Summary
シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。
Abstract
哺乳類の生殖生物学の分野の研究は、卵巣と精巣の全体的なヘルスを評価をしばしば伴います。具体的には、女性の卵巣のフィットネス頻繁の可視化と定量化卵胞と卵子によって評価されます。卵巣は、不透明な三次元組織は、従来のアプローチは苦心して全体の臓器中の細胞を可視化するために数多くのシリアル セクションにティッシュをスライスを必要です。さらに、このメソッドによって定量化は通常卵のおおよその直径で区切られたセクションのサブセットのみを得点を伴う、ので、不正確になりやすいです。ここでは、プロトコルは、全臓器組織の清算とマウス卵巣卵胞と卵子を視覚化するための免疫蛍光染色を代わりに利用した、説明します。伝統的なアプローチと比較して、このプロトコルは多くの理由で卵巣内の細胞を可視化するため有利である: 1) 卵巣試料調製及び処理全体はそのままセクションすることは困難である 2) 小さな卵巣は容易に調べることができます。3) 携帯電話の数量化をより容易にかつ正確に達成します。・ 4) イメージ全体の器官。
Introduction
細胞構成と哺乳類の卵巣の形態学的特徴を研究するために科学者はしばしば免疫組織学的染色パラフィン埋め込まれた卵巣の続く生体内で実験に依存します。もっと最近しかし、完全な卵巣器官培養が技術することができますより良い可視化と結合するために卵巣機能1,2,3、4を勉強する効果的な代替であると証明し、数量化ツールです。伝統的に、卵巣の形態解析パラフィン埋め込まれた連続切片から、骨の折れる、時間がかかり、連続パラフィン埋め込まれたティッシュの区分であることに加えて再構築の三次元の卵巣アーキテクチャによって異なりますオルガンのない保証の適切な再建をしないとセクションがしばしば紛失またはプロセスで注文ミス。
シリアルセクショニングに関連する技術的な課題に加えて、日常的に卵巣5,6あたりの卵胞数を定量化するために使用方法の変化もあります。現在使用されている方法論的変動研究5,7を越え卵巣予備のメタ分析を損ないます。たとえば、異なる研究論文から卵胞数 10 倍以上特定のひずみ6内と同様の発達年齢間によって異なります。報告された卵胞定量化にこれらの大きな違いは混乱を招く可能性し、クロス研究比較を妨げています。セクションのあらかじめ定義された数の卵胞をカウントすることによって連続切片から卵胞定量化への従来のアプローチを実行する実験的に (例えば、すべての 5 番目、10 番目、または他のセクション)。このアプローチを使用して卵胞数の変動は、切片厚で連続切片5,6を生成する際に技術的な経験だけでなく、セクションはカウント、周期性変化からもを発生します。その変動に加え伝統的なティッシュの別の欠点は、若い動物から小さな卵巣の断面が特に挑戦的な組織向き8に大きく依存することです。
以下のプロトコルは日常的に使用される卵巣文化技術1を記述しますが、クリア組織の物理的な区分および共焦点顕微鏡8 を用いた光学セクショニングを置き換えることによって伝統的な卵胞の定量化に大幅に向上 ,9。クリアで、尿素およびソルビトール ベース組織浸漬 (経頭蓋灌流または電気泳動なし) を使用してソリューションを (例えば、 ScaleS(0)10)、免疫染色と互換性があることを証明し、の減少のため許可イメージングの深さを損なうことがなく時間をクリアします。その他の報告の方法 (例えばScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12、および ClearT212) より多くの時間がかかるまたはサンプルの詳細な光学解像度を許可しません。光の断面は、以下の労働集約型であり臓器の三次元アーキテクチャ7、8を保持ため便利です。このアプローチの別の利点は、サンプルの準備組織をクリアする高価な試薬を必要としない比較的容易に行うことができます。
具体的には、説明されたプロトコルは生後 5 日目の培養マウス卵巣に最適化されていますが、生後 0 - 10 から卵巣を実施しました。メソッドでは、組織が自然にそれが培養、臓器処理や操作を促進する膜につく卵巣培養系。説明文化システムは、explanted 卵巣 10 日間までとどのように異なる実験条件を評価するためには、卵母細胞生存13を妨げる可能性を維持するために使用できます。定量化手順処理パッケージ フィジー ImageJ14非商用画像を使用してされるので、ほとんどのパーソナル コンピューターで行うことができます。さらに、将来のメタ分析することができます、科学的なコミュニティのため、定量化に使用するイメージを広く利用可能にすることができます。
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Protocol
