गहन है और अंग तीन आयामी वास्तुकला7,8का कहना है । इस दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि नमूनों की तैयारी महंगा रिएजेंट ऊतक स्पष्ट करने की आवश्यकता नहीं है और रिश्तेदार आसानी से आयोजित किया जा सकता है ।

विशेष रूप से, वर्णित प्रोटोकॉल जन्मोत्तर दिवस पांच पर संस्कृतिपूर्ण माउस अंडाशय के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन जन्मोत्तर दिन 0-10 से लेकर अंडाशय पर आयोजित किया गया है । विधि एक अंडाशय संस्कृति प्रणाली है जिसमें ऊतक स्वाभाविक रूप से झिल्ली है जिस पर यह संस्कृति है, अंग हैंडलिंग और हेरफेर की सुविधा के लिए देता है का उपयोग करता है । संस्कृति प्रणाली को 10 दिनों तक के लिए explanted अंडाशय को बनाए रखने और कैसे अलग प्रयोगात्मक स्थितियों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है oocyte अस्तित्व के साथ हस्तक्षेप कर सकते है13। ठहराव प्रक्रिया वर्णित गैर वाणिज्यिक छवि प्रसंस्करण पैकेज फिजी-ImageJ14 का उपयोग किया जाता है और सबसे अधिक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, ठहराव के लिए इस्तेमाल किया छवियों वैज्ञानिक समुदाय के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध कराया जा सकता है, इस प्रकार भविष्य मेटा विश्लेषण के लिए अनुमति ।

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Protocol

कॉर्नेल विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) सभी तरीकों को मंजूरी दे दी है यहां वर्णित है, प्रोटोकॉल 2004-0038 के तहत JCS ।

1. उपकरणों और संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. 10% ब्लीच के साथ स्वच्छ कार्य क्षेत्र साफ है और ब्लीच के लिए काम के क्षेत्र की सतह पर रहने के लिए अनुमति देने के ंयूनतम 5 मिनट । 5 मिनट के बाद, साफ कागज तौलिए और ७०% इथेनॉल (ेतोः) के साथ अतिरिक्त ब्लीच निकालें । विदारक माइक्रोस्कोप को ७०% ेतोः के साथ अच्छी तरह साफ कर लें ।
    नोट: अंग संस्कृतियों के प्रदूषित होने से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि कार्य क्षेत्र कम अर्द्ध-बाँझ हो.
  2. एक कागज तौलिया के साथ साफ संदंश और कैंची लपेटें उपयोग के समय तक ७०% ेतोः के साथ भीगा ।
    नोट: आदर्श विच्छेदन उपकरण अंडाशय के आयु/आकार के अनुसार भिन्न हो सकते हैं । सबसे अच्छा परिणाम एक तेज सूक्ष्म विदारक कैंची, दो ठीक टिप संदंश (या तो संख्या 5 या ५५) और एक सूक्ष्म विदारक आईरिस कैंची का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं ।
  3. एक शंकु ट्यूब में, अंडाशय संस्कृति मीडिया के ५० मिलीलीटर और एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्म करने के लिए ।
    1. अंडाशय संस्कृति मध्यम4बनाने के लिए, अनुपूरक 1x ंयूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 मिमी (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, ०.२५ µ g/ml Amphotericin बी (जैसे, मेम की ४५ मिलीलीटर, गर्मी के 5 मिलीलीटर निष्क्रिय FBS, HEPES के १.२५ मिलीलीटर, और 100x स्टॉक की ०.५ मिलीलीटर पेनिसिलिन, streptomycin, और Amphotericin बी) ।
  4. अंडाशय संस्कृति से पहले प्लेटें और आवेषण तैयार करते हैं ।
    1. एक ऊतक संस्कृति हुड में, एक ३५ mm ऊतक संस्कृति की थाली के लिए अंडाशय संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. संस्कृति माध्यम से पूर्व सोख डालें झिल्ली । पर्याप्त मीडिया जोड़ें, आमतौर पर के बारे में ०.५५ मिलीलीटर अच्छी तरह से, 24 अच्छी वाहक ऊतक संस्कृति की थाली के लिए, और एक सेल संस्कृति डालने के लिए अच्छी तरह से जगह । सुनिश्चित करें कि insert की झिल्ली मीडिया को छूता है ।
    3. प्रयोग में अंडाशय की अपेक्षित संख्या के अनुसार सेल संस्कृति आवेषण के साथ ३५ मिमी प्लेटों और कुओं की संख्या तैयार करें । ३५ mm प्लेट्स प्लेस संस्कृति मीडिया और 24 अच्छी वाहक संस्कृति मीडिया और एक ३७ ° c, 5% CO2, और वायुमंडलीय ओ2 मशीन में आवेषण युक्त प्लेट के 1 मिलीलीटर युक्त ।
  5. विच्छेदन क्षेत्र के बगल में एक गर्म थाली की व्यवस्था और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है । एक ३७ ° c रखें, 5% सह2 और वायुमंडलीय हे2 मशीन विच्छेदन कक्ष के करीब है ।

