Summary
Здесь мы представляем протокол для количественного определения фолликулов в яичниках культивированный молодых мышей без последовательного секционирование. Используя весь орган иммунофлюоресценции и очистки ткани, физические секционирование заменяется оптических секционирование. Этот метод пробоподготовки и визуализации обеспечивает целостность орган и облегчает автоматизированного количественного определения конкретных клеток.
Abstract
Исследования в области репродуктивной биологии млекопитающих часто включает в себя оценку общего состояния здоровья яичников и яичек. В частности у самок, яичников фитнес часто оценивается визуализации и количественного определения фолликулов и яйцеклеток. Потому что яичник является непрозрачным трехмерные ткани, традиционные подходы требуют, кропотливо нарезка ткани в многочисленных последовательных секций для того, чтобы визуализировать клетки на протяжении всего органа. Кроме того потому что количественную оценку этим методом обычно влечет за собой, забив только подмножество разделов, разделенных приблизительный диаметр ооцитов, он подвержен неточность. Здесь Протокол описан, вместо этого использует весь орган ткани клиринга и иммунофлюоресценции пятнать мыши яичников для визуализации фолликулов и яйцеклеток. По сравнению с более традиционными подходами, этот протокол является выгодным для визуализации ячеек в яичнике по многим причинам: 1) завязи остается неизменным на протяжении пробоподготовки и обработки; 2) небольшой яичников, которые трудно секции, может рассматриваться с легкостью; 3) сотовых количественной достигается более легко и точно; и 4) весь орган воспроизведен образ.
Introduction
С целью изучения клеточного состава и морфологические особенности млекопитающих яичников, ученые часто полагаются на в естественных условиях экспериментов следуют иммуногистохимического окрашивания парафина встроенных яичников. Более недавно, хотя, весь яичник органной культуры оказалась эффективной альтернативой для изучения функции яичников1,2,3,4 , потому что техника может использоваться в сочетании с лучшей визуализации и инструменты количественной оценки. Традиционно анализ морфологии яичников зависит от реконструкции трехмерной яичников архитектуры из парафина встроенных последовательных секций, но, являясь трудоемким и много времени, последовательно секционирование встроенных парафин ткани не гарантирует надлежащего реконструкции органа, и разделы часто теряются или неправильно заказаны в процессе.
Помимо технических проблем, связанных с последовательным секционирование существуют также различия в методах, регулярно используется для количественного определения фолликула номеров каждой завязи5,6. Методологические изменчивость в настоящее время используется повреждает мета анализ овариальный запас через исследования5,7. Например фолликул чисел из различных научно-исследовательских статей может варьироваться от десятикратного или более возрасте подобные развития в пределах конкретного штамма6. Эти большие различия в сообщил фолликула количественной оценки может привести к путанице и препятствуют кросс исследование сравнения. Экспериментально, традиционные подходы к количественной фолликул из последовательных секций выполняются путем подсчета фолликулов предварительно определенное количество разделов (например, каждый пятый, десятый, или другой раздел). Изменчивость в фолликул графов с помощью этого подхода возникает не только от периодичности в разделы, которые считаются, но и от вариации в разделе толщина и технический опыт в создании последовательной разделы5,6. В дополнение к его изменчивости еще один недостаток традиционных тканей секционирование является секционирование малых яичников из молодых животных особенно сложным и сильно зависит от ориентации ткани8.
Протокол ниже описывает регулярно используемых завязи культуры техника1 , но значительно улучшает количественной оценки традиционных фолликула путем замены физической секционирование с очистки ткани и оптических секционирование с помощью конфокальной микроскопии8 ,9. Очистка с помощью погружения ткани (без необходимости для транскраниальной перфузии или электрофорез) в мочевины и сорбитол-на основе решения (например, ScaleS(0)10) оказались совместимыми с иммуноокрашивания и разрешено для уменьшения Очистка время без ущерба для глубины изображения. Другие сообщили методы (например, ScaleA28,10, SeeDB11,12ClearT и12ClearT2), либо больше времени или не позволяют углубленного оптическое разрешение образца. Оптическая секционирование выгодно, потому что это менее трудоемким и поддерживает орган трехмерной архитектуры7,8. Другим преимуществом этого подхода является подготовка образцов не требует дорогостоящих реагентов для очистки ткани и может проводиться с относительной легкостью.