コーネル大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、議定書 2004-0038 JCS にここでは、記載されているすべてのメソッドを承認しました。
1. 楽器及び培地の調製
- ワイプ作業領域 10% の漂白剤できれいにでき、漂白剤を少なくとも 5 分作業エリア表面上に残ります。5 分後に、きれいなペーパー タオルと 70% のエタノール (エタノール) 余分な漂白剤を削除します。きれいに徹底的に 70% で解剖顕微鏡江藤。
注: 作業領域が少なくとも半器官培養の汚染を避けるため無菌であることが重要です。 - 70% で湿らせた紙タオルできれいな鉗子、はさみをラップ使用時までエタノール。
注: 理想的な解剖ツールは卵巣の年齢やサイズによって異なります。1 つ鋭いマイクロ解離シザー、2 つファインチップ鉗子 (いずれか 5 または 55 号) を使用して最高の結果が得られますと 1 つマイクロ アイリス シザーを解剖します。 - コニカル チューブ 50 mL 卵巣文化メディアと 37 ° C の水浴の暖かいを確認します。
- 子房培養培地4をするためには、補足 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL 最小重要な媒体 (MEM) x 1アムホテリシン B (FBS、HEPES、1.25 mL とペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 mL と例えばMEM、45 mL、5 mL の熱不活化)。
- プレートと子房培養前挿入を準備します。
- ティッシュ文化フードの 35 mm の組織培養プレートに卵巣培養液 1 mL を追加します。
- 事前ソークは、培養液で膜を挿入します。よく 24 ウェル キャリア組織培養プレートと場所細胞培養に挿入さて、あたり約 0.55 mL、通常十分なメディアを追加します。挿入の膜に触れるメディアであることを確認します。
- 35 mm プレートと実験で卵巣の数に従ってセル文化を挿入して井戸の数を準備します。文化メディアと文化メディアと 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの挿入を含む 24 ウェル キャリア プレートの 1 つの mL を含む 35 mm プレートを配置します。
- 郭清範囲の隣のホット プレートを配置し、37 ° C に温度を設定37 ° C、5% CO2を保つため、大気中の O2インキュベーター解剖室に近い。
2. 卵巣郭清及び器官培養
注: 卵巣は、非理想的な温度への露出が最低限ある限り、室温で切り裂かれます。
- 1 つずつ斬首で産後 5 日目で雌マウスを安楽死させます。
注: 安楽死は IACUC ガイドライン研究が実行されている施設の存在により実施する必要があります。 - スプレー動物 70 %etoh。解剖顕微鏡の下で乾燥したペーパー タオルの上に動物を配置します。解剖顕微鏡に近い卵巣文化メディアを含む 35 mm の組織培養ディッシュを配置します。
- 鉗子や顕微解剖アイリス シザー、腸に切らないように注意を使用して動物の腹腔内に皮膚を切開を行います。腹腔内から腸をプッシュし、卵巣を探します。卵巣を抽出し、培地を含む 35 mm の組織培養皿にそれらを置きます。
- 卵巣は、動物から解剖されている、一度卵巣と付属の任意の組織を見やすくために解剖顕微鏡の倍率を増やします。ファインチップ鉗子をきれい、滑液包、脂肪組織など、すべての非卵巣組織を削除します。添付の非卵巣組織を除去するとき、卵巣を壊さないように注意します。
- 卵巣が分離されたら、キャリア 24 ウェル プレートの漬け細胞文化挿入ペアを配置 (1.4.2 と 1.4.3 の手順を参照してください) と器官の潤いを保つのに十分であることを確認する媒体のボリュームを調整 (なし完全に水没して)。
注意: は、卵巣を転送するときに細胞培養インサートの膜に穴を突くように注意してください。 - 場所は仔 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの臓器です。
- 2.1 2.6 各動物の卵巣を切除し、細胞培養に配置するまで卵巣培養培地を含む 24 ウェル プレートの挿入手順を繰り返します。
- 変更を使用して卵巣培養培地 2 日おきは 37 ° C の水浴から卵巣メディア因数を加温し、目的実験時点でプロトコルのパート 3 に進みます。
3. ティッシュの固定
- 15 mL の円錐管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備 (6 mL の 1x PBS に 16 %pfa 電子顕微鏡グレードの 2 mL の追加など)。
