Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.
Abstract
המחקר בתחום הביולוגיה הרבייה יונקים כרוך לעתים קרובות הערכת הבריאות הכללית של השחלות, האשכים. באופן ספציפי, אצל נקבות, כושר השחלות הוא לעיתים קרובות לאומדן להמחיש וכימות זקיקים ו- oocytes. מכיוון השחלה רקמות תלת מימדי אטום, הגישות המסורתיות דורשים בעמל רב חותך את הרקמה למקטעים טורי רבות כדי להמחיש תאים לאורך האיבר כולו. יתר על כן, מכיוון כימות בשיטה זו בדרך כלל כרוכה מניה רק ערכת משנה של המקטעים מופרדים על-ידי הקוטר המשוער של oocyte, זה נוטה דיוקים. כאן, פרוטוקול המתואר במקום מנצל כל האיבר רקמות סליקה ו- immunofluorescence מכתים של השחלות העכבר כדי להמחיש זקיקים ו- oocytes. לעומת גישות מסורתיות יותר, פרוטוקול זה יש יתרון להמחשת תאים בתוך השחלה מסיבות רבות: 1) השחלה נשאר שלם במהלך הכנת הדוגמא ועיבוד; 2) שחלות קטן, אשר קשה למקטע, תוכל להיבדק בקלות; 3) כמת סלולריים מושגת בקלות רבה יותר ובאופן מדויק; . ו-4) כל האיבר עם תמונה.
Introduction
ללימוד הרכב הסלולר ואת תכונות מורפולוגיות של השחלות יונקים, מדענים לעיתים קרובות לסמוך על ויוו ניסויים ואחריו immunohistological מכתים פרפין מוטבע השחלות. נוסף לאחרונה אף, השחלה כל איבר תרבות הוכיחה להיות חלופה יעילה ללמוד תפקוד השחלות1,2,3,4 , כי הטכניקה יכולה להיות בשילוב עם כאחראית ו כימות כלים. באופן מסורתי, ניתוח של מורפולוגיה השחלות תלוי בשחזור אדריכלות השחלות תלת מימדי ממקטעים טורי פרפין מוטבע, אבל, בנוסף להיותו מפרך, זמן רב, באופן סדרתי חלוקתה פרפין מוטבע רקמות לא ערובה שחזור נכונה של האיבר, סעיפים לעיתים קרובות אבדו או הורה בזיהוי שגיאות בתהליך.
בנוסף האתגרים הטכניים הקשורים עם חלוקתה טורי, ישנם גם וריאציות של השיטות בשימוש שגרתי לכמת זקיק מספרים לאדם שחלה5,6. ההשתנות מתודולוגי בשימוש כיום פוגע מטא אנליזה של השחלות מילואים לאורך הלימודים5,7. לדוגמה, זקיק מספרים מתוך מאמרי מחקר שונים יכול להשתנות על ידי 10-fold או יותר בין הגילאים התפתחותית דומה בתוך זן ספציפי6. אלה הבדלים גדולים כימות שדווחה זקיק יכול להוביל לבלבול, יש הפריע קרוס-לימוד השוואות. השפעול, גישות מסורתיות זקיק כימות ממקטעים טורי מבוצעות על ידי ספירת זקיקים של מספר סעיפים מוגדרים מראש (למשל, החלטה, העשירי, או מקטע אחר). השתנות בתוך זקיק ספירות באמצעות גישה זו מתעוררת לא רק בשל את תקופתיות ב אילו מקטעים נספרים אלא גם וריאציות עובי סעיף ב, ניסיון טכני ביצירת המקטעים טורי5,6. בנוסף ההשתנות שלו, חיסרון נוסף של רקמה מסורתית חלוקתה היא כי חלוקתה של השחלות קטן מבעלי חיים צעירים הוא מאתגר במיוחד, תלויים במידה רבה רקמות התמצאות8.
