Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.
Abstract
Forschung auf dem Gebiet der Säugetier-Reproduktionsbiologie umfasst oft die Auswertung des Gesamtzustand der Eierstöcke und Hoden. Insbesondere bei Frauen, Eierstöcke Fitness oft bemisst sich durch Visualisierung und Quantifizierung der Follikel und Eizellen. Da der Eierstock eine undurchsichtige dreidimensionale Gewebe ist, erfordern traditionelle Ansätze mühsam Schneiden des Gewebes in zahlreichen Schnittserien um Zellen im ganzen das ganze Organ sichtbar zu machen. Darüber hinaus da Quantifizierung von dieser Methode in der Regel nur eine Teilmenge der in den Abschnitten, die getrennt von der ungefähre Durchmesser eine Eizelle erzielte umfasst, ist es anfällig für Ungenauigkeit. Hier wird ein Protokoll beschrieben, die stattdessen nutzt ganze Organ Gewebe Clearing und Immunfluoreszenz-Färbung der Maus Eierstöcke Follikel und Eizellen zu visualisieren. Im Vergleich zu traditionellen Ansätzen, dieses Protokoll ist vorteilhaft für die Visualisierung von Zellen innerhalb des Eierstocks aus vielerlei Gründen: 1) der Eierstock bleibt im gesamten Probenvorbereitung und Verarbeitung; (2) kleine Eierstöcke, die schwer zu Abschnitt sind, können mit Leichtigkeit untersucht werden; (3) zellulären Quantifizierung wird leichter und genauer erreicht; und 4) das gesamte Organ abgebildet.
Introduction
Um die zelluläre Zusammensetzung und morphologischen Merkmale von Säugetieren Eierstöcke zu studieren, setzen Wissenschaftler oft auf in Vivo Experimente gefolgt von immunohistologische Anfärbung der Eierstöcke Paraffin eingebettet. Vor kurzem, obwohl ganze Eierstock Orgel Kultur erwiesen hat eine effektive Alternative zu eierstockfunktion1,2,3,4 zu studieren, weil die Technik mit besseren Visualisierung gekoppelt werden kann und Quantifizierung Werkzeuge. Traditionell, hängt Analyse der Eierstöcke Morphologie von Rekonstruktion dreidimensionaler Eierstock Architektur von Schnittserien Paraffin eingebettet, aber abgesehen davon, dass mühsam und zeitaufwendig, seriell Paraffin eingebettete Gewebe schneiden tut nicht garantiert korrekte Rekonstruktion der Orgel, und Abschnitte oft verloren gehen oder falsch bestellte in den Prozess.
Neben den technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit seriellen Schnitt gibt es auch Unterschiede in den Methoden routinemäßig verwendet, um Follikel Nummern pro Eierstock5,6zu quantifizieren. Die methodische Variabilität derzeit verwendet beeinträchtigt Meta-Analyse der ovariellen Reserve über Studien5,7. Zum Beispiel können Follikel Zahlen aus verschiedenen wissenschaftlichen Artikeln von 10-divisibel oder mehr zwischen ähnlichen Entwicklungsstörungen Alters innerhalb einer bestimmten Belastung6variieren. Diese großen Unterschiede in den gemeldeten Follikel Quantifizierung können zu Verwirrung führen und Kreuz-Studie Vergleiche behindert haben. Experimentell, traditionelle Ansätze zur Quantifizierung der Follikel von Schnittserien von zählen Follikel eine vordefinierte Anzahl von Abschnitten ausgeführt werden (z. B. jeden fünften, zehnten, oder anderen Abschnitt). Variabilität im Follikel zählt mit diesem Ansatz entsteht nicht nur aus der Periodizität in welche Abschnitte gezählt werden, sondern auch von Variationen in Schnittdicke und technische Erfahrung in der Erzeugung von Schnittserien5,6. Zusätzlich zu ihrer Variabilität ist ein weiterer Nachteil der traditionellen Gewebe zu schneiden, dass die schneiden kleine Eierstöcke von jungen Tieren besonders anspruchsvoll und stark abhängig von Gewebe Orientierung8.
