Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at kvantificere follikler i kulturperler æggestokkene af unge mus uden seriel skæring. Brug hele orgel immunofluorescens og væv clearing, er fysiske skæring erstattet med optisk skæring. Denne metode til forberedelse af prøver og visualisering fastholder orgel integritet og letter automatiserede kvantificering af specifikke celler.
Abstract
Forskning inden for pattedyr reproduktiv biologi indebærer ofte, vurdere den generelle sundhed i æggestokke og testikler. Specifikt, i kvinder vurderes æggestokkene fitness ofte ved visualisering og kvantificere follikler og oocyter. Fordi æggestokken er en uigennemsigtig tredimensionale væv, kræver traditionelle metoder møjsommeligt udskæring af væv i talrige seriel sektioner for at visualisere celler i hele hele orglet. Desuden, fordi kvantificering af denne metode indebærer typisk, scorede kun et undersæt af de dele, adskilt af en oocyt omtrentlige diameter, det er udsat for unøjagtighed. Her, er en protokol, der beskrevet som i stedet udnytter hele organ væv clearing og immunfluorescens farvning af musen æggestokkene til at visualisere follikler og oocyter. I forhold til mere traditionelle tilgange, denne protokol er en fordel for visualisere celler i æggestokkene af mange årsager: 1) æggestokken forbliver intakt hele prøveforberedelse og behandling; 2) små æggestokke, som er vanskelige at sektion, kan undersøges med lethed; 3) cellulære kvantificering er mere let og præcist opnåede; og 4) hele orglet afbildet.
Introduction
For at studere cellulær sammensætning og morfologiske funktioner af pattedyr æggestokke, afhængige forskere ofte i vivo eksperimenter efterfulgt af immunohistological farvning af paraffin indlejret æggestokke. Mere for nylig om hele æggestokken orgel kultur har vist sig for at være et effektivt alternativ til at studere ovarie funktion1,2,3,4 , fordi teknikken kan være kombineret med bedre visualisering og kvantificering værktøjer. Traditionelt, afhænger analyse af æggestokkene morfologi voldsomme tredimensionale æggestokkene arkitektur fra indlejret serie paraffinsnit, men ud over at være besværlige og tidskrævende, seriefremstillede skæring paraffin indlejret væv ikke garanti for korrekt rekonstruktion af orglet, og sektionerne er ofte tabt eller mis bestilt i processen.
Ud over de tekniske udfordringer forbundet med seriel skæring, er der også forskelle i de metoder, der rutinemæssigt anvendes til at kvantificere follikel numre pr. æggestokken5,6. Den metodologiske variabilitet i øjeblikket anvendes forringer meta-analyse af ovariereserven på tværs af undersøgelser5,7. For eksempel, kan follikel tal fra forskellige forskningsartikler variere ved 10-fold eller mere mellem lignende udviklingsmæssige aldre inden for en bestemt stamme6. Disse store forskelle i rapporterede follikel kvantificering kan føre til forvirring og har hindret cross-undersøgelse sammenligninger. Eksperimentelt, traditionelle tilgange til hårsækken kvantificering fra seriel sektioner er udført ved at tælle follikler af et foruddefineret antal sektioner (fx hver femte, tiende, eller andre afsnit). Variation i hårsækken tæller ved hjælp af denne fremgangsmåde opstår ikke kun fra hyppighed i hvilke afsnit tælles, men også fra variationer i snittykkelse og teknisk erfaring til at generere serielle afsnit5,6. Ud over sin variation er en anden ulempe ved traditionelt væv skæring, skæring af små æggestokke fra unge dyr er især udfordrende og meget afhængige af væv orientering8.
Protokollen nedenfor beskriver et rutinemæssigt anvendes æggestokken kultur teknik1 men i høj grad forbedrer efter traditionelle follikel kvantificering ved at erstatte fysisk skæring med væv clearing og optisk kontinuerlig skæring ved hjælp af Konfokal mikroskopi8 ,9. Clearing ved hjælp af væv nedsænkning (uden brug af transkranial perfusion eller elektroforese) i en urea - og sorbitol-baseret løsning (f.eks. ScaleS(0)10) viste sig at være forenelig med immunfarvning og tilladt til reduktion af clearing tid uden at kompromittere dybde af billedbehandling. Andre rapporterede metoder (fx, ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, og ClearT212) er enten mere tid forbruge eller Tillad ikke dybdegående optisk opløsning af prøven. Optisk skæring er fordelagtig, fordi det er mindre arbejdsintensive og vedligeholder orglet tredimensionale arkitektur7,8. En anden fordel ved denne tilgang er, at forberedelsen af prøverne ikke kræver dyre reagenser til at klare væv og kan udføres med relativ lethed.