פרוטוקול שלהלן מתאר את טכניקת תרבות1 שחלה בשימוש שגרתי אך הוא משפר באופן משמעותי על כימות זקיק מסורתי על ידי החלפת חלוקתה פיזי ברקמות ניקוי ואת חלוקתה אופטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית8 ,9. ניקוי באמצעות רקמות טבילה (ללא צורך זלוף טראנס או אלקטרופורזה) ב שתנן בסורביטול מבוססות פתרון (למשל, ScaleS(0)10) הוכיח תואם immunostaining ואת המותר עבור הפחתת ניקוי זמן מבלי להתפשר על עומק הדמיה. שיטות אחרות (למשל, ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12ו- ClearT212) הם גם יותר זמן רב או אל תאפשר מעמיק רזולוציה אופטית של המדגם. חלוקתה אופטי הוא יתרון, כי זה פחות עמל רב ומתחזק של האיבר ארכיטקטורה תלת מימדי7,8. יתרון נוסף של גישה זו היא הכנת הדגימות לא דורשת ריאגנטים יקר כדי לנקות את הרקמה והוא יכול להתבצע בקלות יחסית.
באופן ספציפי, הפרוטוקול המתואר מוטבה עבור העכבר בתרבית השחלות ביום כמחנכת חמש, אבל התנהל על השחלות החל כמחנכת יום 0 - 10. השיטה עושה שימוש במערכת התרבות שחלה בו הרקמה באופן טבעי מייחסת הקרום שעליו זה הוא תרבותי, הקלת איברים טיפול ומניפולציה. מערכת התרבות תיאר יכול לשמש כדי לשמור על השחלות explanted עד 10 ימים, כדי להעריך כמה תנאים ניסיוני עלולים להפריע oocyte הישרדות13. ההליך כימות המתואר מתבצע באמצעות התמונה מסחרי עיבוד החבילה פיג'י-ImageJ14 , יכול להתבצע על רוב המחשבים האישיים. יתר על כן, התמונות המשמשות על כימות יהיה זמין נרחב עבור הקהילה המדעית, ובכך מאפשר עבור העתיד מטא אנליזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אוניברסיטת קורנל של טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) אישר את כל השיטות המתוארות כאן, תחת פרוטוקול 2004-0038 למטות.
1. הכנת כלי נגינה ומדיה תרבות
- לנגב אזור עבודה נקי עם 10% מלבין ולאפשר האקונומיקה להישאר על משטח אזור העבודה לפחות 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את עודף אקונומיקה עם מגבות נייר נקי ו-70% אתנול (EtOH). לנקות את המיקרוסקופ ויבתר ביסודיות עם 70% EtOH.
הערה: חשוב כי אזור העבודה להיות לפחות חצי סטרילי כדי למנוע זיהום של תרבויות איברים. - לעטוף נקי מלקחיים ומספריים במגבת נייר לחה עם 70% EtOH עד למועד השימוש.
הערה: כלי ניתוח אידיאלי עשוי להשתנות לפי מידת/הגיל של השחלה. התוצאות הטובות ביותר מתקבלים באמצעות אחת חדה מיקרו ויבתר מספריים, עצה בסדר שני מלקחיים (או מספר 5 או 55) ומיקרו אחד לנתח מספריים איריס. - צינור חרוטי, ודא 50 מ של השחלה תרבות המדיה וחמים באמבט מים 37 º C.
- כדי להפוך את השחלה תרבות בינוני4, תוספת 1 x תקשורתי חיוני מזערי (מאמ) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 25 מ מ (-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה (HEPES), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 0.25 µg/mL המפוטריצין (למשל, 45 מ ל גברתי, 5 מ של חום להשבית FBS, 1.25 מ של HEPES ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס).
- להכין צלחות מוסיף לפני התרבות השחלה.
- בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 1 מ"ל של השחלה תרבות בינוני צלחת תרביות רקמה 35 מ מ.
- להשרות טרום הכנס רפידה עם המדיום תרבות. הוסף מדיה מספיקה, בדרך כלל בערך 0.55 מ"ל לכל, צלחת תרביות רקמה מנשא טוב 24 והמקום תרבות תא להוסיף בתוך הבאר. ודא ממברנה שתותב נוגע לתקשורת.