Das Protokoll unten beschreibt eine routinemäßig verwendeten Eierstock Kultur Technik1 aber stark verbessert traditionelle Follikel Quantifizierung durch Substitution von physischen Schneiden mit Gewebe clearing und optischer Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie8 ,9. Clearing mit Gewebe Eintauchen (ohne die Notwendigkeit für Transkranielle Perfusion oder Elektrophorese) in eine Harnstoff - und Sorbit-basierte Lösung (z. B. ScaleS(0)10) erwies sich mit der Immunostaining kompatibel und erlaubt für die Reduzierung der Clearing-Zeit ohne Tiefe der Bildgebung. Andere berichteten Methoden (z.B., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12und ClearT212) sind entweder mehr Zeit verbrauchen oder erlauben keine gründliche optischen Auflösung der Probe. Optischer Schnitt ist vorteilhaft, weil es weniger arbeitsintensiv und die Orgel dreidimensionale Architektur7,8 unterhält. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Vorbereitung der Proben erfordert keine teure Reagenzien um das Gewebe zu löschen und kann mit relativer Mühelosigkeit durchgeführt werden.
Insbesondere das Protokoll beschrieben wurde optimiert für kultivierten Maus Eierstöcke bei postnatalen Tag fünf aber am Eierstock von postnatale Tag 0 - 10 durchgeführt wurde. Die Methode nutzt ein Eierstock Kultursystem, in dem das Gewebe natürlich auf die Membran auf dem kultiviert legt, Orgel Bearbeitung und Manipulation zu erleichtern. Das beschriebene Kultursystem kann verwendet werden, zu pflegen, dass Eizelle überleben13explantierten Eierstöcke für bis zu 10 Tage und zu beurteilen, wie die verschiedenen experimentelle Bedingungen stören können. Die Quantifizierung beschrieben erfolgt mit Hilfe der nichtkommerziellen Bildverarbeitungs-Paket Fidschi-ImageJ14 und kann auf den meisten PCs durchgeführt werden. Darüber hinaus können Bilder zur Quantifizierung weithin verfügbar für die wissenschaftliche Gemeinschaft, damit zukünftige Meta-Analyse erfolgen.
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Protocol
Cornell University institutionelle Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) hat alle Methoden, die hier beschrieben wird, in 2004-0038-Protokoll zu JCS zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
- Wischen Sie der Arbeitsbereich mit 10 % Bleichmittel reinigen und lassen Sie das Bleichmittel auf die Arbeitsfläche Bereich mindestens 5 min lang zu bleiben. Entfernen Sie nach 5 min das überschüssige Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 % Ethanol (EtOH). Reinigen der sezierenden Mikroskop gründlich mit 70 % EtOH.
Hinweis: Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich mindestens Semi-zur Vermeidung von Kontaminationen der Orgel Kulturen steril sein. - Wickeln Sie sauber Pinzetten und Scheren mit einem Papiertuch gedämpft mit 70 % EtOH bis zum Zeitpunkt der Nutzung.
Hinweis: Die ideale Dissektion Werkzeuge variieren je nach Alter/Größe des Eierstocks. Beste Ergebnisse werden erzielt, mit einem scharfen Mikro sezierenden Schere, zwei feine Spitze Pinzetten (entweder Nummer 5 oder 55) und einem Mikro sezieren Iris-Schere. - Machen Sie in einem konischen Rohr 50 mL der Eierstock Kultur, Medien und im Wasserbad 37 ° C Warm.
- Eierstock Kulturmedium4machen, Ergänzung 1 x Minimal Essential Media (MEM) mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 25 mM (4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,25 µg/mL Amphotericin B (z. B. 45 mL MEM, 5 mL Hitze inaktiviert FBS, HEPES 1,25 mL und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
- Platten und Einsätze vor der Eierstock Kultur vorbereiten.
- Fügen Sie in einer Gewebekultur-Haube 1 mL Kulturmedium Eierstock an einer 35 mm-Gewebekultur-Platte.
- Pre-Einweichen einfügen Membran mit dem Kulturmedium. Fügen Sie genügende Medien, in der Regel ca. 0,55 mL pro darüber hinaus bis zur 24-Well-Zellkultur Trägerplatte und Ort einer Zellkultur einfügen in den Brunnen. Sicherstellen Sie, dass die Einlage Membran Medien berührt.