Specifikt, protokollen beskrevet er blevet optimeret til kulturperler mus æggestokkene på postnatal dag fem men er blevet gennemført på æggestokkene spænder fra postnatal dag 0 - 10. Metoden gør brug af en æggestok kultur system som vævet naturligvis tillægger membranen som, det er kulturperler, lette orgel håndtering og manipulation. Kultur-systemet beskrevet kan bruges til at opretholde eksplanterede æggestokkene i op til 10 dage og at vurdere, hvordan forskellige eksperimentelle betingelser kan forstyrre oocyt overlevelse13. Kvantificering proceduren udføres ved hjælp af den ikke-kommercielle billedbehandling pakke FIJI-ImageJ14 og kan udføres på de fleste pc'er. Desuden kan billeder, der bruges til kvantificering gøres alment tilgængelig for det videnskabelige samfund, således at fremtidige meta-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cornell Universitys institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) har godkendt alle de metoder, der beskrives her, under protokollen 2004-0038 til JCS.
1. fremstilling af instrumenter og kultur medier
- Tørre arbejdsområdet rent med 10% blegemiddel og tillade blegemiddel til at forblive på området bordpladen i mindst 5 min. Efter 5 min, Fjern den overskydende blegemiddel med rene papirservietter og 70% ethanol (EtOH). Ren dissekere mikroskopet grundigt med 70% EtOH.
Bemærk: Det er vigtigt, at arbejdsområdet mindst semi-sterile at undgå kontaminering af orgel kulturer. - Wrap ren pincet og saks med et stykke køkkenrulle fugtet med 70% EtOH indtil brug.
Bemærk: De ideelle dissektion værktøjer kan variere alt efter alder/størrelse i æggestokkene. Bedste resultater er opnået ved hjælp af en skarp mikro dissekere saks, to fin spids pincet (enten nummer 5 eller 55) og en micro dissekere iris saks. - I en konisk slange, gøre 50 mL af æggestokken dyrkningsmedier og varme i et 37 ° C vandbad.
- For at gøre æggestokken næringssubstratet4, supplere 1 x Minimal Essential medier (MEM) med 10% føtal bovin Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 100 enheder/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 0,25 µg/mL Amphotericin B (f.eks. 45 mL af MEM, 5 mL af varme inaktiveret FBS, 1,25 mL af HEPES og 0,5 mL af 100 x bestanden af penicillin, streptomycin og Amphotericin B).
- Forberede plader og skær før æggestokken kultur.
- I en vævskultur hætte, der tilsættes 1 mL af æggestokken næringssubstrat til en 35 mm vævskultur plade.
- Før sættetid indsætte membran med substratet. Tilføje tilstrækkelig medier, normalt omkring 0,55 mL pr. godt, at 24-godt carrier vævskultur plade og sted en cellekultur indsætte i brønden. Sørg for at indsætte membran berører medierne.
- Forberede antallet af 35 mm plader og brønde med celle kultur indsætter efter det forventede antal af æggestokkene i eksperimentet. Placer 35 mm plader der indeholder 1 mL af dyrkningsmedier og 24-godt carrier pladen som indeholder dyrkningsmedier og indsætter i et 37 ° C, 5% CO2og atmosfæriske O2 inkubator.
- Arrangere en varmeplade ved siden af dissektion anvendelsesområde og Indstil temperaturen til 37 ° C. Holde et 37 ° C, 5% CO2 og atmosfæriske O2 rugemaskine er tæt på dissektion værelse.
2. æggestokken dissektion og orgel kultur
Bemærk: Æggestokkene kan dissekeret ved stuetemperatur, så længe eksponeringen for ikke-ideelle temperatur er minimal.
- Aflive de kvindelige mus på postnatal dag 5, ved halshugning, en ad gangen.