В частности Протокол описал был оптимизирован для искусственного мыши яичников на послеродовой день пять но был проведен на яичниках, начиная от послеродового день 0 - 10. Этот метод использует систему культуры яичников, в котором ткани естественно придает мембраны, на которой выращиваются, содействия орган обработки и манипуляции. Описываемой культуры системы может использоваться для поддержания описаны яичников на срок до 10 дней и для оценки различных экспериментальных условий могут мешать ооцитов выживания13. Количественная оценка процедура, описанная выполняется с помощью обработки пакета Фиджи-ImageJ14 изображений некоммерческого и может проводиться на большинстве персональных компьютеров. Кроме того изображения, используемые для количественной оценки можно сделать широко доступными для научного сообщества, таким образом позволяя для будущих мета анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Корнелльский университет институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) одобрил все методы, описанные здесь, по протоколу 2004-0038 к АО.
1. Подготовка документов и культуры средств массовой информации
- Удаление рабочей области чистой с 10% хлоркой и Разрешить отбеливателя остаться на поверхности области работы по крайней мере 5 минут. После 5 минут удалите избыток отбеливатель с чистым бумажным полотенцем и 70% этанола (EtOH). Очистить рассечения Микроскоп тщательно с 70% EtOH.
Примечание: Важно, что по крайней мере частично стерильные, чтобы избежать загрязнения орган культур области работы. - Оберните ножницы и чистые пинцет салфеткой, смоченной в 70% EtOH до момента использования.
Примечание: Идеальный рассечение инструменты может варьироваться возраст/размер яичников. Наилучшие результаты получаются с помощью одного резкого микро рассечения ножниц, два штрафа отзыв щипцы (либо номер 5 или 55) и один микро рассекает Ирис ножниц. - В конической трубки сделайте 50 мл завязи культуры средств массовой информации и тепло в ванну воды 37 ° C.
- Чтобы яичник культуры среднего4, дополнение 1 x минимальных основных СМИ (MEM) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 25 мм (4--(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 100 единиц/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, 0,25 мкг/мл Амфотерицин B (например, 45 мл MEM, 5 мл тепла инактивированная FBS, 1,25 мл HEPES и 0,5 мл 100 x акций и пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B).
- Подготовьте пластины и вставки до культуры завязи.
- В культуре ткани капюшоном добавьте 1 mL завязи питательной среды к пластине культуры ткани 35 мм.
- Предварительно вымочить вставки мембраны с питательной среды. Добавьте достаточно СМИ, обычно около 0,55 мл, 24-ну несущей пластины культуры ткани, и место клеточной культуры вставить в колодец. Убедитесь в том, что вставка мембраны затрагивает средств массовой информации.
- Подготовьте количество 35 мм пластин и скважин с вставками культуры клеток согласно ожидаемое количество яичников в эксперименте. Поместите пластины 35 мм, содержащие 1 мл культуры средств массовой информации и 24-ну несущей плиты, содержащие культуры средств массовой информации и вставки в 37 ° C, 5% CO2и атмосферных O2 инкубатора.
- Организовать плита рядом с областью диссекции и установите температуру до 37 ° C. Держите 37 ° C, 5% CO2 и атмосферных O2 инкубатора близка зале рассечение.
2. яичник диссекции и органной культуры
Примечание: Яичники могут расчлененный при комнатной температуре, пока воздействие температуры неидеальной минимальна.
- Усыпить самок мышей на послеродовой день 5, путем обезглавливания, одно одновременно.
Примечание: Согласно IACUC руководящие принципы на объекте, где проводятся исследования должны проводиться эвтаназии. - Spray животное с 70% EtOH. Поместите животное на вершине сухой салфеткой под микроскопом рассечение. Поместите блюдо культуры ткани 35 мм, содержащие завязи Культура СМИ недалеко от Микроскоп рассечение.