- Die Zahl der 35-mm-Platten und Brunnen mit Zelle Kultur Einsätze entsprechend der erwarteten Anzahl der Eierstöcke im Experiment vorbereiten. Legen Sie die 35 mm-Platten mit 1 mL der Kultur, Medien und die 24-Well-Trägerplatte mit Kultur, Medien und Einsätze in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.
- Ordnen Sie eine heiße Platte neben der Dissektion Umfang und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Halten Sie eine 37 ° C, 5 % CO2 und der atmosphärische O2 Inkubator ist in der Nähe der Dissektion Zimmer.
(2) Eierstock Dissektion und Orgel-Kultur
Hinweis: Eierstöcke können bei Raumtemperatur seziert werden, solange die Belastung durch die nicht-ideale Temperatur minimal ist.
- Die weiblichen Mäusen auf postnatale 5.Tag, durch Enthauptung, einzeln nacheinander einschläfern.
Hinweis: Sterbehilfe muss nach IACUC-Richtlinien, die in der Einrichtung durchgeführt werden, wo die Forschung durchgeführt wird. - Sprühen Sie das Tier mit 70 % EtOH. Legen Sie das Tier auf der Oberseite der trockenen Papiertuch unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie eine 35 mm-Gewebekultur-Schale mit Eierstock Nährmedien in der Nähe der Dissektion Mikroskop.
- Machen Sie mit Zange oder einer Schere Mikro Dissektion Iris einen Schnitt durch die Haut des Tieres und in die Bauchhöhle mit Vorsicht, nicht in den Darm geschnitten. Schieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle und suchen Sie die Eierstöcke. Extrahieren Sie die Eierstöcke und legen Sie sie in der Gewebekultur 35-mm-Schale mit Nährmedien.
- Sobald die Eierstöcke vom Tier seziert wurden, erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops Dissektion um Eierstöcke und alle angehängten Gewebe sichtbar zu machen. Mit reinigen Sie feiner Spitze Zange, entfernen Sie alle nicht-eierstockgewebe, wie Bursa und Fettgewebe. Achten Sie darauf, um die Eierstöcke intakt zu halten, wenn die beigefügte nicht ovariellen Gewebe zu entfernen.
- Sobald die Eierstöcke isoliert sind, legen Sie das Paar in die eingeweichter Zelle Kultur Einsätze der Träger 24-Well-Platte (siehe Schritte 1.4.2 und 1.4.3) und stellen Sie die Lautstärke des Mediums zu gewährleisten, dass es ausreicht, um die Orgel feucht zu halten (ohne komplett Eintauchen).
Achtung: Darauf achten, kein Loch in der Membran der Zelle Kultur einfügen stecken, wenn die Eierstöcke zu übertragen. - Ort explantiert Organe in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 bis die Eierstöcke der einzelnen Tiere seziert und auf die Zellkultur platziert von der 24-Well-Platte mit dem Eierstock Kulturmedium einfügen.
- Änderung der Eierstock Kulturmedium alle 2 Tage mit Eierstock Medien Aliquote von 37 ° C Wasserbad erwärmt und fahren Sie mit Teil 3 des Protokolls zum gewünschten experimentelle Zeitpunkt.
(3) Gewebe Fixierung
- In einem 15 mL konische Rohr 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten (z. B. hinzufügen 2 mL 16 % PFA Elektronenmikroskopie Grade 6 mL 1 X PBS).
Achtung: PFA ist ein Gefahrstoff und unter einer chemischen Haube bearbeitet werden sollen. - Die kultivierten Eierstöcke zu beheben, ohne Entfernung des Gewebes aus dem Kultur einfügen, indem Sie das Gewebe mit den frisch zubereiteten 4 % PFA-Lösung abdecken. Seal die Ränder der Platte mit Kunststoff Kleber (um Verdunstung zu vermeiden) und legen Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht.
Hinweis: Zur Vereinfachung der Handhabung und Gewebe Integrität vermeiden Sie verdrängen Eierstöcke aus der Zelle-Kultur-Einsatz während des gesamten Verfahrens. Kultivierte Eierstöcke an der Oberfläche des Einsatzes befestigt sind vorteilhaft für die Handhabung ohne Beschädigung oder Verlust der Orgel. - Spülen Sie das Gewebe 3 X mit 70 % EtOH und entweder fahren Sie mit Schritt 4.1 oder laden es in Funkeln Fläschchen gefüllt mit 70 % EtOH bei 4 ° C bis zu Weiterverarbeitung.