Bemærk: Aktiv dødshjælp skal foretages ifølge IACUC retningslinjer til stede på det facilitet, hvor forskningen udføres. - Spray dyret med 70% EtOH. Placere dyr på toppen af et tørt stykke køkkenrulle mikroskopet dissektion. Placer en 35 mm vævskultur parabol indeholdende æggestokken Kulturmedier tæt på dissektion mikroskop.
- Med pincet eller en mikro dissektion iris saks, gøre et snit gennem huden af dyret og ind i bughulen, ved hjælp af forsigtighed ikke for at skære i tarmene. Skubbe tarmen ud af bughulen og Find æggestokkene. Uddrag æggestokkene og placere dem i 35-mm vævskultur skål indeholdende dyrkningsmedier.
- Når æggestokkene er blevet dissekeret fra dyret, øge forstørrelsen af dissektion mikroskop for at bedre visualisere æggestokke og eventuelle vedlagte væv. Med ren fin spids pincet, fjerne alle ikke-æggestokkene væv, såsom bursa og fedtvæv. Vær omhyggelig med at holde æggestokkene intakt, når du fjerner den vedlagte ikke-æggestokkene væv.
- Når æggestokkene er isoleret, placere parret i pre gennemblødt celle kultur skær af carrier 24-godt plade (Se trin 1.4.2 og 1.4.3) og justere lydstyrken på middel til at sikre, at det er tilstrækkeligt til at holde orglet fugtig (uden helt nedsænkning det).
Advarsel: Pas på ikke at stikke et hul i membranen af cellen kultur Indsæt ved overførsel af æggestokkene. - Eksplanterede sted organer i et 37 ° C, 5% CO2og atmosfæriske O2 inkubator.
- Gentag trin 2.1-2.6 indtil æggestokkene af hvert dyr er dissekeret og placeret på cellekultur indsætte af 24-godt plade der indeholder æggestokken næringssubstratet.
- Skift æggestokken næringssubstratet hver 2 dage, ved hjælp af varmede æggestokken media delprøver fra et 37 ° C vandbad og gå videre til Del3 af protokollen for den ønskede eksperimentelle tidspunkt.
3. Vævscentre fiksation
- I en 15 mL konisk slange, forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (fx, tilsættes 2 mL af 16% PFA elektronmikroskopi grade 6 ml 1 x PBS).
Forsigtig: PFA er et farligt stof og skal håndteres under en kemisk hætte. - Fix kulturperler æggestokkene, uden at fjerne væv fra kultur-Indsæt, ved at dække væv med frisklavede 4% PFA løsning. Forsegle kanterne af pladen med plast klæbende (for at undgå fordampning) og placere prøverne ved 4 ° C natten over.
Bemærk: For at lette håndteringen og væv integritet, undgå at fortrænge æggestokke fra celle kultur Indsæt under hele proceduren. Kulturperler æggestokkene knyttet til overfladen af insertet er fordelagtige for håndtering uden at beskadige eller miste orgel. - Skyl væv 3 x med 70% EtOH og enten gå videre til trin 4.1 eller butik det i scintillationshætteglas fyldt med 70% EtOH ved 4 ° C indtil videre forarbejdning.
Bemærk: Hvis du bruger væv endogent udtrykker fluorescerende proteiner, opbevaring af prøver med 70% EtOH kan i høj grad reducere signalet. Alternativt kan væv skylles og gemt i PBS med 0,2% natriumazid (NaN3). NaN3 er imidlertid stærkt giftige og udgør en fare for alvorlig indånding. Gøre stamopløsningen i stinkskab og håndtere iført passende personlige værnemidler som et laboratorium frakke og nitril handsker.
4. hele Mount immunfluorescens
- Placer den faste væv i 1 x PBS på RT for et minimum af 4 h før permeabilization trin 4.3.
- Forberede permeabilization løsning og blokerende løsning.
- Forberede permeabilization løsning som beskrevet. 1 x PBS, tilføje 0,2% polyvinylalkohol (PVA), 0,1% natrium ved (Kristian4) løsning (fra 12 wt.% i 14 M natriumhydroxid (NaOH)) og 1,5% polyethylen glycol tert -octylphenyl ether (nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel). I en 50 mL konisk rør, tilføje 5 mL 10 x PBS, 0,1 g af PVA, 50 µL af Kristian4og 750 µL nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel, hvorefter der tilsættes ultrarent vand op til 50 mL og agitere godt ved stuetemperatur indtil blandingen er helt i opløsning.