- С щипцами или микро Рассечение ножницами Ирис сделайте надрез через кожу животного и в брюшную полость, используя осторожность не резать в кишечник. Вытеснить кишечника из брюшной полости и найдите яичников. Экстракт яичников и поместите их в 35-мм тканевой культуры блюдо, содержащие культуры средств массовой информации.
- Когда яичники были расчленены от животного, увеличения микроскопа диссекции для того, чтобы лучше визуализировать яичников и любых вложенных ткани. С чистой штрафа отзыв щипцы, удалить все-яичниковой ткани, такие как Бурса и жировой ткани. Будьте осторожны, чтобы сохранить нетронутыми яичников при удалении прилагаемый-яичниковой ткани.
- Яичники являются изолированными, перенесите пара в предварительно замоченные клетки культуры вставки несущей пластины 24-ну (см. шаги 1.4.2 и 1.4.3) и отрегулировать громкость среды для обеспечения, что это достаточно, чтобы сохранить орган влажные (без полностью погрузив его).
Предупреждение: Будьте осторожны, чтобы не засуните отверстие в мембране клетки культуры вставки при передаче яичников. - Место описаны органов в 37 ° C, 5% CO2и атмосферных O2 инкубатора.
- Повторите шаги, 2.1-2.6 пока расчлененные и размещены на культуре клеток яичников каждого животного вставить 24-ну пластины, содержащие завязи питательной среды.
- Изменения яичников питательной среды каждые 2 дня, используя утепленные аликвоты СМИ завязи от ванну воды 37 ° C и приступить к части 3 протокола на желаемое время экспериментальные точки.
3. ткань фиксации
- В 15 мл Конические трубки, подготовьте параформальдегида 4% (PFA) 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) (например, добавить 2 мл 16% PFA электронной микроскопии класса 6 мл ПБС).
Предупреждение: PFA является опасным веществом и должны быть обработаны под капотом химического. - Исправьте культивировали яичников, без удаления ткани из культуры вставки, охватывая ткани с свежеприготовленный раствор 4% PFA. Уплотнение края пластины с клей (чтобы избежать испарения) и образцы на 4 ° C на ночь.
Примечание: Чтобы облегчить обработку и целостности тканей, Избегайте, вытесняя яичников из вставки культуры клеток на протяжении всей процедуры. Культивированный яичников, придает поверхности пластины являются выгодными для обработки без повреждения или потери органа. - Ополосните ткань 3 x с 70% EtOH и либо приступить к шаг 4.1 или хранить его в сцинтилляционные флаконов заполнены с 70% EtOH на 4 ° C до дальнейшей обработки.
Примечание: При использовании ткани эндогенно выражая флуоресцентных белков, хранения образцов с 70% EtOH может значительно уменьшить сигнал. В качестве альтернативы можно промыть и хранятся в PBS с азидом натрия 0,2% (НАН3) ткани. NaN3 является, однако, высоко токсичен и представляет опасность серьезной ингаляции. Стоковый раствор в зонта и обрабатывать ношение надлежащие средства личной защиты, такие как лаборатории пальто и нитриловые перчатки.
4. Вся гора иммунофлуоресценции
- Место фиксированных тканей в однократном ПБС в RT минимум 4 ч до permeabilization шаг 4.3.
- Подготовьте раствор permeabilization и блокирования решения.
- Готовят раствор permeabilization, как описано. В однократном ПБС добавьте 0,2% поливиниловый спирт (PVA), 0,1% раствор (NaBH4) боргидрид натрия (от 12 wt.% в раствор гидроксида натрия (NaOH) 14 М) и 1,5% полиэтиленгликоль трет -octylphenyl эфира (неионных ПАВ детергент). В 50 мл Конические трубки, добавить 5 мл 10 x PBS, 0,1 г ПВА, 50 мкл NaBH4и 750 мкл неионных ПАВ моющего средства, а затем добавить ультрачистая вода до 50 мл и агитировать хорошо при комнатной температуре до тех пор, пока смесь не станет полностью в растворе.