- הכן את מספר צלחות 35 מ מ ווולס עם תא מוסיף תרבות לפי המספר הצפוי של השחלות לניסוי. מקם את הצלחות 35 מ מ המכיל 1 מ"ל הלוח המוביל 24-ובכן המכיל מוסיף 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O ומדיה תרבות ומדיה תרבות.
- לארגן צלחת חמה ליד הטווח לנתיחה והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס. שמור של 37 ° C, 5% CO2 והוא החממה באטמוספירה של2 O קרוב לחדר ניתוח.
2. השחלה לנתיחה ותרבות איברים
הערה: השחלות יכול להיות גזור בטמפרטורת החדר כל עוד החשיפה הטמפרטורה לא אידאליות הוא מינימלי.
- המתת חסד העכברים נקבה ביום אחרי לידה 5, על-ידי עריפת ראש, אחד בכל פעם.
הערה: המתת חסד להתבצע בהתאם להנחיות IACUC נוכח המתקן שבו מתבצע המחקר. - לרסס את החיה עם 70% EtOH. מקם את החיה על מגבת נייר יבש מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. מניחים צלחת תרביות רקמה 35 מ מ המכיל השחלה מדיה תרבות קרוב המיקרוסקופ לנתיחה.
- בעזרת מלקחיים או ניתוח מיקרו איריס מספריים, לעשות חתך דרך העור של החיה, לתוך חלל הבטן, באמצעות התראה לא לחתוך לתוך המעיים. לדחוף את המעיים מתוך חלל הבטן ואתר השחלות. לחלץ את השחלות, למקם אותם לתוך המנה תרביות רקמה 35 מ מ המכיל תרבות המדיה.
- ברגע השחלות יש כבר גזור מן החיה, להגדיל את דרגת ההגדלה של מיקרוסקופ לנתיחה כדי להמחיש השחלות ואת כל הרקמה המצורפת. עם לנקות עצה בסדר מלקחיים, להסיר את כל הרקמות ללא השחלות, בורסה ו רקמות שומן. להיות זהירים כדי להשאיר את השחלות ללא שינוי בעת הסרת הרקמה ללא השחלות המצורפת.
- לאחר השחלות מבודד, למקם את הזוג הכיסויים התרבות תאים טרום רטוב של צלחת 24-ובכן המוביל (עיין שלבים 1.4.2 ו 1.4.3) ולכוונן את העוצמה של המדיום כדי להבטיח כי זה מספיק לשמור את האיבר לחות (ללא לחלוטין השוקע זה).
זהירות: היזהרו לא דקרו הממברנה של התא הקדמי תרבות בעת העברת השחלות. - המקום explanted איברים 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O.
- חזור על שלבים 2.1-2.6 עד השחלות של כל בעל חיים גזור והניח על התרבות התא הכנס של צלחת 24-ובכן המכיל המדיום תרבות השחלה.
- שינוי המדיום תרבות השחלה כל יומיים, באמצעות חימם השחלה מדיה aliquots מ באמבט מים 37 ° C והמשך חלק 3 של הפרוטוקול בנקודת הזמן ניסיוני הרצויים.
3. רקמות קיבוע
- צינור חרוטי 15 מ"ל, להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (למשל, להוסיף 2 מ"ל של 16% PFA מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה 6 מ של PBS 1 x).
התראה: PFA הוא חומר מסוכן ויש לטפל ברדס כימי. - לתקן את השחלות בתרבית, מבלי להסיר את הרקמה מהמכסה התרבות, על ידי כיסוי הרקמה עם הפתרון PFA הטרי של 4%. לאטום את הקצוות של הצלחת עם דבק פלסטיק (כדי למנוע אידוי) מקום הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: על מנת להקל על הטיפול ושלמות הרקמות, להימנע ועקרו מבתיהם השחלות מהמכסה התרבות התא לאורך ההליך כולו. בתרבית מצורף אל פני השטח של הקדמי שהשחלות יתרון לטיפול ללא גרימת נזק או אובדן איבר המין. - לשטוף את הרקמה 3 x עם 70% EtOH ולאחר מכן המשך לשלב 4.1 או חנות זה נצנוץ הבקבוקונים מלאים 70% EtOH ב 4 ° C עד יותר עיבוד.