2. अंडाशय विच्छेदन और अंग संस्कृति

नोट: अंडाशय के रूप में लंबे समय के रूप में गैर आदर्श तापमान के लिए जोखिम कम है कमरे के तापमान पर विच्छेदित किया जा सकता है ।

  1. Euthanize प्रसव के बाद दिन में मादा चूहों को decapitation, एक समय में एक ।
    नोट: इच्छामृत्यु की सुविधा जहां अनुसंधान किया जा रहा है पर मौजूद IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए ।
  2. ७०% ेतोः के साथ पशु स्प्रे । विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे सूखे कागज तौलिया के ऊपर पशु रखें । एक ३५ मिमी ऊतक संस्कृति अंडाशय संस्कृति मीडिया विच्छेदन माइक्रोस्कोप के करीब युक्त पकवान प्लेस ।
  3. संदंश या एक सूक्ष्म विच्छेदन आईरिस कैंची के साथ, पशुओं की त्वचा के माध्यम से एक चीरा और उदर गुहा में, सावधानी आंतों में कटौती नहीं का उपयोग कर । उदर गुहा से बाहर आंतों पुश और अंडाशय का पता लगाने । अंडाशय निकालें और उंहें ३५ मिमी ऊतक संस्कृति संस्कृति मीडिया युक्त पकवान में जगह है ।
  4. एक बार अंडाशय जानवर से विच्छेदित किया गया है, के लिए बेहतर अंडाशय और किसी भी संलग्न ऊतक कल्पना करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप की आवर्धन बढ़ाएँ । साफ ठीक टिप संदंश के साथ, बर्सा और फैटी ऊतक के रूप में सभी गैर डिम्बग्रंथि ऊतक, निकालें । संलग्न गैर डिम्बग्रंथि ऊतक निकालते समय अंडाशय बरकरार रखने के लिए सावधान रहें ।
  5. एक बार अंडाशय अलग कर रहे हैं, वाहक 24-अच्छी तरह से प्लेट के पूर्व लथपथ सेल संस्कृति आवेषण में जोड़ी जगह (1.4.2 और 1.4.3 चरणों को देखें) और यह सुनिश्चित करें कि यह अंग नम रखने के लिए पर्याप्त है के लिए माध्यम की मात्रा को समायोजित (पूरी तरह से बिना इसे उपविलयन) ।
    चेतावनी: सावधान रहो करने के लिए सेल संस्कृति डालने की झिल्ली में छेद प्रहार नहीं जब अंडाशय स्थानांतरित ।
  6. एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2में explanted अंगों प्लेस, और वायुमंडलीय हे2 मशीन ।
  7. दोहराएं चरण २.१-२.६ जब तक प्रत्येक जानवर के अंडाशय और विदारक संस्कृति के साथ 24-खैर प्लेट के सेल कल्चर डालने पर रखा जाता है ।
  8. एक ३७ ° c पानी स्नान से गर्म अंडाशय मीडिया aliquots का उपयोग कर प्रत्येक 2 दिन, अंडाशय संस्कृति मध्यम बदलें और वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदु पर प्रोटोकॉल के भाग 3 के लिए आगे बढ़ें ।