- Подготовьте блокирующие решение, как описано. ПБС добавить 0,1% неионные ПАВ стиральный порошок, 0,15% 2,5 метров глицина рН 7,4, 10% нормальной козьего сыворотки, 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 0,2% НАН3, 100 единиц/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицин B. приготовить раствор из 2,5 М глицин, растворяя 93,8 g глицина в ультрачистая вода окончательный объем 500 мл (рН 7,4) и Стоковый раствор 10% НАН3 , растворяя 5 g в 50 мл сверхчистой воды; затем в 50 мл Конические трубки Подготовьте блокировки решение, добавив 5 мл 10 x PBS, 50 мкл неионных ПАВ моющего средства, 750 мкл Стоковый раствор глицина, 5 мл сыворотки коза, 1,5 г BSA, 1 мл НАН3 Стоковый раствор и 0,5 мл 100 x акций и пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B. Окончательное решение добавьте ультрачистая вода до окончательный объем 50 мл и шприц фильтра.
- Удалить и сбросить ПБС из флакона, а затем добавьте достаточно permeabilization решение полностью погружаться в яичниках. Поместите образец в permeabilization растворе на орбитальный шейкер (например, nutator) при комнатной температуре в течение 4 ч.
Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от толщины орган. - Замените permeabilization решение достаточно блокирования решения полностью погружаться в яичниках. Печать флакона с пластиковой клей и оставить ткани, инкубации в течение не менее 12 ч при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
- Подготовка основного антитела разрежения в блокирования решения согласно таблицы производителя.
Примечание: Обратите внимание, что не все антитела совместимы с таможенного агента. Средний объем необходимых на сэмпл составляет около 750 мкл.- Для количественной оценки ооцитов, используйте TAp63 (маркер ядерных ооцитов) и MVH (цитоплазмы клетки семенозачатка маркер).
Примечание: Антитела, которые используются в иммунофлуоресценции образы являются мыши анти p63 и кролик анти MVH). Ослабленный первичный гуморальный решение может быть повторно 2 x или больше, если хранить при 4 ° C между пятная протоколы и правильно обработаны, чтобы избежать роста бактерий.
- Для количественной оценки ооцитов, используйте TAp63 (маркер ядерных ооцитов) и MVH (цитоплазмы клетки семенозачатка маркер).
- Место вставки, содержащие ткани в пластине 24-Ну и около 750 мкл раствора первичного антитела. Убедитесь, что яичников полностью погружены. Уплотнение пластины с клей к минимуму испарение и оставить ткани, инкубации в течение 4 дней при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
- Приготовьте моющий раствор.
- Приготовьте моющий раствор, как описано. Сделать ПБС, добавьте моющее неионных ПАВ ПВА и 0,15% 0,2%. В 50 мл Конические трубки добавьте 5 мл 10 x PBS, 0,1 г ПВА, 75 мкл неионных ПАВ моющего средства и ультрачистая вода до окончательный объем 50 мл.
- Удаление основного антитела разрежения и добавьте щедрое количество моющего раствора. Всегда убедитесь, что погружаться в яичниках. Разрешить яичников замочить в растворе на ночь при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
- Заменить моющего раствора и инкубировать на орбитальный шейкер 2 ч и более.
- Повторите шаг 4.9 одно дополнительное время.
- Подготовьте вторичное антитело разрежения в блокировании решения.
Примечание: Вторичные антитела, которые используются являются анти мыши 488 Люминесцентную краску, поднятые в козла и анти кролик 594 Люминесцентную краску, поднятые в козла. Смотрите Шаг 4.5. Средний объем необходимо на сэмпл. - Удаления моющего раствора из яичников и добавить раствор вторичных антител. Защищать от света (обернуть тарелку с алюминиевой фольгой) образцы и печатью пластины с клей для сведения к минимуму испарения. Проинкубируйте образцы на орбитальный шейкер при комнатной температуре в течение 2 дней.
Примечание: Далее, защищая образцы от света с помощью алюминиевой фольгой во время всех последующих инкубации шаги. - Удалять вторичное антитело решение от образцов и добавить моющий раствор. Инкубируйте на орбитальный шейкер для 8 h.