הערה: אם באמצעות רקמות endogenously המבטאים חלבונים פלורסנט, אחסון הדגימות עם 70% EtOH ייתכן מאוד לצמצם את האות. לחלופין, רקמות יכול להיות לשטוף ומאוחסנים מגניב עם אזיד הנתרן 0.2% (נאן3). נאן3 , אולם הוא רעיל מאוד מהווה סיכון רציני אינהלציה. להפוך את הפתרון מניות בשכונה fume וטפל ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון מעבדה מעילו ואת nitrile כפפות.
4. כל הר Immunofluorescence
- מקום הרקמה קבוע 1 x PBS ב RT לפחות 4 שעות לפני השלב permeabilization 4.3.
- להכין permeabilization פתרון פתרון חסימה.
- להכין פתרון permeabilization כמתואר. כדי 1 x PBS, להוסיף 0.2% אלכוהול (PVA), 0.1% נתרן borohydride (NaBH4) פתרון (מתוך wt.% 12 בפתרון הידרוקסיד הנתרן (NaOH) 14 מ') ו- 1.5% פוליאתילן טרט -octylphenyl גליקול (דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית). צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA µL 50 NaBH4, µL 750 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית, ולאחר מכן להוסיף הנדסה גנטית מים עד 50 מ ל, להתסיס היטב בטמפרטורת החדר עד שהתערובת לחלוטין בפתרון.
- להכין פתרון חסימה כמתואר. 1 x PBS, מוסיפים חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.1% דטרגנט, 0.15% של 2.5 מטר גליצין pH 7.4, סרום עז נורמלי 10%, 3% אלבומין שור (BSA), נאן 0.2%3, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו 0.25 µg/mL שהוא גוסס B. להכין פתרון מניות של 2.5 גליצין מ' על ידי המסת g 93.8 של גליצין במים הנדסה גנטית לאמצעי הסופי 500 מ"ל (pH 7.4) ופתרון מניות של 10% נאן3 על ידי המסת 5 g ב- 50 מ ל מים הנדסה גנטית; לאחר מכן, צינור חרוטי 50 מ ל להכין את הפתרון חסימה על-ידי הוספת 5 מיליליטר 10 x PBS, 50 µL של חומרים פעילי שטח ללא יונית דטרגנט, 750 µL של פתרון מניות גליצין, 5 מ של עז סרום, 1.5 גר' BSA, 1 מ"ל של נאן3 מניות פתרון , ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס. מוסיפים מים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 mL ומזרק מסנן הפתרון הסופי.
- להסיר, למחוק את PBS 1 x מ המבחנה, ולאחר מכן להוסיף לפתרון permeabilization מספיק לגמרי להטביע את השחלות. מקם את הדגימה permeabilization פתרון על שייקר מסלולית (למשל, nutator) בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לעובי איברים. - החלף את הפתרון permeabilization מספיק לפתרון חוסם לגמרי להטביע את השחלות. לאטום את המבחנה עם דבק פלסטיק ולהשאיר את הרקמה המקננת למינימום 12 שעות בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.
- להכין נוגדן ראשוני דילול בפתרון חסימה לפי גליון הנתונים של היצרן.
הערה: שימו לב כי לא כל נוגדנים תואם הסוכן סליקה. אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה היא בערך 750 µL.- על כימות oocyte, להשתמש TAp63 (סמן גרעיני oocyte) ו MVH (סמן cytoplasmic תא הנבט).
הערה: הנוגדנים בשימוש של תמונות immunofluorescence הם העכבר anti-p63 וארנבת אנטי-MVH). הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לשימוש חוזר 2 x או יותר אם האחסון ב 4 ° C בין מכתים פרוטוקולים, טופלו כהלכה כדי למנוע התפתחות חיידקים.