3. ऊतक निर्धारण

  1. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, 1x फास्फेट में 4% paraformaldehyde (पीएफए) बफर खारा (पंजाब) तैयार (जैसे, 16% पीएफए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड के 2 एमएल 1x पंजाबियों के 6 मिलीलीटर में जोड़ें) ।
    चेतावनी: पीएफए एक खतरनाक पदार्थ है और एक रासायनिक डाकू के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  2. संस्कृति डालने से ऊतक को हटाने के बिना, नए सिरे से तैयार 4% पीएफए समाधान के साथ ऊतक को कवर करके, कल्चरल अंडाशय को ठीक करें । प्लास्टिक चिपकने वाले के साथ प्लेट के किनारों सील (वाष्पीकरण से बचने के लिए) और 4 ° c रातोंरात पर नमूने जगह है ।
    ध्यान दें: आदेश में हैंडलिंग और ऊतक अखंडता की सुविधा के लिए, पूरे प्रक्रिया भर में सेल संस्कृति डालने से अंडाशय को बदलने से बचें । कल्चरल अंडाशय डालने की सतह से जुड़ी हानिकारक या अंग खोने के बिना निपटने के लिए लाभप्रद हैं ।
  3. ७०% के साथ ेतोः ऊतक कुल्ला और या तो ४.१ कदम आगे बढ़ना या यह 4 डिग्री सेल्सियस पर ७०% ेतोः से भरा शीशियों में दुकान आगे प्रसंस्करण तक ।
    नोट: यदि ऊतक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त endogenously का उपयोग कर, ७०% ेतोः के साथ नमूने भंडारण बहुत संकेत कम हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, ऊतक और कुल्ला किया जा सकता है ०.२% सोडियम azide (3) के साथ पंजाब में संग्रहीत । नान3 है, तथापि, अत्यधिक विषाक्त और एक गंभीर साँस लेना खतरा बन गया है. धुएं डाकू में शेयर समाधान बनाओ और एक प्रयोगशाला कोट और nitrile दस्ताने के रूप में उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहने हुए संभाल ।

4. पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. permeabilization कदम ४.३ से पहले 4 एच की एक ंयूनतम के लिए RT पर 1x पंजाब में निश्चित ऊतक प्लेस ।
  2. permeabilization समाधान तैयार है और समाधान अवरुद्ध ।
    1. वर्णित permeabilization समाधान तैयार करें । 1x पंजाबियों के लिए, जोड़ें ०.२% polyvinyl अल्कोहल (PVA), ०.१% सोडियम borohydride (नभ4) समाधान (से 12 wt.% में 14 एम सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) समाधान), और १.५% पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-octylphenyl ईथर (गैर ईओण surfactant डिटर्जेंट) । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, 10x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर, PVA के ०.१ जी, नभ4के ५० µ एल जोड़ें, और गैर-ईओण surfactant डिटर्जेंट के ७५० µ एल, तो ५० मिलीलीटर करने के लिए ultrapure पानी जोड़ने और कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से आंदोलन जब तक मिश्रण पूरी प्रकार से समाधान में है ।
    2. बताए गए अनुसार ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें । 1x पंजाबियों के लिए, जोड़ें ०.१% गैर ईओण surfactant डिटर्जेंट, 2.5 m glycine pH ७.४ का ०.१५%, 10% सामान्य बकरी सीरम, 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), ०.२% नण य3, १०० यूनिट्स/ml पेनिसिलिन, १०० µ g/ml streptomycin, और ०.२५ µ g/ml Amphotericin B. का स्टॉक समाधान तैयार करें २.५ मीटर glycine को ultrapure पानी में glycine के ९३.८ ग्राम को एक ५०० मिलीलीटर अंतिम आयतन (pH ७.४) से भंग करके और 10% नण य का एक शेयर समाधान के द्वारा 5 माम को ultrapure जल के ५० मिलीलीटर में भंग करके 1; फिर, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर, गैर के ५० µ एल-ईओण surfactant डिटर्जेंट, ७५० µ glycine शेयर समाधान के एल, बकरी सीरम के 5 मिलीलीटर, BSA के १.५ ग्राम जोड़ने के द्वारा अवरुद्ध समाधान तैयार, 1 की मिलीलीटर की एक एमएल3 स्टॉक समाधान , और पेनिसिलिन, streptomycin, और Amphotericin बी के 100x स्टॉक की ०.५ मि. ५० मिलीलीटर और सिरिंज फ़िल्टर अंतिम समाधान की एक अंतिम मात्रा तक ultrapure पानी जोड़ें ।
  3. शीशी से 1x पंजाबियों को निकालें और छोड़ें, और फिर अंडाशय को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त permeabilization समाधान जोड़ें । 4 एच के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर (जैसे, nutator) पर permeabilization समाधान में नमूना प्लेस ।
    नोट: मशीन समय अंग मोटाई के अनुसार भिन्न हो सकते हैं ।
  4. अंडाशय को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त अवरुद्ध समाधान के साथ permeabilization समाधान बदलें । प्लास्टिक चिपकने के साथ शीशी सील और ऊतक एक कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर 12 घंटे की एक ंयूनतम के लिए मशीन छोड़ दें ।
  5. निर्माता के डेटापत्रक के अनुसार समाधान अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
    नोट: ध्यान दें कि नहीं सभी एंटीबॉडी समाशोधन एजेंट के साथ संगत कर रहे हैं । प्रति नमूना औसत मात्रा की जरूरत लगभग ७५० µ एल है ।
    1. oocyte ठहराव के लिए, TAp63 (नाभिकीय oocyte मार्कर) और MVH (cytoplasmic रोगाणु कोशिका मार्कर) का उपयोग करें ।
      नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी माउस विरोधी p63 और खरगोश विरोधी MVH हैं) । प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान 2x या अधिक इस्तेमाल किया जा सकता है अगर दाग प्रोटोकॉल के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और ठीक से बैक्टीरियल विकास से बचने के लिए संभाला ।
  6. एक 24 अच्छी तरह से थाली में ऊतक युक्त डालने और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के बारे में ७५० µ एल जोड़ने रखें । सुनिश्चित करें कि अंडाशय पूरी तरह से जलमग्न हैं । प्लास्टिक चिपकने वाला के साथ प्लेट सील वाष्पीकरण को कम करने और एक कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर 4 दिनों के लिए गर्मी छोड़ने ऊतक ।
  7. वॉशिंग सॉल्यूशन तैयार करें ।
    1. धुलाई समाधान के रूप में वर्णित तैयार । 1x पंजाबियों बनाओ, ०.२% PVA और ०.१५% गैर ईओण surfactant डिटर्जेंट जोड़ें । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, 10x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर, PVA के ०.१ ग्राम, ७५ µ एल के गैर-ईओण surfactant डिटर्जेंट और ultrapure पानी ५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक जोड़ें ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने निकालें और धुलाई समाधान की एक उदार राशि जोड़ें । हमेशा अंडाशय को जलमग्न करने के लिए सुनिश्चित करें । अंडाशय कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर रात भर समाधान में भिगोने की अनुमति दें ।
  9. धोने समाधान की जगह और 2 ज या अधिक के लिए कक्षीय शेखर पर मशीन ।
  10. चरण ४.९ एक अतिरिक्त समय दोहराएं ।
  11. समाधान अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने तैयार करते हैं ।
    नोट: माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी विरोधी माउस ४८८ फ्लोरोसेंट डाई बकरी में उठाया और विरोधी खरगोश ५९४ फ्लोरोसेंट डाई बकरी में उठाया । चरण ४.५ देखें । प्रति नमूना की जरूरत औसत मात्रा के लिए ।
  12. अंडाशय से धोने समाधान निकालें और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें । प्रकाश से नमूनों की रक्षा (एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटो प्लेट) और प्लास्टिक चिपकने के साथ प्लेट सील वाष्पीकरण को कम करने के लिए । 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर पर मशीन नमूने ।
    नोट: सभी क्रमिक मशीन चरणों के दौरान एल्यूमीनियम पंनी का उपयोग कर प्रकाश से नमूनों की रक्षा जारी रखें ।
  13. नमूनों से द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और धुलाई समाधान जोड़ें । 8 एच के लिए एक कक्षीय शेखर पर मशीन
    नोट: यदि 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला करना वांछित है, पहले धो चरण (~ 8 एच मशीन) के लिए DAPI के ५० एनजी/
  14. एक रात धोने के लिए धोने समाधान बदलें ।
  15. समाशोधन समाधान तैयार करते समय (अनुभाग 5 देखें), ताजा समाधान के साथ रात भर धोने समाधान की जगह और कमरे के तापमान पर कक्षीय शेखर पर नमूने रखना ।

5. अंडाशय समाशोधन और इमेजिंग

  1. तैयार तराजू (0) समाशोधन समाधान ।
    1. तैयार तराजू (0) समाशोधन समाधान10 दिए गए अनुपात में रिएजेंट जोड़कर: ४०% D-(-) सोर्बिटोल (w/v), 10% ग्लिसरॉल, ४.३ M यूरिया, और 20% dimethyl sulfoxide (DMSO), pH ८.१ (उदा. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, २.५ मिलीलीटर ग्लिसरॉल, सोर्बिटोल के 10 ग्राम जोड़ें , DMSO के 5 मिलीलीटर, और 25 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 9 मीटर यूरिया की 12 मिलीलीटर । का उपयोग करने से पहले 30 मिनट और degas के लिए ५० ° c पर उलटा द्वारा मिश्रण समाधान.)
  2. धोने समाधान निकालें और समाधान समाशोधन में नमूनों जलमग्न । बेहतर परिणाम के लिए कक्षीय शेखर पर नमूने बनाए रखें ।
  3. समाशोधन समाधान 2x दैनिक बदलें जब तक ऊतक पारदर्शी हो जाता है (लगभग 2 दिन) ।
  4. एक बार ऊतक को मंजूरी दे दी है, ध्यान से डालने के एक ठीक टिप स्केलपेल के साथ संस्कृतिपूर्ण अंडाशय युक्त झिल्ली को हटाने और एक गिलास स्लाइड पर नमूना रखने से इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करते हैं ।
  5. ऑप्टिकल अनुभाग में सक्षम एक खुर्दबीन पर नमूनों इमेजिंग करने के लिए आगे बढ़ें ।