注意: PFA は有害物質で、化学のフードの下で処理する必要があります。 - 作りたての 4 %pfa ソリューションと組織を覆うことによって文化の挿入から組織を削除せず培養卵巣を修正します。(蒸発を避けるため) にプラ用接着剤で板の端を密封、4 ° C でサンプルを一晩します。
注: 組織性処理を促進するためにプロシージャ全体でセル文化挿入から卵巣を変位を避けます。チップの表面に付着した培養卵巣処理に有利な損傷臓器を失うことがなく。 - リンス組織 3 x 70 %etoh, いずれかが 4.1 または満ちているシンチレーション バイアルでストアをステップへ進みます 70 %etoh まで 4 ° c をさらに処理します。
注: 内生的組織を用いた場合 70% サンプルを保存の蛍光蛋白質を表現するエタノールを大幅に減らします信号。また、組織を洗浄して、0.2% アジ化ナトリウム (NaN3) と PBS に格納できます。ナン3は、しかし、非常に有毒な深刻な吸入の危険性を提起します。ヒューム フードの原液を行い処理研究室コートとニトリル手袋など適切な保護具を着用します。
4. 全体のマウント蛍光
- 4.3 透過ステップ前に 4 h 以上の RT で 1 × PBS で固定ティッシュを置きます。
- 透過溶液及びブロッキング溶液を準備します。
- 透過ソリューションを準備しています。1 × PBS に 0.2% ポリビニル アルコール (PVA)、0.1% ナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) (から 12 wt.% 14 M 水酸化ナトリウム (NaOH) ソリューションで、ソリューションと 1.5% ポリエチレング リコール-tert-ブチルオクチルフェニル エーテル (非イオン性界面活性剤の洗剤) を追加します。50 mL の円錐管に PBS x 10 の 5 mL、0.1 グラム、PVA、NaBH4の 50 μ L、非イオン性界面活性剤の洗剤の 750 μ L を追加し、超純水を追加 50 mL を水し、混合物がソリューションに完全なるまで室温でよく攪拌します。
- ブロッキング液を準備しています。1 × PBS に 2.5 M グリシン pH 7.4 の洗剤、0.15% 0.1% 非イオン性界面活性剤を追加、10% ヤギ血清、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、0.2% ナン3、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン b. のストック溶液を調製2.5 超純水水 50 mL に 5 g を溶解して純水 500 mL 最終巻 (pH 7.4) にグリシンの 93.8 g と 10% ナン3の原液を溶解することにより M グリシン50 mL の円錐管に 5 mL の 10 x PBS、非イオン性界面活性剤の洗剤、グリシン原液、ヤギ血清、BSA の 1.5 g、ナン3ストック溶液 1 mL の 5 mL の 750 μ L の 50 μ L を追加することによってブロックのソリューションを準備して、、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 ml。超純水水 50 mL とシリンジ フィルターの最終巻までに最終的なソリューションを追加します。
- 削除しバイアルから 1 × PBS を破棄し、卵巣が完全に水没する十分な透過ソリューションを追加します。室温で 4 h 用のシェーカー (例えばnutator) を軌道上で透過ソリューションにサンプルを配置します。
注: インキュベーション時間は、臓器の厚さに応じて異なる場合があります。 - 卵巣が完全に水没する十分なブロッキング液で透過ソリューションを置き換えます。プラスチック接着剤でバイアルを密封し、軌道のシェーカーで室温で 12 時間以上培養組織を残します。
- メーカーのデータシートに従ってブロッキング液で一次抗体希釈を準備します。
注意: すべての抗体が決済エージェントと互換性があります。サンプルごとに必要な平均ボリュームは、約 750 μ L です。- 卵母細胞定量用 TAp63 (核卵母細胞マーカー)、mvh 遺伝子 (細胞の生殖細胞マーカー)。
注: 蛍光画像で使用される抗体は、マウス抗 p63 とウサギ抗-mvh 遺伝子)。第一抗体溶解液は再利用 2 をすることができます x 以上の汚損のプロトコル間の 4 ° C で保存および細菌の成長を避けるために正しく処理される場合。
- 卵母細胞定量用 TAp63 (核卵母細胞マーカー)、mvh 遺伝子 (細胞の生殖細胞マーカー)。