- על כימות oocyte, להשתמש TAp63 (סמן גרעיני oocyte) ו MVH (סמן cytoplasmic תא הנבט).
- למקם את תותב המכיל את הרקמה לתוך צלחת 24-ובכן, להוסיף בערך 750 µL של נוגדן ראשוני פתרון. ודא כי השחלות לגמרי טובע. חותם את הצלחת עם דבק פלסטיק למזער אידוי ולעזוב את הרקמה המקננת ארבעה ימים בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.
- להכין את הפתרון כביסה.
- להכין פתרון כביסה כמתואר. להפוך 1 x PBS, להוסיף דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית PVA ו- 0.15% 0.2%. צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA, µL 75 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית ומים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 מ.
- להסיר נוגדן ראשוני לדילול ומוסיפים כמות נדיבה של הפתרון כביסה. תמיד הקפידו להטביע את השחלות. לאפשר את השחלות כדי להשרות את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר-תפקודי לב /.
- להחליף את הפתרון כביסה, דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך שעתיים או יותר.
- חזור על השלב 4.9 פעם נוספת.
- להכין נוגדן משני הדילול בחסימה פתרון.
הערה: הנוגדנים משני המשמש הן אנטי-העכבר 488 הפלורסנט וגדל עז אנטי-ארנב 594 הפלורסנט העולות עז. ראה שלב 4.5. עבור אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה. - הפתרון כביסה להסיר השחלות ולהוסיף פתרון נוגדנים משניים. להגן על הדגימות מפני אור (צלחת פלסטיק ברדיד אלומיניום) ויסגור את הצלחת עם דבק פלסטיק כדי למזער את אידוי. דגירה דוגמאות על תפקודי לב / נשימה בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
הערה: המשך הגנה על הדגימות מן האור באמצעות נייר אלומיניום במהלך כל השלבים הבאים הדגירה. - הסרת פתרון נוגדנים משניים מדגימות ולהוסיף הפתרון כביסה. דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך 8 שעות.
הערה: אם, 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת רצוי להוסיף 50 ננוגרם למ"ל של דאפי לצעד רחיצת הראשון (~ 8 h הדגירה). - החלף את הפתרון כביסה ושטוף לילה.
- בעת הכנת הפתרון סליקה (ראו סעיף 5), להחליף את הלילה שטיפה פתרון פתרון טריים, שומרים את הדגימות-תפקודי לב / בטמפרטורת החדר.
5. השחלה ניקוי והדמיה
- להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון.
- להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון10 על-ידי הוספת ריאגנטים ביחס נתון של: 40% D-(-) בסורביטול (w/v), גליצרול 10%, אוריאה 4.3 מ' ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), pH 8.1 (למשל צינור חרוטי 50 מ ל, להוסיף 2.5 מ של גליצרול, 10 גרם של בסורביטול , 5 מ של דימתיל סולפוקסיד ולאחר 12 מ של 9 מטר אוריאה עבור הנפח הכולל של 25 מ ל. לערבב פתרון על-ידי היפוך ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, דגה לפני השימוש.)
- להסיר את הפתרון כביסה ויציפו את הדגימות לפנות פתרון. לקבלת תוצאות טובות יותר לשמור על דגימות על ניעור מסלולית.
- להחליף את פתרון סליקה 2 x מדי יום עד הרקמה הופך שקוף (כ- 2 ימים).
- ברגע הרקמה אינה מסומנת, להכין את הדגימה עבור הדמיה על-ידי הסרת בזהירות את הקרום הוספה המכיל את השחלות תרבותי עם קנס עצה המדגם. אזמל והצבת על משטח זכוכית.
- המשך הדמיה הדגימות על מיקרוסקופ המסוגל חלוקתה אופטי.
6. oocyte כמת
הערה: ישנם תוכניות מחשב שונים רבים יכולים לכמת תאים. המתוארים להלן הוא פרוטוקול על כימות oocyte באמצעות החבילה עיבוד התמונה מסחרי, פיג'י-ImageJ14.