- Forberede blokerende løsning som beskrevet. Til 1 x PBS, tilføje 0,1% nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel, 0,15% af 2,5 M Glycin pH 7,4, 10% normal ged serum, 3% bovint serumalbumin (BSA), 0,2% NaN3, 100 enheder/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL Amphotericin B. forberede en stamopløsning af 2.5 M Glycin ved at opløse 93,8 g af glycin i ultrarent vand til en 500 mL endelige rumfang (pH 7,4) og en stamopløsning af 10% NaN3 ved at opløse 5 g i 50 mL i ultrarent vand; derefter, i en 50 mL konisk slange forberede den blokerende løsning ved at tilføje 5 mL 10 x PBS, 50 µL nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel, 750 µL af glycin stamopløsning, 5 mL af ged serum, 1,5 g af BSA, 1 mL af stamopløsningen NaN3 , og 0,5 mL af 100 x bestanden af penicillin, streptomycin og Amphotericin B. Tilføje ultrarent vand op til en endelige rumfang 50 mL og sprøjte filter den endelige løsning.
- Fjern og kassér 1 x PBS fra hætteglasset, og derefter tilføje nok permeabilization løsning for at helt nedsænkes æggestokkene. Prøven anbringes i permeabilization løsning på en orbitalryster (f.eks. nutator) ved stuetemperatur i 4 timer.
Bemærk: Inkubationstiden kan variere alt efter orgel tykkelse. - Erstatte permeabilization løsningen med nok blokerende løsning til helt nedsænkes æggestokkene. Forsegle hætteglas med plast limen og forlade væv inkubere i mindst 12 timer ved stuetemperatur på en orbitalryster.
- Forberede primære antistof fortynding i blokerende løsning ifølge producentens datablad.
Bemærk: Bemærk, at ikke alle antistoffer er forenelige med clearing agent. Den gennemsnitlige mængde nødvendige pr. sample er ca 750 µL.- For oocyt kvantificering, brug TAp63 (nuklear oocyt markør) og MVH (cytoplasmatisk kønscelle markør).
Bemærk: Antistoffer bruges i immunofluorescens billeder er musen anti-p63 og kanin anti-MVH). Den primære antistof løsning kan være genbrugt 2 x eller mere hvis opbevares ved 4 ° C mellem farvning protokoller og håndteres korrekt for at undgå bakterievækst.
- For oocyt kvantificering, brug TAp63 (nuklear oocyt markør) og MVH (cytoplasmatisk kønscelle markør).
- Placere indsatsen indeholdende væv i en 24-godt plade og tilføje omkring 750 µL af primære antistof løsning. Sikre, at æggestokkene er helt neddykket. Forsegle pladen med plastik klæbestof til at minimere fordampning og forlade væv inkubere i 4 dage ved stuetemperatur på en orbitalryster.
- Forberede vask løsning.
- Forberede vask løsning som beskrevet. Gøre 1 x PBS, tilføje 0,2% PVA og 0,15% nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel. I en 50 mL konisk rør, tilføje 5 mL 10 x PBS, 0,1 g af PVA, 75 µL af nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel og ultrarent vand op til en endelige rumfang paa 50 mL.
- Fjern primære antistof fortynding og tilsæt en generøs mængde af vask løsning. Sørg altid for at oversvømme æggestokkene. Tillad æggestokkene til at suge i løsningen natten over ved stuetemperatur på en orbitalryster.
- Erstatte vask løsning og Ruger på orbitalryster i 2 timer eller mere.
- Gentag trin 4.9 en ekstra gang.
- Forberede sekundær antistof fortynding i blokerende løsning.
Bemærk: De sekundære antistoffer bruges er anti-mus 488 fluorescerende farvestof rejst i ged og anti-kanin 594 fluorescerende farvestof rejst i ged. Se trin 4.5. for den gennemsnitlige mængde nødvendige pr. prøve. - Fjern vask løsning fra æggestokkene og tilføje sekundær antistof løsning. Beskytte prøverne fra lys (wrap plade med alufolie) og forsegle pladen med plastik klæbestof at minimere fordampning. Inkuber prøver på en orbitalryster ved stuetemperatur i 2 dage.
