Summary
Nous présentons ici un protocole visant à quantifier les follicules dans les ovaires de jeunes souris sans sectionnement serial. Selon immunofluorescence de la totalité de l’organe et de tissus de compensation, sectionnant physique est remplacé par sectionnement optique. Cette méthode de préparation des échantillons et visualisation maintient l’intégrité de l’organe et facilite la quantification automatique des cellules spécifiques.
Abstract
Recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction chez les mammifères souvent consiste à évaluer l’intégrité globale des ovaires et des testicules. Plus précisément, chez les femelles, l’ovaire remise en forme est souvent évaluée par visualiser et quantifier les follicules et les ovocytes. Parce que l’ovaire est un tissu opaque en trois dimensions, les approches traditionnelles nécessitent laborieusement découper le tissu dans nombreuses coupes sériées afin de visualiser les cellules tout au long de l’organe entier. En outre, parce que la quantification de cette méthode consiste généralement à marquer qu’un sous-ensemble des sections séparées par le diamètre approximatif d’un ovocyte, elle est sujette à l’inexactitude. Un protocole est décrit ici, qui utilise plutôt la compensation tissus organes entiers et immunofluorescence souillant des ovaires de souris pour visualiser les follicules et les ovocytes. Par rapport aux approches plus traditionnelles, ce protocole est avantageux pour la visualisation des cellules à l’intérieur de l’ovaire pour de nombreuses raisons : 1) l’ovaire reste intacte tout au long de la préparation des échantillons et du traitement ; 2) petits ovaires, qui sont difficiles à section, peuvent être examinées avec facilité ; 3) quantification cellulaire est obtenue plus facilement et avec précision ; et 4) l’organe entier imagé.
Introduction
Afin d’étudier la composition cellulaire et les caractéristiques morphologiques des ovaires chez les mammifères, scientifiques reposent souvent sur des expériences in vivo suivies immunohistological coloration des ovaires de paraffine incorporé. Plus récemment cependant, culture d’organes entiers ovaire s’est avéré pour être une alternative efficace pour étudier la fonction ovarienne1,2,3,4 , parce que la technique peut être couplée avec une meilleure visualisation et outils de quantification. Traditionnellement, analyse de la morphologie ovarienne dépend de reconstruire en trois dimensions architecture ovarien de coupes sériées de paraffine incorporé, mais, en plus d’être laborieuse et chronophage, coupes en série tissu paraffine incorporé ne garantie pas de bonne reconstruction de l’orgue, et les sections sont souvent perdues ou mal classées dans le processus.
Outre les défis techniques liés au sectionnement série, il y a des variations dans les méthodes couramment utilisées pour quantifier le nombre de follicules par ovaire5,6. La variabilité méthodologique utilisée actuellement altère la méta-analyse de réserve ovarienne ensemble études5,7. Par exemple, nombre de follicule d’articles de recherche différents peut varier de 10 fois ou plus entre les âges de développement similaires au sein d’une souche spécifique de6. Ces grandes différences dans la quantification du follicule signalées peuvent prêter à confusion et ont entravé la Croix-étude des comparaisons. Expérimentalement, les approches traditionnelles de la quantification de la follicule de coupes sériées sont effectuées par le comptage des follicules d’un nombre prédéfini de sections (par exemple, chaque cinquième, dixième, ou autre article). Variabilité des comtes de follicule à l’aide de cette approche découle non seulement de la périodicité dans quelles sections sont comptées, mais aussi des variations dans l’épaisseur de coupe et une expérience technique dans la génération de coupes sériées5,6. En plus de sa variabilité, un autre inconvénient des coupes de tissu traditionnel est que le sectionnement de petits ovaires d’animaux jeunes est particulièrement difficile et fortement tributaire des tissus orientation8.