- באמצעות הקרנה שעברו שיטוח העוצמה המקסימלית של Z -מחסנית התמונה הסדרה עבור הסמנים סלולרית ספציפית עניין (ללא הערוץ דאפי), המירו את התמונה לתמונת שחור-לבן 8 סיביות תחת סוג ב התמונה הנפתחת תפריט.
- תחת התפריט הנפתח התמונה , לסמן את הכרטיסיה התאם ולאחר מכן בחר הסף.
- כוונן באופן ידני את הסף לרמה הטובה ביותר המזהה כל oocyte בודדים. ברגע הרמה נקבעת, לחץ על החל כדי להפיק תמונה בשחור-לבן. עם סיום, לכמת את הדגימה באמצעות התוחמים את סמל סגלגל או פריהנד .
הערה: פיג'י-ImageJ יש אפשרויות שונות לחידוד התמונה שתשמש עבור כימות של חלקיקים. למשל, ב- תהליך | בינארי טאב, קיימות אפשרויות שונות, יכול לשמש כדי לשפר את הגילוי של מה ייספרו. איור 4, האפשרויות להשתמש טוב יותר לצורך זקיקים היה לשחוק, ואחריו למלא חורים, ולבסוף קו פרשת המים. - תחת התפריט הנפתח נתח , בחר נתח חלקיקים. להגדיר את הפרמטרים על פי הרזולוציה הרצויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה כולל 6 שלבים עיקריים בעקבות ניתוח של השחלות, כמתואר באיור1. איור 2 , איור 3 , איור 4 להדגיש את התכונות הכי חדשניים של פרוטוקול זה, הכוללים אופטימיזציה של רקמות ניקוי השחלות, כימות oocyte כל רקמה באמצעות פיג'י-ImageJ. איור 2A מראה תמונות של מחציתה 5 ימים לאחר הלידה קבוע שחלה לפני (משמאל) ושל 1 h לאחר (נכון) הוספת סליקה מענה השחלה. השחלה יתחיל להיות שקוף תוך דקות במי ניקוי פתרון. לאחר שנוקו, השחלות קטן כמו זה עם תמונה איור 2 א להפוך קשה לטפל ללא פגיעה. לכן, עבודה עם השחלות explanted תרבותי היא יתרון כי הם תיקשרו השטח הנקבובי של קרום הוספה שעליו הם בתרבית. הקובץ המצורף של השחלה קרום הוספה מאפשרת הנסיין להתמודד את תותב הממברנה ולא השחלה עצמה (2B איור , איור 3). כמו כן, השחלות תרבותי בסמיכות ומתמלאים 2B איור מופעים מצורף מאוחה השחלות לפני (משמאל) , לאחר ניקוי (מימין) ב hematoxylin צבעונית דגימות.
ביצוע של אופטי חלוקתה של השחלות בתרבית ללא פינוי אפשרי; עם זאת, תאים עמוק בתוך הרקמה. יש אות שקשה להבדיל מהרקע ופוגע חוסר אות ברור כימות oocyte תקין (איור 3 א). בניגוד 3A איור, איור 3B היא תמונת הנציגה של מדגם שנוקה שבו oocyte כימות לאורך האיבר כולו הוא אפשרי. איור 3B מדגים כי כל האיבר הדמיה של השחלות בתרבית שנוקה יכול להתבצע ללא אובדן משמעותי של אות עמוק בתוך הרקמה, תמונות כמו זה המוצג (איור 3B) בקלות ניתן לכמת. גישה אחת לכימות תנועת oocytes דגימות כאלה היא על ידי המרת הסדרה Z-מחסנית סעיפים אופטי הטלה בעוצמה מקסימלית ואז המשך עיבוד הקובץ עם חבילת עיבוד תמונה. איור 4 משלימה איור 1 סימון השלבים משמש לכמת את מספר oocytes ב איור 3B באמצעות פיג'י-ImageJ. משלימה טבלה 1 כולל כימות של חלקיקים (oocyte) של פיג'י-ImageJ. כימות של חלקיקים באמצעות שיטה זו גם מאפשרת הניתוח של זקיקי שונים בהתאם לגודל oocyte, כי מידע על הן על מספר חלקיקים, האזור המקביל של כל חלקיק מחושב על ידי התוכנה ולא סיפקה המשתמש.