- 24 ウェル プレートで組織を含む挿入を置き、一次抗体溶液の約 750 μ L を追加します。卵巣が完全に水中に沈むことを確認します。蒸発を最小限に抑え、軌道シェーカーで室温で 4 日間の培養組織を残すプラスチック接着剤で板をシールします。
- 洗浄液を準備します。
- 洗濯ソリューションを準備しています。1 x PBS を作る 0.2 %pva と 0.15% 非イオン界面活性剤の洗剤を追加します。50 mL の円錐管に 5 mL の PBS x 10、PVA の 0.1 g、非イオン性界面活性剤の洗剤と純水 50 mL の最終巻までの 75 μ L を追加します。
- 一次抗体の希釈を削除し、洗浄液の寛大な量を追加します。常に卵巣が水没することを確認します。軌道のシェーカーで室温で一晩溶液中浸漬する卵巣を許可します。
- 洗浄液を交換し、2 h 以上の軌道のシェーカーで孵化させなさい。
- 4.9 の手順を繰り返して 1 つの追加の時間。
- ソリューションをブロックで二次抗体希釈を準備します。
注: 使用される二次抗体、抗マウス 488 の蛍光色素は、ヤギとヤギで発生した反ウサギ 594 蛍光染料で発生します。4.5 の手順を参照してください。平均ボリュームのサンプルごとに必要です。 - 洗濯ソリューションを卵巣から削除し、二次抗体溶液を追加します。光 (アルミ箔ラップ プレート) からサンプルを保護し、蒸発を最小限に抑えるためのプラスチック接着剤で板をシールします。2 日間室温で軌道シェーカーでサンプルをインキュベートします。
注: その後インキュベーションのすべての手順の中にアルミ箔を使用して光からサンプルを保護を続行します。 - サンプルから二次抗体溶液を削除し、洗浄液を追加します。8 h の軌道シェーカーで孵化させなさい。
注: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色が必要な場合は、最初の洗浄のステップ (~ 8 時間培養) に DAPI の 50 ng/mL を追加します。 - 一晩洗浄の洗浄ソリューションを取り付けます。
- 準備中にクリア ソリューション (セクション 5 を参照) で、洗浄液の新鮮な一晩を置き換えるし、軌道のシェーカーでサンプルを室温で維持します。
5. 卵巣クリアとイメージング
- クリア ソリューション ScaleS(0) を準備します。
- ScaleS(0) 指定された割合で試薬を追加することによってソリューションの10をクリアの準備: 40 %d-(-) ソルビトール (w/v)、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)、4.3 M 尿素 10% グリセリン pH 8.1 (例えば50 mL の円錐管にグリセリン、ソルビトールの 10 g の 2.5 mL を追加、DMSO、5 mL と 25 mL の容量のための 9 M の尿素の 12 mL。30 分間 50 ° c のインバージョンによるソリューションをミックスし、使用前にガス抜き)。
- 洗濯ソリューションを削除し、ソリューションをクリアするにサンプルが水没します。良い結果を得るのため、軌道シェーカーでサンプルを維持します。
- クリア ソリューション 2 を置き換える × 毎日ティッシュになる透明な (約 2 日) まで。
- 組織がクリアされると、罰金と培養の卵巣を含む挿入膜を慎重に外してイメージングのためのサンプルを準備チップ メスとスライド ガラスのサンプルを載せています。
- イメージングの光学断面のできる顕微鏡のサンプルに進みます。
6. 卵の定量化
注: セルを定量化することができる多くの異なった計算機プログラムがあります。下記は、フィジー ImageJ14非商用画像処理パッケージを使用して卵の定量化のためのプロトコルです。
- イメージのドロップダウン リストに [種類]黒と白 8 ビット イメージにイメージを変換 (DAPI チャネル) なし興味の特定の細胞マーカーのz-スタック画像シリーズのフラットな最大強度投影を使用して、メニュー。
- 画像のドロップ ダウン メニューの下で調整タブをハイライト表示し、しきい値を選択します。
- それぞれの個々 の卵母細胞を識別するレベルにしきい値を手動で調整するには。一度レベルを決定すると、黒と白のイメージを生成する適用をクリックします。完了すると、視線は楕円形またはフリーハンドのアイコンを使用してサンプルを定量化します。
注: フィジー ImageJ 粒子定量化に使用されるイメージを微調整する別のオプションがあります。例えば、プロセスの |バイナリ] タブで、どのようなカウントされますの検出を改善するために使用できるさまざまなオプションがあります。図 4、良い卵胞を個別に使用するオプションは、浸食、続いて穴を埋めると最後に流域だった。 - 分析のドロップ ダウン メニューで、[分析粒子を選択します。目的の解像度によるとパラメーターを設定します。