Примечание: Если окрашивание 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), добавьте 50 нг/мл DAPI к первому шагу мыть (~ 8 ч инкубации). - Замените моющий раствор для ночь мыть.
- При подготовке очистки раствора (см. раздел 5), заменить на ночь, моющего раствора с свежий раствор и хранить пробы на орбитальный шейкер при комнатной температуре.
5. яичник очистки и обработки изображений
- Подготовка ScaleS(0), очистка решения.
- Подготовка ScaleS(0), очистка решения10 , добавив реагенты в заданной пропорции: 40% D-(-) сорбитол (w/v), 10% глицерина, 4,3 М мочевины и 20% диметилсульфоксида (ДМСО), pH 8,1 (например в 50 мл Конические трубки, добавить 2,5 мл глицерина, 10 г сорбита , 5 мл ДМСО и 12 мл 9 M мочевины для общего объема 25 мл. Mix решение инверсии при 50 ° C за 30 мин и Дега перед использованием).
- Удаление моющего раствора и погрузите образцы в очистке раствора. Для лучших результатов сохранить образцы на орбитальный шейкер.
- Заменить решение очистки 2 x в день до тех пор, пока ткань становится прозрачным (примерно 2 дня).
- После очистки ткани, подготовить образец для воображения, тщательно удалив вставки мембраны, содержащий культивировали яичников с штрафом Совет скальпель и размещение образца на стеклянное скольжение.
- Перейти к визуализации образцы на микроскопе способны оптических секционирование.
6. яйцеклетка количественная оценка
Примечание: Существует множество различных компьютерных программ, которые способны дать количественную оценку клетки. Описанные ниже — это протокол для квантификации ооцитов, используя пакет обработки изображений-некоммерческая, Фиджи-ImageJ14.
- С помощью проекции плоского максимальная интенсивность Z -стек изображений серии для конкретных клеточных маркеров интерес (без DAPI канал), преобразуйте изображение в черно-белый 8-битного изображения под тип в раскрывающемся списке изображений меню.
- В раскрывающемся меню изображения выделите вкладку Настройка , а затем выберите порог.
- Вручную отрегулируйте порог до уровня, который наилучшим образом идентифицирует каждый индивидуальный ооцитов. После того, как определяется уровень, нажмите кнопку Применить для создания черно-белое изображение. После завершения, количественно образца, отделяющей используя значок овальной или Freehand .
Примечание: Фиджи-ImageJ имеет различные параметры для тонкой настройки изображения, которое будет использоваться для количественной оценки частиц. Например, в процесс | Бинарные таб, существуют различные варианты, которые могут быть использованы для улучшения обнаружения того, что будут учитываться. На рисунке 4параметры, используемые для более индивидуализировать фолликулов был Ероде, затем заполнить дырыи наконец водосборных бассейнов. - В раскрывающемся меню анализ выберите анализ частиц. Установите параметры согласно нужное разрешение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол включает 6 основных шагов после рассечения яичников, как указано на рисунке 1. Рисунок 2 , Рисунок 3 , Рисунок 4 выделить наиболее новизну этого протокола, которые включают оптимизацию ткани, очистка для яичников и цельной ткани ооцитов количественной оценки с использованием Фиджи-ImageJ. Рисунок 2A показывает изображения uncultured 5-дневный послеродовой фиксированной завязи до (слева) и 1 час после (справа) Добавление очистки раствора на яичнике. Завязь начнет стать полупрозрачный в течение нескольких минут погружения в очистке раствора. После очистки, малые яичников как один образ на рисунке 2A становятся трудно справиться без повреждения. Таким образом работая с искусственного описаны яичников выгодно, потому что они привязываются к поверхности пористые вставки мембраны, на котором они культивировали. Приверженность завязи вставки мембраны позволяет экспериментатору для обработки вставки мембраны, вместо того, чтобы яичник, сам (Рисунок 2B и рис. 3). Кроме того яичники, культивируемых в непосредственной близости от будет предохранитель и показывает Рисунок 2B придает плавленого яичников до (слева) и после очистки (справа) на гематоксилином витражи образцы.