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול כולו. סיכום חזותי של ההתחלה פרוטוקול עם דיסקציה של השחלה (1), ואחריו השחלה תרבות (2), קיבוע הרקמה עם 4% מחברים (3), immunostaining באמצעות נוגדנים ספציפיים (4), ניקוי רקמות עמוק הדמיה (5), קבלת באמצעות סעיף אופטי מיקרוסקופ קונפוקלי (6) והסיום עם כימות oocyte (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הפרש אטימות רקמות בין השחלות ואי -האו ם שנוקה. (א) שחלה מיום כמחנכת חמש כלבלב ללא ניקוי (משמאל) ואחרי ניקוי מתון של 1 h (מימין). (B) שחלות מרובות תרבותי בסמיכות אחד לשני במשך שבעה ימים. שתי רמות הגדלה שונות של כל מדגם מוצגים. תמונות השמאלי ביותר הם ללא ניקוי ותמונות הימניים ביותר הם עם קרחת. השחלות ייצמד הקרום של תרבות הקדמי, ניתן לטפל טוב יותר אם שומר צמוד לאורך כל הפרוטוקול. כדי לשפר את הניגודיות של רקמה עבור הדמיה באמצעות אור לבן, השחלות היו שקועים hematoxylin עבור 5 דקות לאחר קיבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Immunofluorescence הדמיה של השחלות ואי -האו ם שנוקה. השחלות של יום לאחר הלידה הגורים היו בתרבית למשך 7 ימים, צבעונית על-פי immunofluorescence כל הר מכתים פרוטוקול המתואר. מוצגים בצבע אדום הם תאים עם תוויות עם העכבר "ואסה" homolog (MVH) כדי לזהות בתאי הנבט, בירוק הם תאים המסומנת דה מרקר oocyte ספציפיים גרעינית, p63. . דאפי, בצבעי כחול, שימש לתייג כל גרעין התא. (א) Immunofluorescence תמונה של שחלות ללא ניקוי. (B) Immunofluorescence תמונה של השחלות עם קרחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זרימת חזותי עבור איך לכמת באמצעות תוכנה פיג'י-ImageJ oocytes. על מנת להקל על ניתוח נתונים, אפשר לצמצם תמונות נגזר מן המטוסים קונאפוקלית הטלה בעוצמה מרבית במקום תמונת תלת-ממד. עם התחזית העוצמה המקסימלית, המשתמש יכול להגדיר פרמטר הסף התמונה כך החלקיקים היעד מתחוורת. ברגע בתמונה פשוטה מתקבל, התוכנה משמשת כדי לספור את oocytes. אנושות בחינת תמונות בעת הגדרת הפרמטרים היא קריטית. איור זה מציג דוגמה כיצד ניתן להגדיר את הסף חלקיק/oocyte. הטקסט מעל כל תמונה מדגיש את הפרמטר והשיג את התמונה בפיג'י-ImageJ. התוכנה יוצרת טבלה עם מדידת השטח של החלקיקים (ראה טבלה 1 משלימה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: זרימת חזותי עבור איך לכמת oocytes באמצעות תוכנה פיג'י-ImageJ (הגדלה נמוכה יותר). איור זה מציג oocyte כימות עבור שתי השחלות בסמיכות. השלבים שבוצעו הם כמו באיור 4. חלקיקים 2,436/זקיקים נספרו על ידי התוכנה. כימות הנתונים המתקבלים התוכנה ניתן למצוא משלימה טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה טבלה 1: זקיק כימות מחושב על ידי פיג'י-ImageJ. טבלה זו מכילה הרשימה של זקיקי שנספרו ואזור המקביל שנוצר מתוך התמונה משלים באיור1. גודל החלקיקים המשמש עבור כימות הוגדר מ- 10 מיקרומטר2-אינסוף. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר של רבייה יונקים דורש שימוש וכימות תאים מיוחדים נתונות לא שגרתי תרבית תאים. עם זאת, שמחוץ תרבות מערכות יעילים בשמירה השחלה ואת זקיק הכדאיות1,15. במהלך תרבות השחלה, הרקמה דורש שטח פנים גדול יותר עבור חילופי חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה. לכן, העכבר 5 - בן יום השחלות אידיאליים בגודל ולגיבוש לתרבות איברים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור השחלות נשמר במשך שבעה ימים בתרבות, אך אורך תרבות השחלה יכול להיות מותאם על פי שאלה מדעית ספציפית1,4. תוצאות דומות הושגו השחלות תרבותי עבור קטנה כמו שלושה ימים, כל עוד עשרה ימים (נתונים לא מוצג), אבל השחלות מחיות יותר מבוגר ממה עשרה ימים הם גדולים ואת התרבות לא יכולה להיות יעילה, ובכך הארת מגבלה של הפרוטוקול.