Hinweis: Wenn Sie Gewebe endogen verwenden kann mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine, Lagerung der Proben mit 70 % EtOH stark das Signal verringern. Alternativ kann Gewebe gespült und in die PBS mit 0,2 % Natriumazid (NaN3) gespeichert werden. NaN3 ist jedoch hochgiftig und stellt eine ernsthafte Inhalation Gefahr. Vorratslösung in der Dunstabzugshaube und Griff tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung wie ein Labor Mantel und Nitril-Handschuhe.
4. ganze Mount Immunfluoreszenz
- Legen Sie das fixierte Gewebe in 1 X PBS bei RT für ein Minimum von 4 h vor dem Permeabilisierung Schritt 4.3.
- Permeabilisierung Lösung und blockierende Lösung vorbereiten.
- Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS fügen Sie hinzu, 0,2 % Polyvinylalkohol (PVA), 0,1 % Natrium Natriumborhydrid (NaBH4) Lösung (von 12 wt.% in 14 M Natronlauge (NaOH) Lösung) und 1,5 % Polyethylenglykol Tert -Octylphenyl Äther (nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel). In einem 50 mL konische Rohr, fügen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 50 µL NaBH4und 750 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, dann ultrapure Wasser bis zu 50 mL und bei Zimmertemperatur rühren, bis die Mischung vollständig in Lösung.
- Bereiten Sie blockierende Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS hinzufügen 0,1 % nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel, 0,15 % von 2,5 M Glycin pH 7.4, 10 % normalem ziegenserum, 3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 % NaN3, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Amphotericin B. bereiten eine Stammlösung der 2,5 M Glycin durch Auflösen von 93,8 g Glycin Reinstwasser zu einem Endvolumen 500 mL (pH 7,4) und eine Stammlösung 10 % NaN3 durch 5 g in 50 mL hochreines Wasser auflösen; dann, in einem 50 mL konische Röhrchen bereiten Sie die blockierende Lösung durch Zugabe von 5 mL 10 X PBS, 50 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, 750 µL der Stammlösung Glycin, 5 mL ziegenserum, 1,5 g BSA, 1 mL der Stammlösung NaN3 , und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. Fügen Sie Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL und Spritze Filter die endgültige Lösung.
- Entfernen Sie und verwerfen Sie 1 X PBS aus der Durchstechflasche zu, und fügen Sie genug Permeabilisierung Lösung um die Eierstöcke vollständig untertauchen. Legen Sie die Probe in Permeabilisierung Lösung auf einem Orbitalschüttler (z. B. Nutator) für 4 h bei Raumtemperatur.
Hinweis: Inkubationszeit variieren abhängig von der Dicke der Orgel. - Ersetzt die Permeabilisierung Lösung mit genügend blockierende Lösung um die Eierstöcke komplett zu versenken. Versiegeln Sie das Fläschchen mit dem Kunststoff Kleber und lassen Sie das Gewebe für ein Minimum von 12 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
- Bereiten Sie Primärantikörper Verdünnung in blockierende Lösung gemäß Datenblatt des Herstellers.
Hinweis: Beachten Sie, dass nicht alle Antikörper mit dem Clearing Agent kompatibel sind. Das durchschnittliche Volumen pro Probe erforderlich ist etwa 750 µL.- Für die Quantifizierung der Eizelle, verwenden TAp63 (nukleare Eizelle Marker) und MVH (zytoplasmatischen Keimzelle Marker).
Hinweis: Die Antikörper in die Immunfluoreszenz-Bilder verwendet werden Maus Anti-p63 und Kaninchen Anti-MVH). Die primären Antikörper-Lösung kann wiederverwendet werden 2 X oder mehr, wenn bei 4 ° C zwischen Färbung Protokolle gespeichert und korrekt behandelt, um bakterielles Wachstum zu vermeiden.
- Für die Quantifizierung der Eizelle, verwenden TAp63 (nukleare Eizelle Marker) und MVH (zytoplasmatischen Keimzelle Marker).
- Legen Sie den Einsatz, die das Gewebe in einer 24-Well-Platte enthält, und fügen Sie ca. 750 µL Primärantikörper Lösung. Sicherstellen Sie, dass die Eierstöcke vollständig eingetaucht sind. Dichtplatte mit Kunststoff Kleber Verdunstung minimieren und lassen das Gewebe für 4 Tage bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
- Waschlösung vorbereiten.