NOTE: Fortsat at beskytte prøverne fra lys ved hjælp af aluminiumsfolie under alle efterfølgende inkubation trin. - Fjerne sekundær antistof løsning fra prøverne og tilføje vask løsning. Ruger på en orbitalryster for 8 h.
Bemærk: Hvis 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning ønskes, tilføje 50 ng/mL for DAPI til den første vask trin (~ 8 h inkubation). - Erstatte vask løsning for en overnight vask.
- Samtidig med at forberede clearing løsning (Se afsnit 5), erstatte natten vask løsning med frisk løsning og holde prøver på en orbitalryster ved stuetemperatur.
5. æggestokken Clearing og billedbehandling
- Forberede ScaleS(0) clearing løsning.
- Forberede ScaleS(0) clearing løsning10 ved at tilføje reagenser i en given andel: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glycerol, 4,3 M urinstof og 20% dimethylsulfoxid (DMSO), pH 8.1 (f.eks. i en 50 mL konisk rør, tilføje 2,5 mL glycerol, sorbitol. 10 g , 5 mL af DMSO og 12 mL af 9 M urinstof for en samlet maengde paa 25 mL. Bland løsning af inversion ved 50 ° C i 30 min og degas inden anvendelse.)
- Fjerne vask løsning og nedsænkes prøver i clearing løsning. For bedre resultater opretholde prøver på en orbitalryster.
- Erstatte clearing løsning 2 x dagligt indtil vævet bliver gennemsigtige (ca. 2 dage).
- Når vævet er ryddet, forberede prøven for billeddannelse ved omhyggeligt at fjerne Indsæt membranen indeholdende kulturperler æggestokkene med en fin spids skalpel og placere den på et glas dias.
- Fortsæt til imaging prøver på en i stand til at skære-optisk mikroskop.
6. oocyt kvantificering
Bemærk: Der er mange forskellige edb-programmer, der er i stand til at kvantificere celler. Beskrevet nedenfor er en protokol til oocyt kvantificering ved hjælp af ikke-kommercielle image processing pakke, FIJI-ImageJ14.
- Ved hjælp af en fladtrykt maksimal intensitet projektion af Z -stakken billede serie til de specifikke cellulære markører af interesse (uden DAPI kanal), konvertere billedet til en sort og hvid 8-bit billede under Type i billed henlægge-nede menuen.
- Under rullemenuen billede fremhæve fanen justering og Marker tærskel.
- Manuelt justere tærskel til et niveau, der bedst identificerer hver enkelte oocyt. Når det er fastsat, skal du klikke på Anvend for at generere et sort-hvidt billede. Når først færdig, kvantificere prøven af opridser ved hjælp af ikonet ovale eller Freehand .
Bemærk: FIJI-ImageJ har forskellige muligheder for at finindstille det billede, der skal bruges til partikel kvantificering. For eksempel i processen | Binære tab, der er forskellige muligheder, der kan bruges til at forbedre påvisningen af hvad vil blive talt. I figur 4var de indstillinger, der bruges til bedre individualisere follikler Eroder, efterfulgt af fylde huller, og endelig vandskel. - Vælg analyser partiklerunder rullemenuen analyser . Angiv parametrene ifølge den ønskede opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol indeholder 6 store skridt efter dissektion af æggestokkene, som skitseret i figur 1. Figur 2 , Figur 3 , Figur 4 fremhæver de mest roman funktioner af denne protokol, som omfatter optimering af væv clearing til æggestokkene og hele væv oocyt kvantificering ved hjælp af FIJI-ImageJ. Figur 2A viser billeder af en ukultiveret 5-dages postnatal bestemt æggestok før (venstre) og 1 h efter (højre) tilføjer clearing løsning til æggestokkene. Æggestokken vil begynde at blive gennemsigtigt inden for minutter efter at være neddykket i clearing løsning. Når ryddet, blive små æggestokkene som afbildet i figur 2A vanskeligt at håndtere uden at beskadige. Derfor er arbejder med kulturperler eksplanterede æggestokkene fordelagtigt fordi de blive knyttet til den porøse overflade af Indsæt membranen som de er kulturperler. Fastgørelse af æggestokken til Indsæt membran giver eksperimentatoren at håndtere membran Indsæt snarere end æggestokkene sig (figur 2B og figur 3). Også, æggestokkene kulturperler i umiddelbar nærhed af vil sammensmelte og figur 2B viser knyttet sammenvoksede æggestokkene før (venstre) og efter clearing (til højre) på hæmatoxylin farves prøver.