אם אין צורך שמחוץ culturing של השחלה, זה אפשרי לתקן, כתם השחלות בוגרים עם פרוטוקול המתואר, למרות שינויים ייתכן שיהיה צורך להתאים גדול יותר רקמה בגודל9,16. פרוטוקול מכתימים תיאר תלוי דיפוזיה פסיבית של הנוגדנים לתוך איבר המין, אשר מציין כי ייתכן שתהיה אפשרות כתם גדול השחלות בצעדים דגירה ארוך גם נוגדן או על-ידי חלוקה למחיצות של הרקמה לחתיכות קטנות יותר כמה יכול מחדש לאחר דימות. השימוש של אוריאה ו בסורביטול ב ScaleS(0) ניקוי הסוכן הוכיח יעיל עבור neonatal השחלות בתרבית כי זה נדרש דגירה קצר יותר מאלה שדווחו עבור סליקה סוכנים עם אוריאה ו גליצרול8,(ScaleA2)10 . יתר על כן, השימוש של ריכוז נמוך של נתרן borohydride (NaBH4) בפתרון permeabilization ירד רעשי הרקע, והנחה, יחד עם incubations ארוך של הדגימות עם נוגדנים ראשיים ומשניים, צביעת עמוק בתוך הרקמה. בנוסף, השימוש PVA את permeabilization ושטיפת פתרונות מונעת חלקיקים כדין נדבקות רקמות17,18.
ב פרוטוקול זה, בתרבית השחלות בריא לצרף קרום הוספה, בעוד השחלות לא בריא יכול לנתק ממנו על קיבוע וטיפול. טיפול רקמות רופף עם מלקחיים יגרום נזק השחלה והדמיה פשרות סביר. לחלופין, רקמות רופף שניתן נעוץ תקעים agarose 5% או מטופל עם העברת פיפטות ככל הקצה פתיחת הוא רחב מספיק לא לפגוע בו. באשר immunostaining, ראשי נוגדנים שונים מאלה המשמשים פרוטוקול זה ניתן לבצע בצורה שונה ועשויה אופטימיזציה בשלבים permeabilization של דגירה.
לבסוף, הפרוטוקול מתאר גישה חלופית לכיוון לכימות זקיקי השחלות צעירה לעומת פרפין מסורתיים משובצים קטעים טורי או השני שתואר קודם לכן כימות הנפחי של זקיקי מתמונות הר שלמה 5 , 9 , 16. בהתאם לדרישות של החוקר, ההליך עבור כימות oocyte תיאר בפרוטוקול ניתן גם להשתמש בשלבים שונים characterize של התפתחות הזקיקים19. האזור החלקיקים שנוצרו על-ידי התוכנה יכול לשמש כדי לקבוע את הקוטר התא ובכך יסיק הבמה הזקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים רבקה ויליאמס ו ג'ואנה דלה קרוס של הדמיה קורנל BRC ו אנדרו Recknagel על ההערות המועילות וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על המכונים הלאומיים לבריאות גרנט S10-OD018516 (כדי מתקן הדמיה של קורנל), T32HD057854 כדי J.C.B., R01-GM45415 כדי J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