- Bereiten Sie Waschlösung wie beschrieben vor. Fügen Sie 1 X PBS zu machen 0,2 % PVA und 0,15 % nichtionische Tenside Reinigungsmittel. Fügen Sie in einem 50 mL konische Röhrchen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 75 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL.
- Entfernen Sie Primärantikörper Verdünnung zu, und fügen Sie eine großzügige Menge der Waschlösung. Immer darauf achten Sie, um die Eierstöcke zu versenken. Lassen Sie die Eierstöcke in die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur auf die Orbitalschüttler einweichen.
- Ersetzen Sie die Waschlösung und inkubieren Sie auf Orbitalschüttler für 2 h oder mehr.
- Wiederholen Sie den Schritt 4,9 eine zusätzliche Zeit.
- Vorbereiten der Sekundärantikörper Verdünnung in blocking-Lösung.
Hinweis: Die sekundäre Antikörper verwendet, sind Anti-Maus 488 Fluoreszenzfarbstoff aufgewachsen in Ziege und Anti-Kaninchen 594 Fluoreszenzfarbstoff wuchs in Ziege. Siehe Punkt 4.5. für das durchschnittliche Volumen pro Probe benötigt. - Entfernen Sie Waschlösung aus den Eierstöcken zu und fügen Sie sekundäre Antikörper-Lösung. Die Proben vor Licht (Wrap-Platte mit Alu-Folie) zu schützen und die Dichtplatte mit Kunststoff Kleber um Verdunstung zu minimieren. 2 Tage inkubieren Sie Proben auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur.
Hinweis: Auch die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie bei allen anschließenden Inkubation Arbeitsschritten zu schützen. - Entfernen Sie Sekundärantikörper Lösung aus den Proben zu, und fügen Sie Waschlösung. Auf einem Orbitalschüttler für 8 h inkubieren.
Hinweis: Nach Wunsch 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung fügen Sie 50 ng/mL des DAPI der ersten Waschschritt (~ 8 h Inkubation hinzu). - Ersetzen Sie die Waschlösung für eine Übernachtung zu waschen.
- Während der Vorbereitung der Clearing-Lösung (siehe Abschnitt 5), ersetzen Sie die Waschlösung mit frischer Lösung über Nacht und die Proben auf die Orbitalschüttler bei Zimmertemperatur aufbewahren.
(5) Eierstock Clearing und Imaging
- Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung.
- Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung10 durch Zugabe von Reagenzien in einem bestimmten Verhältnis: 40 % D-(-) Sorbit (w/V), 10 % Glycerin, 4,3 M Harnstoff und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), pH 8.1 (z. B. in einem 50 mL konische Rohr, Hinzufügen von 2,5 mL Glycerin, 10 g Sorbit , 5 mL DMSO und 12 mL von 9 M Harnstoff für ein Gesamtvolumen von 25 mL. Mischen Sie Lösung durch Inversion bei 50 ° C für 30 min und degas vor Gebrauch.)
- Entfernen Sie die Waschlösung und Tauchen Sie die Proben im clearing-Lösung. Erhalten Sie für bessere Ergebnisse Proben auf die Orbitalschüttler.
- Ersetzen Sie die Clearing-Lösung 2 x täglich, bis das Gewebe wird transparent (ca. 2 Tage).
- Sobald das Gewebe deaktiviert ist, bereiten die Probe für die Bildgebung durch sorgfältig entfernen die einfügen-Membran mit kultivierten Eierstöcke mit einer Geldstrafe Tipp Skalpell und platzieren die Probe auf einem Objektträger.
- Fahren Sie mit imaging die Proben am Mikroskop in der Lage, optische schneiden.
(6) Eizelle Quantifizierung
Hinweis: Es gibt viele verschiedene Computerprogramme, die in der Lage, Zellen zu quantifizieren sind. Nachfolgend beschriebenen ist ein Protokoll für die Quantifizierung der Eizelle mit dem nichtkommerziellen Bild-Verarbeitung-Paket, Fidschi-ImageJ14.