6. Oocyte ठहराव

नोट: कई अलग कंप्यूटर प्रोग्राम है कि कोशिकाओं को यों तो कर रहे है कर रहे हैं । नीचे वर्णित गैर वाणिज्यिक छवि प्रसंस्करण पैकेज, फिजी-ImageJ14का उपयोग ठहराव oocyte के लिए एक प्रोटोकॉल है ।

  1. (DAPI चैनल के बिना) ब्याज की विशिष्ट सेलुलर मार्कर के लिए Z-स्टैक छवि श्रृंखला के एक चपटा अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करना, छवि एक काले और सफेद 8 बिट छवि में छवि ड्रॉप-डाउन में प्रकार के तहत परिवर्तित मेनू.
  2. छवि ड्रॉप-डाउन मेनू के अंतर्गत, समायोजित करें टैब को हाइलाइट कर दें और फिर थ्रेशोल्डचुनें ।
  3. प्रत्येक व्यक्ति oocyte की सबसे अच्छी पहचान करने वाले स्तर को मैन्युअल रूप से थ्रेशोल्ड समायोजित करें. स्तर निर्धारित होने के बाद, श्वेत और श्याम छवि जेनरेट करने के लिए लागू करें एक बार पूर्ण होने पर, अंडाकार या मुक्तहस्त चिह्न का उपयोग करके delineating का नमूना बढ़ाता है ।
    नोट: फिजी-ImageJ के लिए अलग विकल्प है ठीक धुन छवि है कि कण ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । उदाहरण के लिए, प्रक्रिया में । द्विआधारी टैब, वहां विभिंन विकल्प है कि क्या गिना जाएगा का पता लगाने में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 4में, बेहतर individualize कूप के लिए इस्तेमाल विकल्प घिसगया था, छेद को भरनेके बाद, और अंत में वाटरशेड।
  4. विश्लेषण ड्रॉप-डाउन मेनू के अंतर्गत, कणों का विश्लेषणकरें चुनें । इच्छित रिज़ॉल्यूशन के अनुसार पैरामीटर्स सेट करें ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में अंडाशय के विच्छेदन के बाद 6 प्रमुख चरण शामिल हैं, जैसा चित्र 1में उल्लिखित है । चित्र 2 , चित्र 3 , चित्र 4 इस प्रोटोकॉल, जो अंडाशय और पूरे ऊतक oocyte ठहराव फिजी-ImageJ का उपयोग करने के लिए ऊतक समाशोधन के अनुकूलन शामिल की सबसे उपंयास सुविधाओं पर प्रकाश डाला । चित्र 2a एक अनकल्चर्ड 5-दिन जन्मोत्तर निश्चित अंडाशय के पहले (बाएँ) और 1 h के बाद (दाएँ) अंडाशय के समाशोधन समाधान जोड़ने के चित्रों को दिखाता है. अंडाशय समाशोधन समाधान में जलमग्न होने के मिनट के भीतर पारदर्शी बनने के लिए शुरू हो जाएगा । एक बार मंजूरी दे दी, चित्रा 2a में छवि एक की तरह छोटे अंडाशय हानिकारक बिना संभाल करने के लिए मुश्किल हो । इसलिए, कल्चरल explanted अंडाशय के साथ काम करना लाभप्रद है क्योंकि वे सम्मिलित झिल्ली की छिद्रित सतह से जुड़ जाते हैं जिस पर वे कल्चरल होते हैं. संमिलित झिल्ली के लिए अंडाशय के अनुलग्नक प्रयोगकर्ता के बजाय अंडाशय ही (चित्रा 2 बी और चित्रा 3) की झिल्ली डालने को संभालने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, अंडाशय करीब निकटता में प्रसंस्कृत फ्यूज और आंकड़ा बी से पहले से जुड़े अंडाशय संलग्न दिखाता है (बाएं) और समाशोधन के बाद (सही) hematoxylin दाग नमूने पर ।