Le protocole ci-dessous décrit une technique de culture ovaire systématiquement utilisé1 mais améliore grandement sur la quantification du follicule traditionnel en remplaçant les coupes physiques avec tissu de compensation et sectionnement optique à l’aide de la microscopie confocale8 ,,9. Compensation à l’aide d’immersion de tissu (sans la nécessité d’une perfusion transcrânienne ou électrophorèse) dans un et sorbitol-base d’urée solution (par exemple, ScaleS(0)10) s’est avérée compatible avec l’immunomarquage et autorisés pour la réduction des temps de compensation sans compromettre la profondeur de l’imagerie. Autres méthodes déclarées (p. ex., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12et ClearT212) sont plus consommer de temps ou ne permettent pas une résolution optique approfondie de l’échantillon. Optique de sectionnement est avantageux car il est moins intensive de travail et maintient architecture tridimensionnelle7,8 de l’orgue. Un autre avantage de cette approche est que la préparation des échantillons n’exige pas des réactifs coûteux pour dégager le tissu et peut être effectuée avec une relative facilité.
Plus précisément, le protocole décrit a été optimisé pour les ovaires de souris cultivées à jour après la naissance cinq mais a été mené sur les ovaires allant de jour après la naissance 0 - 10. La méthode utilise un système de culture ovaire dans laquelle le tissu s’attache naturellement à la membrane sur lequel il est cultivé, facilitant la manipulation de l’orgue et la manipulation. Le système de culture décrit peut servir à maintenir explantés ovaires pendant 10 jours et d’évaluer comment les différentes conditions expérimentales peuvent interférer avec l’ovocyte survie13. La procédure de quantification décrite est réalisée en utilisant le paquet Fidji-ImageJ14 de traitement d’image non commerciale et peut être effectuée sur la plupart des ordinateurs personnels. En outre, images utilisées pour la quantification peuvent être largement diffusés pour la communauté scientifique, ce qui permet de meta-analyse future.
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Protocol
L’Université de Cornell animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) a approuvé toutes les méthodes décrites ici, en vertu du protocole 2004-0038 à JCS.
1. préparation des Instruments et des milieux de Culture
- Essuyez la zone de travail avec 10 % d’eau de Javel et laisser l’eau de Javel à rester sur l’aire de zone de travail pendant au moins 5 min. Après 5 min, retirer l’eau de Javel excès avec des serviettes en papier propre et 70 % d’éthanol (EtOH). Nettoyer le microscope à dissection avec 70 % EtOH.
Remarque : Il est important que la zone de travail soit au moins semi-stérile pour éviter la contamination des cultures d’organes. - Envelopper les ciseaux et pinces propres avec un essuie-tout humidifié avec 70 % EtOH jusqu’au moment de l’emploi.
Remarque : Les outils de dissection idéale peuvent varier selon l’âge/la taille de l’ovaire. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide d’un ciseaux dissection micro forte, deux pinces à pointe fine (numéro 5 ou 55) et un micro ciseaux iris de dissection. - Dans un tube à fond conique, compléter à 50 mL de milieu de culture d’ovaire et bien au chaud dans un bain-marie à 37 ° C.
- Pour faire de milieu de culture ovaire4, Supplément 1 x support essentiel minimum (MEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF), 25 mM (acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES), 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 0,25 µg/mL Amphotéricine B (p. ex., 45 mL de MEM, 5 mL de chaleur inactivé FBS, 1,25 mL de HEPES et 0,5 mL de 100 actions de x de la pénicilline, streptomycine et amphotéricine B).
- Préparer les plaques et plaquettes avant la culture de l’ovaire.
- Sous une hotte de culture de tissus, ajouter 1 mL de milieu de culture ovaire à une plaque de culture de tissus de 35 mm.
- Pré-tremper insert membrane avec le milieu de culture. Ajouter des éléments multimédias suffisante, généralement environ 0,55 mL par bien, à la plaque de culture de tissus de support de 24 puits et placez une culture cellulaire insérer dans le puits. S’assurer que la membrane de l’insert ne touche le support.
- Préparer le nombre de plaques de 35 mm et puits avec inserts de culture cellulaire selon le nombre prévu des ovaires dans l’expérience. Placer les plaques de 35 mm contenant 1 mL de milieu de culture et de la plaque de support de 24 puits contenant des milieux de culture et d’inserts dans un 37 ° C et 5 % de CO2atmosphérique incubateur de2 O.
- Disposer une plaque chauffante à côté de l’étendue de la dissection et de régler la température à 37 ° C. Garder un 37 ° C, 5 % de CO2 et l’incubateur de2 O atmosphérique se trouve à proximité de la salle de dissection.