- Mit einer abgeflachten Beihilfehöchstintensität Projektion der Z -Stapel-Bild-Serie für die spezifischen zellulären Marker (ohne DAPI-Kanal), konvertieren Sie das Bild in ein schwarz / weiß 8-Bit-Bild unter Typ in der Bild -Dropdown-Liste Menü.
- Markieren Sie unter dem Bild Dropdown-Menü die Registerkarte " Anpassen " und wählen Sie dann die Schwelle.
- Manuell passen Sie an, die Schwelle zu einem Niveau, das am besten jedes einzelne Eizelle identifiziert. Sobald die Ebene festgelegt ist, klicken Sie auf anwenden , um ein schwarz-weiß Bild zu erzeugen. Abschluss, quantifizieren Sie die Probe mithilfe von trennenden Oval oder Freehand -Symbol.
Hinweis: Fidschi-ImageJ verfügt über verschiedene Optionen zur Feinabstimmung des Bildes, die für die Quantifizierung der Partikel verwendet werden. Zum Beispiel in Prozess | Binäre tab, gibt es verschiedene Optionen, die zur Verbesserung der Erkennung von was gezählt wird. In Abbildung 4die Optionen zum Follikel besser individualisieren war Erodieren, gefolgt von Löcher füllenund schließlich Wasserscheide. - Wählen Sie unter Analyze -Drop-Down-Menü Analyze Partikel. Legen Sie die Parameter entsprechend der gewünschten Auflösung.
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Representative Results
Dieses Protokoll enthält 6 große Schritte folgen Dissektion der Eierstöcke, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 , Abbildung 3 , Abbildung 4 markieren Sie die neuen Features dieses Protokolls, die Optimierung des Gewebes clearing für Eierstöcke und ganze Gewebe Eizelle Quantifizierung mit Fidschi-ImageJ enthalten. Abbildung 2A zeigt Bilder eines unkultivierten 5-tägige postnatale festen Eierstock vor (Links) und 1 h nach (Rechts) Hinzufügen von Clearing-Lösung die Eierstöcke. Der Eierstock startet innerhalb von Minuten in clearing-Lösung getaucht wird durchscheinend geworden. Einmal gelöscht, werden kleine Eierstöcke wie abgebildet in Figur 2A schwierig zu handhaben ohne zu beschädigen. Arbeiten mit kultivierten explantierten Eierstöcke ist deshalb vorteilhaft, weil sie zugeordnet werden, auf denen sie kultivierten sind, die poröse Oberfläche der Membran einfügen. Befestigung des Eierstocks an die Insert-Membran ermöglicht den Experimentator griffest Membran einfügen, anstatt der Eierstock selbst (Abb. 2 b und Abbildung 3). Auch Eierstöcke kultiviert in der Nähe werden Sicherung und Abbildung 2 b zeigt befestigt verschmolzen Eierstöcke vor (links) und nach dem Löschen (rechts) auf Hämatoxylin gefärbten Proben.
Durchführung der optischen Schnitt kultivierten Eierstöcke ohne Ausgleich möglich ist; Allerdings Zellen tief in das Gewebe ein Signal, das schwierig, aus dem Hintergrund zu unterscheiden ist und dieser Mangel an klaren Signal verhindert richtige Eizelle Quantifizierung (Abbildung 3A). Im Gegensatz zu Abbildung 3Aist Abbildung 3 b ein repräsentatives Bild einer gelöschten Probe in der Eizelle Quantifizierung über das ganze Organ möglich ist. Abbildung 3 b zeigt, dass ganze Orgel Bildgebung der geräumten kultivierten Eierstöcke durchgeführt werden kann ohne erheblichen Verlust des Signals, die tief in das Gewebe und die Bilder wie derjenige dargestellt (Abb. 3 b) leicht quantifiziert werden kann. Ein Ansatz zur Quantifizierung der Eizellen in Proben wie diese ist durch die Umwandlung der Z-Stapel-Serie der optischen Abschnitte in eine maximale Intensität Projektion und dann weiter verarbeiten der Datei mit einem Bild-Verarbeitung-Paket. Abbildung 4 und ergänzende Abbildung1 markieren die Schritte verwendet, um die Anzahl der Eizellen in Abb. 3 b zu quantifizieren, mit Fidschi-ImageJ. Zusätzliche Tabelle1 enthält Fidschi-ImageJ Partikel (Eizelle) Quantifizierung. Quantifizierung der Partikel, die mit dieser Methode auch ermöglicht die Analyse der verschiedenen Follikel basierend auf Eizelle Größe, weil Angaben sowohl die Anzahl der Teilchen und den entsprechenden Bereich jedes Partikels ist von der Software berechnet und an die Benutzer.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des gesamten Protokolls. Visuelle Zusammenfassung des Protokolls anfangs mit Dissektion des Eierstocks (1), gefolgt von Eierstock Kultur (2), Gewebe Fixierung mit 4 % PFA (3), Immunostaining mit spezifischen Antikörpern (4), clearing-Gewebe für tiefe imaging (5), die Gewinnung der optischen Abschnitt mit einer Confocal Mikroskop (6) und endend mit Eizelle Quantifizierung (7). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Unterschied im Gewebe Deckkraft zwischen UN-geräumt und geräumten Eierstöcke. (A) Eierstock von einem postnatalen Tag fünf pup ohne zu löschen (links) und nach der milden Reinigung von ca. 1 h (rechts). (B) mehrere Eierstöcke in unmittelbarer Nähe zueinander für sieben Tage kultiviert. Zwei verschiedene Vergrößerungen jeder Probe werden angezeigt. Am weitesten links stehende Bilder sind ohne Reinigung und am weitesten rechts stehende Bilder mit Ausgleich sind. Eierstöcke werden die Membran der Kultur Einlage befestigen und können besser behandelt werden, wenn im gesamten Protokoll beigefügten gehalten. Um den Kontrast des Gewebes für die Bildgebung mit weißem Licht zu verbessern, wurden Eierstöcke in Hämatoxylin für 5 min nach der Fixierung in Wasser getaucht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Immunfluoreszenz Bildgebung UN beräumt und geräumten Eierstöcke. Eierstöcke aus postnatale Tag 5 Welpen waren für 7 Tage kultiviert und gebeizt nach der ganze Berg Immunfluoreszenz Färbeprotokoll beschrieben. Rot dargestellt sind Zellen beschriftet mit Maus Vasa Homolog (MVH), Keimzellen zu identifizieren und in grün Zellen mit dem nuklearen Eizelle-spezifische Marker p63 beschriftet sind. DAPI, war blau, verwendet, um alle Zellkerne zu beschriften. (A) Immunfluoreszenz Bild der Eierstöcke ohne Ausgleich. (B) Immunfluoreszenz Bild der Eierstöcke mit Ausgleich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: visuelle Workflow für wie Eizellen mit Fidschi-ImageJ-Software zu quantifizieren. Um die Datenanalyse zu erleichtern, können Bilder abgeleitet die konfokale Flugzeuge auf eine maximale Intensität Projektion statt ein 3D-Bild reduziert werden. Mit maximaler Intensität Projektion kann der Anwender Bildparameter Schwelle so definieren, dass die Ziel-Partikel deutlich geworden. Sobald das vereinfachte Bild vorliegt, wird die Software verwendet, um die Eizellen zu zählen. Kritische Überprüfung Bilder während der Einstellung der Parameter ist wichtig. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel dafür, wie die Partikel/Eizelle Schwellenwert festgelegt werden kann. Der Text oben jedes Bild zeigt den Parameter verwendet, um das Bild in Fidschi-ImageJ. Die Software erzeugt eine Tabelle mit der Flächenmessung der Partikel (siehe ergänzende Tabelle1). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: Visual Workflow für wie Eizellen mit Fidschi-ImageJ-Software (geringere Vergrößerung) zu quantifizieren. Diese Abbildung zeigt die Eizelle Quantifizierung für zwei Eierstöcke in unmittelbarer Nähe. Die Schritte sind die gleichen wie in Abbildung 4. 2.436 Partikel/Follikel wurden durch die Software gezählt. Quantifizierung Daten aus der Software finden Sie in der zusätzlichen Tabelle1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Zusätzliche Tabelle1: Follikel Quantifizierung von Fidschi-ImageJ berechnet. Diese Tabelle enthält die Liste der gezählten Follikel und den entsprechenden Bereich aus dem Bild in ergänzenden Abbildung1generiert. Die Partikelgröße zur Quantifizierung von 10 µm2eingestellt war-Unendlichkeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Das Studium der Säugetier-Wiedergabe erfordert verwenden und Quantifizierung von spezialisierten Zellen, die nicht routinemäßig Zellkultur zugänglich sind. Ex-Vivo -Kultur-Systeme sind jedoch wirksam am Eierstock und Follikel Lebensfähigkeit1,15beibehalten. Während der Eierstock Kultur erfordert das Gewebe eine größere Fläche für den Austausch von Nährstoffen durch Diffusion. Also, 5 - Tage alten Maus Eierstöcke eignen sich in Größe und Form für Orgel-Kultur. Dieses Protokoll wurde optimiert für Eierstöcke für sieben Tage in Kultur gehalten, aber Eierstock Kultur Länge eingestellt werden, je nach der spezifischen Fragestellung1,4. Vergleichbare Ergebnisse wurden erzielt in Eierstöcke für weniger als drei Tage kultiviert und bis zu zehn Tage (Daten nicht gezeigt), aber Eierstöcke von Tieren, die älter als zehn Tage groß sind und Kultur möglicherweise nicht so wirksam, damit Hervorhebung eine Einschränkung des Protokolls.