Выполнение оптических секционирование культивировали яичников без очистки возможно; Однако глубоко внутри ткани клетки имеют сигнала, который трудно отличить от фона и отсутствие четкого сигнала препятствует надлежащего ооцитов количественной оценки (Рисунок 3А). В отличие от Рисунок 3A рисунок 3B -образ представителя очищается образца, в котором возможен ооцитов количественной оценки на протяжении всего органа. Рисунок 3B демонстрирует, что весь орган изображений очищается культивировали яичников могут проводиться без значительной потери сигнала глубоко в ткани и изображения, такие как одно показанное (рис. 3B) могут быть легко количественно. Одним из подходов для количественной оценки яйцеклеток в образцах таких является путем преобразования серии Z-стек оптических секций в проекцию максимальной интенсивности и дальнейшей обработки файла с пакет обработки изображений. Рисунок 4 и Дополнительные рисунок 1 выделить шаги, используемые для количественного определения количество яйцеклеток в рисунке 3B с помощью Фиджи-ImageJ. Справочная таблица 1 содержит Фиджи-ImageJ частиц (ооцитов) количественной оценки. Количественная оценка частиц с помощью этого метода также позволяет для анализа различных фолликулов, основанный на размере ооцитов, потому что информацию о количество частиц и соответствующую область каждой частицы рассчитывается путем программного обеспечения и для пользователь.
Рисунок 1: Схематическое изображение всего протокола. Визуальные итоги протокол начиная с рассечение яичника (1), следуют завязи культуры (2), фиксация ткани с 4% PFA (3), иммуноокрашивания, с использованием специфических антител (4), Очистка ткани для глубокой обработки изображений (5), получение с помощью оптических раздел Конфокальный микроскоп (6) и заканчивая ооцитов количественной (7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: разница в ткани непрозрачность ООН очищенные и очищенные яичники. (A) завязи от послеродового день пять pup без очистки (слева) и после мягкой очистки около 1 ч (справа). (B) несколько яичников культивировали в непосредственной близости друг от друга на семь дней. Показано два различных увеличениях каждого образца. Левого изображения являются без Клиринг и правого изображения с выравниванием. Яичники присоединит к мембране культуры вставки и может обрабатываться лучше если прилагаемый на протяжении всего протокола. Для того, чтобы улучшить контраст ткани для изображений с помощью белый свет, яичники были погружены в гематоксилином за 5 мин после фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: иммунофлюоресценции изображений ООН очищенные и очищенные яичников. Яичники от послеродового день 5 щенков были культивировали в течение 7 дней и окрашенных по всей горе иммунофлюоресценции, окрашивание протокол описал. Отображаются в красном цвете являются помечены с мыши гомолога Васа (MVH) для выявления зародышевых клеток и в зеленом клетки-это клетки, помечены ядерной ооцитов специфичные маркер, p63. DAPI, синим, использовался для обозначения всех клеточных ядер. (A) иммунофлюоресценции изображение яичников без очистки. (B) иммунофлюоресценции изображение яичников с выравниванием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: рабочего процесса Visual как для количественного определения ооцитов, с помощью программного обеспечения Фиджи-ImageJ. Чтобы облегчить анализ данных, изображения, производный от плоскости конфокальный может уменьшиться до максимальной интенсивности проекции вместо 3D изображения. С максимальной интенсивности проекции пользователь может определить параметры порога изображения таким образом, что целевой частицы становятся очевидными. После того, как упрощенное изображение получается, программное обеспечение используется для подсчета яйцеклеток. Критически изучения изображений во время настройки параметров имеет решающее значение. Эта цифра показывает пример того, как можно задать порог частиц/ооцитов. Текст выше каждое изображение освещается параметр, используемый для получения этого образа в Фиджи-ImageJ. Программное обеспечение генерирует таблицу с области измерения частиц (см. Справочная таблица 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: рабочего процесса Visual как для количественного определения ооцитов, с помощью программного обеспечения Фиджи-ImageJ (Нижняя увеличение). Эта цифра показывает ооцитов квантификации для двух яичников в непосредственной близости. Шаги, выполняемые такие же, как на рисунке 4. 