समाशोधन के बिना संस्कृतिपूर्ण अंडाशय के ऑप्टिकल अनुभाग प्रदर्शन संभव है; हालांकि, कोशिकाओं के ऊतकों के भीतर गहरी एक संकेत है कि पृष्ठभूमि से अंतर करने के लिए मुश्किल है और स्पष्ट संकेत के इस कमी उचित oocyte ठहराव (चित्रा 3) में बाधा उत्पंन करता है । 3 चित्रके विपरीत, चित्र बी एक को मंजूरी दे दी नमूना है जिसमें पूरे अंग भर में oocyte ठहराव संभव है की एक प्रतिनिधि छवि है । चित्र बी दर्शाता है कि पूरे अंग इमेजिंग की मंजूरी दी प्रसंस्कृत अंडाशय के ऊतकों और छवियों के भीतर गहरी संकेत की महत्वपूर्ण हानि के बिना आयोजित किया जा सकता है (चित्र बी) के रूप में दिखाया गया है आसानी से quantified जा सकता है । इस तरह के नमूनों में अंडाणुओं को बढ़ाता है के लिए एक दृष्टिकोण एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में Z-स्टैक ऑप्टिकल अनुभागों की श्रृंखला को परिवर्तित करने और फिर आगे एक छवि प्रसंस्करण पैकेज के साथ फ़ाइल प्रसंस्करण द्वारा है । आरेख 4 और पूरक आकृति 1 फिजी-ImageJ का उपयोग करके चित्र 3 में अंडाणुओं की संख्या को बढ़ाता हुआ चरणों को हाइलाइट करें । पूरक तालिका 1 में फिजी-ImageJ का कण (oocyte) ठहराव शामिल होता है । इस विधि का उपयोग कर कणों की ठहराव भी oocyte आकार के आधार पर अलग कूप के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, क्योंकि दोनों कणों की संख्या और प्रत्येक कण के इसी क्षेत्र पर जानकारी सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की है और करने के लिए प्रदान की उपयोगकर्ता.

Figure 1
चित्र 1: संपूर्ण प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. अंडाशय के विच्छेदन के साथ शुरू प्रोटोकॉल का दृश्य सारांश (1), अंडाशय संस्कृति के बाद (2), 4% पीएफए (3) के साथ ऊतक निर्धारण, immunostaining विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग (4), डीप इमेजिंग के लिए ऊतक समाशोधन (5), ऑप्टिकल खंड एक का उपयोग कर प्राप्त करने फोकल माइक्रोस्कोप (6) और oocyte ठहराव (7) के साथ समाप्त । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: संयुक्त राष्ट्र के बीच ऊतक अस्पष्टता में अंतर साफ़ और अंडाशय को मंजूरी दे दी । (बाएं) और के बारे में 1 ज (सही) के हल्के समाशोधन के बाद समाशोधन के बिना एक जन्मोत्तर दिन पांच पिल्ला से (क) अंडाशय । (ख) एकाधिक अंडाशय सात दिनों के लिए एक दूसरे के करीब निकटता में संस्कृति । प्रत्येक नमूने के दो विभिंन आवर्धन दिखाए जाते हैं । सबसे बाएँ छवियों समाशोधन के बिना कर रहे हैं और rightmost छवियों समाशोधन के साथ कर रहे हैं. अंडाशय संस्कृति डालने की झिल्ली को देते है और बेहतर संभाला जा सकता है अगर प्रोटोकॉल भर में संलग्न रखा जाएगा । आदेश में सफेद प्रकाश का उपयोग इमेजिंग के लिए ऊतक के विपरीत में सुधार करने के लिए, अंडाशय hematoxylin में 5 मिनट के लिए निर्धारण के बाद जलमग्न थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: संयुक्त राष्ट्र के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग साफ़ और अंडाशय को मंजूरी दे दी । जन्मोत्तर दिन से अंडाशय 5 पिल्ले 7 दिनों के लिए प्रसंस्कृत थे और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग प्रोटोकॉल वर्णित के अनुसार दाग । लाल रंग में दिखाया माउस वासा homolog (MVH) के साथ लेबल कोशिकाओं को रोगाणु कोशिकाओं की पहचान और हरे रंग में परमाणु oocyte विशिष्ट मार्कर, p63 के साथ लेबल कोशिकाओं रहे हैं । DAPI, नीले रंग में, सभी कक्ष नाभिक लेबल करने के लिए उपयोग किया गया था । (क) समाशोधन के बिना अंडाशय की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि । (ख) समाशोधन के साथ अंडाशय की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: फिजी-ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अंडाणुओं को कैसे बढ़ाता है, इसके लिए विज़ुअल कार्यप्रवाह. आदेश में डेटा विश्लेषण की सुविधा के लिए, फोकल विमानों से प्राप्त छवियों को एक 3d छवि के बजाय एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के लिए कम किया जा सकता है । अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के साथ, उपयोगकर्ता लक्ष्य कणों स्पष्ट हो कि इस तरह से छवि दहलीज मापदंडों को परिभाषित कर सकते हैं । एक बार सरलीकृत छवि प्राप्त की है, सॉफ्टवेयर अंडाणुओं गिनती के लिए प्रयोग किया जाता है । समीक्षकों की जांच छवियों जबकि मानकों की स्थापना महत्वपूर्ण है । यह आंकड़ा कैसे कण/oocyte थ्रेशोल्ड सेट किया जा सकता का एक उदाहरण दिखाता है । प्रत्येक छवि के ऊपर पाठ को फिजी में उस छवि को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर पर प्रकाश डाला गया-ImageJ । सॉफ्टवेयर कणों के क्षेत्र मापन के साथ एक तालिका उत्पन्न करता है ( पूरक तालिका 1देखें). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्र 1: फिजी-ImageJ सॉफ़्टवेयर (कम आवर्धन) का उपयोग करके अंडाणुओं को कैसे बढ़ाता है, इसके लिए विज़ुअल कार्यप्रवाह. यह आंकड़ा करीब निकटता में दो अंडाशय के लिए oocyte ठहराव दिखाता है । प्रदर्शन किए गए चरण आरेख 4के समान हैं । २,४३६ कणों/कूप सॉफ्टवेयर द्वारा गिना गया । सॉफ़्टवेयर से प्राप्त ठहराव डेटा पूरक तालिका 1में पाया जा सकता है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: फिजी-ImageJ द्वारा परिकलित कूप ठहराव. इस तालिका में पूरक आरेख 1में छवि से जेनरेट की गई गणना के रोम और संगत क्षेत्र की सूची होती है । ठहराव के लिए उपयोग किया गया कण आकार 10 µm2-इन्फिनिटी से सेट किया गया था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