2. ovaire Dissection et la Culture de l’orgue
NOTE : Ovaires peuvent être disséqués à température ambiante aussi longtemps que l’exposition à la température non idéal est minime.
- Euthanasier les souris femelles à jour après l’accouchement 5, par décapitation, un à la fois.
Remarque : L’euthanasie doit être effectuée conformément aux directives IACUC présents dans l’établissement où la recherche est effectuée. - Pulvériser l’animal avec 70 % EtOH. Placez l’animal sur le dessus de la serviette en papier sèche sous le microscope à dissection. Placez un plat de vitroplants de 35 mm contenant des milieux de culture ovaire près le microscope à dissection.
- Avec une pince ou un ciseaux iris de dissection micro, faites une incision à travers la peau de l’animal et dans la cavité abdominale, utilisation attention ne pas de couper dans les intestins. Poussez les intestins hors de la cavité abdominale et localiser les ovaires. Extraire les ovaires et les placer dans le récipient de culture de tissus de 35 mm contenant des milieux de culture.
- Une fois que les ovaires ont été disséqués de l’animal, augmenter le grossissement du microscope à dissection afin de mieux visualiser les ovaires et une gencive attachée. Avec nettoyer pinces à pointe fine, retirer tous les tissus non-ovarienne, tels que la bourse et le tissu adipeux. Veillez à garder les ovaires intact lors du retrait de la gencive attachée non-ovarien.
- Une fois que les ovaires sont isolés, placez la paire dans les inserts de culture cellulaire préalablement trempés de la plaque de support 24 puits (se référer aux étapes 1.4.2 et 1.4.3) et régler le volume du milieu pour s’assurer qu’il est suffisant pour garder l’organe humide (sans complètement immergeant).
ATTENTION : Veillez à ne pas pousser un trou dans la membrane de l’insert de culture cellulaire lorsque vous transférez les ovaires. - Place explantées organes dans un 37 ° C et 5 % de CO2atmosphérique incubateur de2 O.
- Répétez les étapes 2.1-2.6 jusqu'à ce que les ovaires de chaque animal sont disséqués et placées sur la culture de cellule insérer de la plaque 24 puits contenant le milieu de culture des ovaires.
- Changement du milieu de culture ovaire tous les 2 jours, à l’aide de réchauffé aliquotes de médias ovaire d’un bain-marie à 37 ° C et procéder à la partie 3 du protocole à l’endroit désiré temps expérimental.
3. Fixation du tissu
- Dans un tube conique de 15 mL, préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (par exemple, ajouter 2 mL de 16 % grade PFA au microscope électronique à 6 mL de PBS 1 x).
ATTENTION : PFA est une substance dangereuse et doit être manipulé sous une hotte chimique. - Difficulté les ovaires cultivées, sans enlever le tissu de l’insert de la culture, en couvrant le tissu avec la solution fraîchement préparée de PFA 4 %. Sceller les bords de la plaque avec un adhésif en plastique (pour éviter l’évaporation) et placer les échantillons à 4 ° C durant la nuit.
Remarque : Afin de faciliter la manipulation et l’intégrité des tissus, évitez de déplacer les ovaires de l’insert de culture cellulaire pendant toute la procédure. Ovaires cultivées attachés à la surface de la plaquette sont avantageuses pour une manipulation sans endommager ou perdre de l’orgue. - Rincer le tissu 3 x avec 70 % EtOH et soit passer à l’étape 4.1 ou magasin dans les flacons scintillation rempli avec 70 % EtOH à 4 ° C jusqu'à ce que davantage de traitement.
Remarque : Si vous utilisez le tissu endogène exprimant des protéines fluorescentes, stocker les échantillons avec 70 % EtOH peut réduire considérablement le signal. Alternativement, le tissu peut être rincé et stocké dans du PBS avec 0,2 % d’azide de sodium (NaN3). Cependant, NaN3 est hautement toxique et présente un danger d’inhalation grave. Faire la solution mère dans la hotte de laboratoire et gérer le port des équipements de protection individuelle approprié comme un manteau et nitrile des gants de laboratoire.
4. toute monture Immunofluorescence
- Placez le tissu fixe dans du PBS 1 x à ta pendant au moins 4 h avant l’étape de la perméabilisation 4.3.