2 436 частиц/фолликулы были подсчитаны программного обеспечения. Количественная оценка данных, полученных из программного обеспечения можно найти в дополнительной таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Справочная таблица 1: фолликул количественная оценка вычисляется путем Фиджи-ImageJ. Эта таблица содержит список подсчитанных фолликулов и соответствующей области, полученные изображения в дополнительном рисунок 1. Размер частиц, используемых для количественной оценки было установлено от 10 мкм2-бесконечность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение mammalian воспроизведение требует использование и количественная оценка специализированных клеток, которые не регулярно поддаются клеточной культуры. Однако ex vivo культуры системы являются эффективными в сохранении яичников и фолликул жизнеспособности1,15. Во время завязи культуры ткани требует больше площадь поверхности для обмена питательных веществ путем диффузии. Таким образом 5 - дневных мыши яичников являются идеальными в размер и форму для органной культуры. Этот протокол был оптимизирован для яичников в течение семи дней в культуре, но яичников культуры длина может быть скорректирована согласно конкретным научным вопрос1,4. Сопоставимые результаты были достигнуты в яичниках культивировали в течение всего лишь трех дней до тех пор, как десять дней (данные не показаны), но яичники от животных старше десяти дней являются большими и культуры не может быть столь же эффективным, таким образом подчеркнув ограничения протокола.
Если не требуется ex vivo культивирования яичника, это можно исправить и выведение старых яичников с протоколом описал, хотя изменения может потребоваться приспособиться к более ткани размер9,16. Окрашивание протокол, в описанный зависит от пассивной диффузии антител в орган, который указывает, что, возможно, удастся пятно больше яичников с либо больше шагов инкубации антитела или разделять ткани в несколько более мелкие куски, которые можно быть восстановлены после съемки. Использование мочевины и сорбитол в ScaleS(0), очистка агент, оказался эффективным для новорожденных культивировали яичников, потому что он требует более короткий инкубационный период, чем те, которые сообщили для очистки агентов с мочевиной и глицерин (ScaleA2)8,10 . Кроме того использование низкой концентрации натрия боргидрид (4NaBH) в permeabilization растворе снизилась фоновый шум и, вместе с больше инкубаций образцов с первичных и вторичных антител, способствовали пятнать глубоко в ткани. Кроме того использование ПВА в permeabilization и мытье решения предотвращает ложные пригорание ткани17,18.
В этом протоколе культивировали здорового яичников будет приложить к вставки мембраны, в то время как нездоровой яичников может отсоединить от него после фиксации и обработки. Обработка рыхлой ткани с щипцами повредить яичники и вероятно компромисс изображений. Кроме того рыхлой ткани могут быть внедрены в 5% агарозном вилки или обрабатываются с передачей пипетки, пока кончик открытия достаточно широк, чтобы не повредить его. Что касается иммуноокрашивания первичных антител, помимо тех, которые используются в настоящем Протоколе может выполнять по-разному и могут потребовать оптимизации в permeabilization и инкубации шаги.
И наконец протокол описывает альтернативный подход к количественной оценке фолликулов от молодых яичники по сравнению с традиционной парафин встроенных последовательных секций или другие ранее описанные объемные квантификации фолликулов от всей горе изображения 5 , 9 , 16. зависимости исследователя требования, процедура для ооцитов количественной оценки, указанных в протоколе также может быть использован характеризуют различные этапы фолликулярной развития19. Области частиц, порожденных программного обеспечения может использоваться для определить диаметр ячеек и таким образом вывести фолликулярной стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Ребекка Уильямс и Johanna Dela Cruz от Корнелл BRC Imaging и Эндрю Recknagel за полезные предложения и техническую помощь. Эта работа была поддержана в национальные институты здравоохранения грант S10-OD018516 (Фонду Корнелла Imaging), T32HD057854 к J.C.B. и R01-GM45415 для J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