स्तनधारी प्रजनन के अध्ययन का उपयोग करने और विशेष कोशिकाओं है कि नियमित रूप से सेल संस्कृति के लिए उत्तरदाई नहीं है बढ़ाता की आवश्यकता है । हालांकि, पूर्व vivo संस्कृति प्रणालियों अंडाशय और कूप व्यवहार्यता को बनाए रखने में प्रभावी रहे हैं1,15. अंडाशय संस्कृति के दौरान, ऊतक प्रसार के माध्यम से पोषक तत्वों के आदान प्रदान के लिए एक बड़ा सतह क्षेत्र की आवश्यकता है । इसलिए, 5 दिन पुराने माउस अंडाशय आकार और अंग संस्कृति के लिए आकार में आदर्श होते हैं । इस प्रोटोकॉल को संस्कृति में सात दिनों के लिए बनाए रखा अंडाशय के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन अंडाशय संस्कृति लंबाई विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न के अनुसार समायोजित किया जा सकता है1,4. तुलनीय परिणाम के रूप में छोटे रूप में तीन दिनों के लिए और के रूप में दस दिनों के रूप में (नहीं दिखाया डेटा), लेकिन अंडाशय से दस दिनों में बड़े है और संस्कृति के रूप में प्रभावी नहीं हो सकता है, इस प्रकार प्रोटोकॉल की एक सीमा पर प्रकाश डाला अंडाशय में हासिल किया गया है ।