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Representative Results
このプロトコルには、六つの主要なステップが含まれている次の卵巣の解剖図 1で説明したよう。図 2, 図 3, 図 4卵巣及びフィジー ImageJ を用いた全ティッシュ卵定量化のクリア組織の最適化を含むこのプロトコルの最も斬新な機能を強調表示します。図 2 aは、卵巣へ追加クリア ソリューション (は右) 後 (左) 前に、の教養 5 日生後固定卵巣と 1 h の画像を示しています。卵巣は、ソリューションをクリアで水没することの数分以内に半透明になるに開始されます。一度クリア、図 2 aのイメージのような小さな卵巣を損なうことがなく処理することは困難となります。したがって、培養 explanted 卵巣での作業は、彼らが培養される挿入膜の多孔質の表面に添付さになるため便利です。挿入膜、卵巣の添付ファイルには、卵巣自体 (図 2 b 、 図 3) ではなく膜挿入を処理する実験者ことができます。また、卵巣の近くで培養がヒューズし、図 2 bを示しています(左)の前に融合した卵巣を添付(右)ヘマトキシリンでクリアした後サンプル。
実行せずにクリアが可能な培養卵巣の光学セクショニングしかし、細胞組織の奥深くが背景から区別するために困難な信号との明確なシグナルの欠如を妨げる適切な卵子の定量化 (図 3 a)。図 3 aと対照をなして図 3 bは、全体の器官を通して卵定量化が可能なクリアのサンプルの代表的なイメージです。図 3 bは、1 (図 3 b) は容易に定量化することができるよう組織と画像内にある深い信号の重要な損失なしクリア培養卵巣の全臓器のイメージングを行うことができることを示しています。など、これらのサンプルの卵母細胞を定量化するための 1 つのアプローチは、最大強度投影光学セクションの z シリーズに変換してイメージ処理パッケージを使用してファイルをさらに処理です。図 4と図 1 の補足は、フィジー ImageJ を用いた図 3Bの卵母細胞の数を定量化するための手順を強調表示します。補足表 1には、フィジー ImageJ の粒子 (卵母細胞) 数量が含まれています。このメソッドを使用して粒子の定量化によりを別包の粒子数と各粒子の対応する領域についてはソフトウェアが計算に提供されるので卵サイズに基づく分析、ユーザー。
図 1: プロトコル全体の概略します。(1) 卵巣の解剖のプロトコルの最初の視覚的な概要に続いて子房培養 (2) 組織固定 4 %pfa (3) 特異的抗体 (4)、(5) をイメージング、光学セクションを使用してを取得深いティッシュをクリアを使用して染色、共焦点顕微鏡 (6) と卵の定量化 (7) で終わる。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 非クリアとクリアの卵巣の組織の不透明度の違いです。(A)卵巣生後 5 子犬 (左) をクリアせず、約 1 h (右) の穏やかなクリア後から。(B)複数卵巣が互いに近くに 7 日間培養します。各サンプルの 2 つの異なる倍率が表示されます。左端の画像が消去と右端の画像は、クリアなしです。卵巣が文化挿入の膜に接続し、プロトコルを通して接続されている場合はうまく対処できます。白色光を用いたイメージングのための組織のコントラストを向上させるために固定後卵巣 5 分ヘマトキシリンで水浸しとなった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 非クリアとクリアの卵巣の蛍光イメージング。子犬生後 5 日目から卵巣は 7 日間培養したし、説明したプロトコルを汚す全体マウント蛍光によるとステンド グラスします。マウス ヴァーサ相同物 (MVH) 生殖細胞を識別するために、緑のラベルの付いたセルは、セルの核卵母細胞特異的マーカー、p63 の付いたは赤で示しています。DAPI、青、すべての細胞の核をラベル使用だった。(A)清算せず卵巣の像。(B)清算の卵巣の像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: フィジー ImageJ ソフトウェアを使用して卵を定量化する方法について視覚的なワークフローです。データ分析を容易にするため共焦点平面から派生した画像を 3 D イメージではなく最大強度投影に削減できます。最大強度投影では、ユーザーは、ターゲット粒子が明らかになるような方法でイメージしきい値パラメーターを定義できます。単純化されたイメージを取得した後、ソフトウェアを使用して、卵母細胞をカウントします。パラメーターを設定しながら画像を批判的に検討が重要です。この図では、粒子/卵子のしきい値を設定する方法の例を示します。