Udfører den optiske skæring af kulturperler æggestokke uden clearing er muligt; dog celler dybt inde i vævet har et signal, der er vanskelig at skelne fra baggrunden og denne mangel på klart signal hindrer ordentlig oocyt kvantificering (figur 3A). I modsætning til figur 3Aer figur 3B et repræsentativt billede af en ryddet prøve hvor oocyt kvantificering i hele hele orglet er muligt. Figur 3B viser, at hele orgel billeddannelse af ryddet kulturperler æggestokkene kan gennemføres uden betydelige tab af signal dybt i væv og billeder, såsom den ene vist (figur 3B) let kan kvantificeres. En metode til kvantificering af oocytter i prøver som disse er ved at omdanne Z-stakken serie af optiske dele til en maksimal intensitet projektion og derefter yderligere behandling af filen med et image processing pakke. Figur 4 og supplerende figur 1 fremhæve trin bruges til at kvantificere antallet af oocytter i figur 3B ved hjælp af FIJI-ImageJ. Supplerende tabel 1 omfatter FIJI-ImageJ partikel (oocyt) kvantificering. Kvantificering af partikler ved hjælp af denne metode også giver mulighed for analyse af forskellige follikler baseret på oocyt størrelse, fordi oplysninger om både antallet af partikler og det tilsvarende område af hver partikel er beregnet af softwaren og leveres til den bruger.
Figur 1: skematisk fremstilling af den hele protokol. Visuel oversigt over protokollen begyndelsen med dissektion af æggestok (1), efterfulgt af æggestokken kultur (2), væv fiksering med 4% PFA (3), immunfarvning ved hjælp af specifikke antistoffer (4), clearing væv til dybe imaging (5), opnåelse af den optiske afsnit ved hjælp af en Konfokal mikroskop (6) og slutter med oocyt kvantificering (7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forskel i væv opacitet mellem un-ryddet og ryddet æggestokke. (A) æggestokken fra en postnatal dag fem pup uden clearing (venstre) og efter mild clearing af omkring 1 h (højre). (B) flere æggestokkene kulturperler i umiddelbar nærhed af hinanden i syv dage. To forskellige forstørrelser af hver prøve er vist. Længst til venstre billeder er uden udredning og længst til højre billeder er med clearing. Æggestokkene vil knytte til membranen af kultur-Indsæt og bedre kan håndteres, hvis holdt vedlagte overalt i protokollen. For at forbedre kontrasten af væv til billeddannelse ved hjælp af hvidt lys, blev æggestokkene nedsænket i hæmatoxylin for 5 min efter fiksering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: immunofluorescens billeddannelse af un-ryddet og ryddet æggestokke. Æggestokkene fra postnatal dag 5 unger var kulturperler i 7 dage og farves efter hele mount immunofluorescens farvning protokollen beskrevet. Vist med rødt er celler mærket med musen vasa homolog (MVH) at identificere kønsceller og i grøn er celler mærket med den nukleare oocyt-specifikke markør, p63. DAPI, blev i blå, brugt til at mærke alle cellekerner. (A) immunofluorescens billede af æggestokkene uden clearing. (B) immunofluorescens billede af æggestokkene med clearing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: visuel arbejdsgang for hvordan man kan kvantificere oocyter bruger FIJI-ImageJ software. For at lette dataanalyse, kan billeder stammer fra de Konfokal fly reduceres til en maksimal intensitet projektion i stedet for en 3D-billede. Med den maksimale intensitet projektion, kan brugeren definere billede tærskel parametre på en sådan måde, at målet partikler bliver tydelig. Når den forenklede billede er opnået, bruges softwaren til at tælle oocyter. Kritisk undersøge billeder samtidigt med at nedgang parametrene er afgørende. Denne figur viser et eksempel på hvordan partikel/oocyt tærskel kan indstilles. Teksten over hvert billede fremhæver parameteren bruges til at få dette billede i FIJI-ImageJ. Softwaren genererer en tabel med området måling af partikler (Se supplerende tabel 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: visuel arbejdsgang for hvordan man kan kvantificere oocyter bruger FIJI-ImageJ software (lavere forstørrelse). Denne figur viser oocyt kvantificering for to æggestokke i umiddelbar nærhed. Trin udføres er det samme som i figur 4. 