यदि अंडाशय के पूर्व vivo संवर्धन की जरूरत नहीं है, यह ठीक करने के लिए संभव है और वर्णित प्रोटोकॉल के साथ पुराने अंडाशय दाग, हालांकि संशोधनों के लिए बड़ा ऊतक आकार9,16को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । दाग प्रोटोकॉल वर्णित अंग में एंटीबॉडी के निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर करता है, जो इंगित करता है कि यह संभव हो सकता है या तो लंबे समय एंटीबॉडी के साथ बड़ा अंडाशय दाग के लिए या कुछ छोटे टुकड़ों में ऊतक विभाजन है कि कर सकते है इमेजिंग के बाद खंगाला जा । तराजू में यूरिया और सोर्बिटोल का उपयोग (0) समाशोधन एजेंट नवजात संस्कृति अंडाशय के लिए प्रभावी साबित कर दिया क्योंकि यह यूरिया और ग्लिसरॉल (ScaleA2) के साथ एजेंटों समाशोधन के लिए सूचना दी उन से एक छोटी गर्मी की अवधि की आवश्यकता8,10 . इसके अलावा, permeabilization समाधान में सोडियम borohydride (नभ4) के एक कम एकाग्रता का उपयोग पृष्ठभूमि शोर में कमी आई, और, एक साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों की अब गर्मी के साथ, सुविधा ऊतक के भीतर गहरा धुंधला । इसके अतिरिक्त, permeabilization और वाशिंग समाधान में PVA का उपयोग नकली कणों को टिशू17,18से चिपकने से रोकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, संस्कृतिपूर्ण स्वस्थ अंडाशय डालने झिल्ली को देते हैं, जबकि अस्वस्थ अंडाशय यह से निर्धारण और हैंडलिंग पर अलग हो सकता है । संदंश के साथ ढीला ऊतक हैंडलिंग अंडाशय और संभावना समझौता इमेजिंग नुकसान होगा । वैकल्पिक रूप से, ढीले ऊतक 5% agarose प्लग में एंबेड किया जा सकता है या स्थानांतरण पिपेट के साथ संभाला के रूप में टिप खोलने के रूप में लंबे समय के लिए पर्याप्त यह नुकसान नहीं चौड़ा है । immunostaining के संबंध में, प्राथमिक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल लोगों के अलावा अंय एंटीबॉडी अलग प्रदर्शन कर सकते है और permeabilization और गर्मी चरणों में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।

अंत में, प्रोटोकॉल के रूप में पारंपरिक तेल एंबेडेड धारावाहिक वर्गों या अंय पहले वर्णित volumetric पूरे माउंट छवियों से रोम के ठहराव की तुलना में युवा अंडाशय से रोम बढ़ाता की दिशा में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का वर्णन 5 , 9 , 16. शोधकर्ता की आवश्यकताओं पर निर्भर करते हुए, प्रोटोकॉल में वर्णित oocyte ठहराव के लिए प्रक्रिया में भी तोंसिल्लितिस के विकास के विभिंन चरणों का इस्तेमाल किया जा सकता है19। सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन कण क्षेत्र कोशिका व्यास का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस प्रकार फुफ्फुसीय अवस्था का अनुमान है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उपयोगी सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए कॉर्नेल BRC इमेजिंग और एंड्रयू Recknagel से रेबेका विलियंस और Johanna देला Cruz धंयवाद । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान S10-OD018516 (कॉर्नेल की इमेजिंग सुविधा के लिए), T32HD057854 को J.C.B. और R01-GM45415 को J.C.S. करने के लिए समर्थन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points Roboz RS-5912 Micro dissecting scissor
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 Integra Miltex 17-305X Fine tip forceps
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points Integra Miltex 18-1618 Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor
1X Minimal Essential Media (MEM) ThermoFisher Scientific 11090-081
Fetal Bovine Serium Corning 35011CV
HEPES (1M) Gibco 15630080
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062 Used in Step 1.3.1
35mm Tissue Culture Treated Dish Corning 430165
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts ThermoFisher Scientific 141006 Pore size: 8μm
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 16% solution
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 10010023
Nutator mixer GyroTwister™ Labnet S1000-A-B three dimensional shaker
Normal Goat Serum VWR 103219-578
Bovine Serum Albumen (BSA) VWR 97061-416
Sodium Azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002-25G
Sodium borohydride solution (NaBH4) Sigma-Aldrich 452904-25ML Use the solution, rather than the tablet or powder form 
Polyvinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136-250G Cold water soluble
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich 93443-100ML polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
Syringe filters ThermoFisher Scientific 725-2520 25mm
10mL Syringes BD 309695
Mouse anti-p63 antibody (4A4) Biocare Medical CM 163A Dilution 1:500
Rabbit anti-MVH antibody Abcam ab13840 Dilution 1:600
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 ThermoFisher Scientific A-11032 Dilution 1:1000
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 ThermoFisher Scientific A-11034 Dilution 1:1000
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  ThermoFisher Scientific 62248
D-(-)sorbitol  Sigma-Aldrich 240850-100G
Glycerol Sigma-Aldrich G9012-100ML
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-5X10ML
FIJI-ImageJ Image processing software
Disposable plastic transfer pipettes VWR 414044-034

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References

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Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries. J. Vis. Exp. (135), e57593, doi:10.3791/57593 (2018).

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