各画像の上にあるテキストは、フィジー ImageJ でそのイメージを取得するために使用するパラメーターを強調表示します。ソフトウェアは、(補足表 1参照) 粒子の面積測定のテーブルを生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: フィジー ImageJ ソフトウェア (低倍率) を使用して卵を定量化する方法について視覚的なワークフローです。この図は、近くに二つの卵巣の卵の数量を示します。実行する手順は、図 4のように同じです。2,436 粒子/卵胞は、ソフトウェアによって数えられました。ソフトウェアから得られた数量データに補足表 1になれます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足表 1: フィジー ImageJ で卵胞数量計算します。このテーブルには、数えられる卵胞と補足図 1の画像から生成された対応する領域の一覧が含まれています。定量化に使用粒径が 10 μ m2から設定された-無限大。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
哺乳類の生殖に関する研究では、細胞培養に日常的に従順ではない特殊な細胞を定量化して、必要があります。ただし、体外培養システムは、卵巣と卵胞の生存率1,15を維持に効果的です。子房培養中に組織拡散を介して栄養素の交換のため表面積が必要です。したがって、5 日間の古いマウス卵巣のサイズが理想的との器官培養形状します。文化では、7 日間のために維持の卵巣をこのプロトコルを最適化した、特定の科学的な質問1,4によると卵巣文化長さを調整できます。わずか 3 日間の培養と 10 日 (データは示されていない)、限り卵巣でも 10 日間は大きく、文化として有効ですが、プロトコルの制限をこのように強調表示ではないかもしれないより古い動物から卵巣と同等の結果を実現しています。
前のヴィヴォ卵巣の培養が必要でない場合を修正し、変更はより大きい組織のサイズ9,16を調整する必要がありますが、説明されたプロトコルで古い卵巣を染色することが可能です。大きい卵巣どちらか長い抗体培養手順や組織を分割することができますいくつかのより小さな部分を染色することが可能があることを示す臓器に抗体の受動拡散に依存説明汚損のプロトコルイメージング後再構築します。尿素とグリセリンとクリアリング業者 (ScaleA2)8,10報告に比べて短い潜伏期間が必要なため新生児培養卵巣の効果を証明したエージェントをクリア ScaleS(0) 中のソルビトールと尿素の使用.さらに、水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) 透過溶液中の低濃度の使用バック グラウンド ノイズを減少し、サンプルは第一次および二次抗体の孵化を長く、一緒に促進組織の奥深くに染色。さらに、透過、洗浄溶液で PVA を使うと、スプリアス粒子組織17,18にこだわることを防止できます。
このプロトコルでは培養正常な卵巣は異常な卵巣が固定と処理からデタッチしながら挿入膜にアタッチされます。鉗子でゆるい組織を処理と、卵巣およびありそうな妥協イメージングが損傷します。また、緩やかな組織を 5% アガロース プラグに埋め込まれたまたは先端開放が十分に広いそれを傷つけない限り転送ピペットで処理できます。免疫染色についてこのプロトコルで使用されているもの以外の一次抗体が異なる実行可能性があり、透過とインキュベーションの手順で最適化を必要とする場合があります。
最後に、プロトコルが埋め込まれている伝統的なパラフィン切片に比べて若い卵巣から卵胞の定量化への代替アプローチを記述または他前述の全台紙画像から卵胞の体積の定量化5,9,16. 卵胞発育19の特徴づけるさまざまな段階卵子定量化のプロトコルで説明することができますの研究員の要件、手順に応じて使用されます。セル径を決定し、こうして推論濾胞ステージ ソフトウェアによって生成された粒子領域を使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
有用な提案や技術支援、レベッカ ・ ウィリアムズとコーネル BRC イメージングからヨハンナ Dela クルスとアンドリュー Recknagel に感謝します。この作品は国立衛生研究所健康補助金に支えられた (コーネル大学のイメージング施設) に S10 OD018516、J.C.B. に T32HD057854、J.C.S. に R01 GM45415
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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