2.436 partikler/follikler blev talt af softwaren. Kvantificering data indhentet fra software kan findes i supplerende tabel 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: follikel kvantificering beregnes af FIJI-ImageJ. Denne tabel indeholder en liste over optalte follikler og det tilsvarende område genereret fra billedet i supplerende figur 1. Partikelstørrelse bruges til kvantificering blev sat fra 10 µm2-infinity. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af pattedyr reproduktion kræver hjælp og kvantificere specialiserede celler, der ikke er rutinemæssigt indstillet til cellekultur. Men ex vivo kultur systemer er effektive på at opretholde en æggestok og follikel levedygtighed1,15. Under æggestokken kultur kræver vævet et større areal til udveksling af næringsstoffer gennem diffusion. Derfor, 5 - dages gammel mus æggestokkene er ideelle i størrelse og form for orgel kultur. Denne protokol var optimeret til æggestokkene opretholdt i syv dage i kultur, men æggestokken kultur længde kan tilpasses specifikke videnskabelige spørgsmål1,4. Sammenlignelige resultater har opnået i æggestokkene kulturperler for så lidt som tre dage, og så længe som 10 dage (data ikke vist), men æggestokke fra dyr, der er ældre end ti dage er store og kultur kan ikke være så effektiv, hvilket understreger en begrænsning af protokollen.
Hvis ex vivo dyrkning af æggestokken ikke er nødvendigt, er det muligt at fastsætte og plette ældre æggestokkene med protokollen beskrevet, selv om modifikationer muligvis er nødvendige til at tilpasse sig de større væv størrelse9,16. Farvning protokollen beskrevet afhænger passiv diffusion af antistoffer i orgel, som angiver, at det kan være muligt at plette større æggestokkene med enten længere antistof inkubation trin eller ved partitionering vævet i par mindre stykker, der kan rekonstrueres efter billeddannelse. Brug af urinstof og sorbitol i den ScaleS(0) clearing agent vist sig effektiv til neonatal kulturperler æggestokkene, fordi det krævede en kortere inkubationstid end dem, der rapporterede for clearing agenter med urinstof og glycerol (ScaleA2)8,10 . Desuden brug af en lav koncentration af natriumborhydrid (Kristian4) i permeabilization løsningen faldt baggrundsstøj, og sammen med længere inkubationer prøver med primære og sekundære antistoffer, lettet farvning dybt inde i vævet. Derudover forhindrer brugen af PVA i permeabilization og vask løsninger spurious partikler klistrer til væv17,18.
I denne protokol, vil kulturperler sund æggestokkene tillægger Indsæt membran, mens usunde æggestokkene kan løsne sig fra det efter fiksering og håndtering. Håndtering løs væv med pincet vil skade æggestokkene og sandsynlige kompromis billeddannelse. Alternativt kan løs væv indlejret i 5% Agarosen stik eller håndteres med overførsel pipetter så længe spidsen åbning er bred nok til ikke at beskadige den. Med hensyn til immunfarvning, primære antistoffer end dem, der anvendes i denne protokol kan udføre anderledes og kan kræve optimering i permeabilization og udrugning trin.
Endelig protokollen beskrives en alternativ indfaldsvinkel mod kvantificering follikler fra unge æggestokkene i forhold til traditionelle indlejret serie paraffinsnit eller andre tidligere beskrevet volumetriske kvantificering af follikler fra hele mount billeder 5 , 9 , 16. afhængigt af forskers krav, proceduren for oocyt kvantificering beskrevet i protokollen kan også være brugt characterize forskellige stadier af follikulære udvikling19. Området partikel genereret af softwaren kan bruges til at bestemme den celle diameter og dermed udlede follikulære fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Rebecca Williams og Johanna Dela Cruz fra Cornell BRC Imaging og Andrew Recknagel for nyttige forslag og teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet til nationale kontorer i sundhed grant S10-OD018516 (til Cornell's Imaging facilitet), T32HD057854 til J.C.B. og R01-GM45415 til J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