Wenn ex Vivo Kultivierung des Eierstocks nicht benötigt wird, ist es möglich, zu beheben und färben ältere Eierstöcke mit dem Protokoll beschrieben, obwohl Änderungen erforderlich ist, um die Anpassung an die größeren Gewebe Größe9,16. Die Färbung Protokoll beschrieben richtet sich auf passive Diffusion der Antikörper in das Organ, was darauf hindeutet, dass es möglich ist, größere Eierstöcke mit entweder länger inkubationsschritte Antikörper oder durch die Partitionierung des Gewebes in einige kleinere Stücke, die zu beflecken nach dem Imaging rekonstruiert werden. Die Verwendung von Harnstoff und Sorbit in den ScaleS(0) clearing Agent bewährt für neonatale kultivierten Eierstöcke, weil es eine kürzere Inkubationszeit als erforderlich berichtet für Clearing Agenten mit Harnstoff und Glycerin (ScaleA2)8,10 . Darüber hinaus die Verwendung von eine geringe Konzentration von Natriumborohydrid (NaBH4) in die Permeabilisierung Lösung verringert Hintergrundgeräusche, und zusammen mit längeren Inkubationen der Proben mit primären und sekundären Antikörper, erleichtert Färbung tief in das Gewebe. Darüber hinaus verhindert die Verwendung von PVA in die Permeabilisierung und Waschlösungen unechte Partikel auf das Gewebe17,18.
In diesem Protokoll werden die Insert-Membran, kultivierten gesunde Eierstöcke beimessen, während ungesunde Eierstöcke Fixierung und Behandlung trennen können. Umgang mit losen Gewebe mit Zangen beschädigen den Eierstock und wahrscheinlich Kompromiss Bildgebung. Alternativ kann lose Gewebe eingebettet in 5 % Agarose Stecker oder mit Transfer Pipetten behandelt, solange die Spitze öffnen breit genug ist, nicht zu beschädigen. Im Hinblick auf Immunostaining andere als die in diesem Protokoll verwendeten Primärantikörper anders ausführen können und Optimierung in die Permeabilisierung und Inkubation Schritte erfordern.
Zu guter Letzt das Protokoll beschreibt einen alternativen Ansatz zur Quantifizierung der Follikel von jungen Eierstöcken im Vergleich zu traditionellen Paraffin eingebettet Schnittserien oder andere zuvor beschriebenen Volumetrische Quantifizierung der Follikel aus ganzen Berg Bilder 5 , 9 , 16. je nach der Forscher Anforderungen, das Verfahren für Eizelle Quantifizierung im Protokoll beschrieben kann auch Characterize Dieverschiedenen follikulären Entwicklung19verwendet. Die Partikel-Bereich durch die Software generiert lässt sich bestimmen den Durchmesser der Zelle und somit folgern follikuläre Phase.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Rebecca Williams und Johanna Dela Cruz von der Cornell-BRC-Imaging und Andrew Recknagel für Anregungen und technische Hilfe. Diese Arbeit wurde auf der National Institutes of Health Zuschuss unterstützt S10-OD018516 (an Cornells Imaging Facility), T32HD057854, J.C.B und R01-GM45415, J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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