- Préparer la solution perméabilisation et blocage.
- Préparer la solution de la perméabilisation comme décrit. 1 x PBS, ajouter 0,2 % d’alcool polyvinylique (PVA), solution de (NaBH4) de borohydrure de sodium de 0,1 % (à partir de 12 wt.% dans une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 14 M) et 1,5 % tert -octylphényle éther de polyéthylèneglycol (détergent agent tensio-actif non ionique). Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA et 50 µL de NaBH4750 µL de détergent agent tensio-actif non ionique, puis ajoutez ultrapure à 50 mL d’eau et agitez bien à température ambiante jusqu'à ce que le mélange soit entièrement en solution.
- Préparer la solution de blocage comme décrit. Pour 1 x PBS, ajouter 0,1 % tensioactif non ionique détergent, 0,15 % de 2,5 M glycine pH 7,4, sérum de chèvre normal de 10 %, 3 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,2 % NaN3, 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL d’amphotéricine B. préparent une solution de 2,5 glycine de M en dissolvant 93,8 g de glycine en eau ultrapure pour un volume final de 500 mL (pH 7,4) et une solution de 10 % NaN3 en dissolvant 5 g dans 50 mL d’eau ultrapure ; puis, dans un tube conique de 50 mL Préparez la solution de blocage en ajoutant 5 mL de PBS de x 10, 50 µL de détergent agent tensio-actif non ionique, 750 µL de la solution mère de glycine, 5 mL de sérum de chèvre, 1,5 g de BSA, 1 mL de solution mère de NaN3 et 0,5 mL de 100 actions de x de la pénicilline, streptomycine et amphotéricine B. Ajouter eau ultrapure jusqu'à un volume final de filtre de seringue et 50 mL de la solution finale.
- Enlever et jeter le PBS 1 x à partir du flacon et puis ajoutez suffisamment de solution perméabilisation pour submerger complètement les ovaires. Placer l’échantillon dans la solution de la perméabilisation dans un agitateur orbital (p. ex., nutator) à température ambiante pendant 4 h.
Remarque : Le temps d’Incubation peut varier selon l’épaisseur de l’orgue. - Remplacer la solution perméabilisation avec suffisamment de solution bloquante pour submerger complètement les ovaires. Sceller la fiole avec l’adhésif en plastique et laisser le tissu incubant pendant un minimum de 12 h à température ambiante dans un agitateur orbital.
- Préparer la dilution de l’anticorps primaire en solution de saturation selon la fiche technique du fabricant.
NOTE : Notez que pas tous les anticorps sont compatibles avec l’agent de compensation. Le volume moyen nécessaire par exemple est environ 750 µL.- Pour la quantification de l’ovocyte, utilisez TAp63 (marqueur de l’oocyte nuclear) et MVH (marqueurs cytoplasmiques des cellules germinales).
Remarque : Les anticorps utilisés dans les images d’immunofluorescence sont souris anti-p63 et lapin anti-MVH). La solution d’anticorps primaires peut être réutilisés 2 x ou plus si stocké à 4 ° C entre souillant des protocoles et correctement manipulés afin d’éviter la croissance bactérienne.
- Pour la quantification de l’ovocyte, utilisez TAp63 (marqueur de l’oocyte nuclear) et MVH (marqueurs cytoplasmiques des cellules germinales).
- Placer l’insert contenant le tissu dans une plaque 24 puits et ajouter environ 750 µL de solution d’anticorps primaire. Veiller à ce que les ovaires soient complètement immergés. Sceller la plaque avec de la colle plastique pour minimiser l’évaporation et laisser le tissu en incubant pendant 4 jours à température ambiante dans un agitateur orbital.
- Préparer la solution de lavage.
- Préparer la solution de lavage comme décrit. Faire 1 x PBS, ajouter 0,2 % PVA et 0,15 % de détergent de surfactant non ionique. Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 75 µL de surfactant non ionique détergent et d’eau ultrapure jusqu'à un volume final de 50 mL.
- Retirez la dilution de l’anticorps primaire et ajouter une généreuse quantité de solution de lavage. Assurez-vous toujours de submerger les ovaires. Laisser les ovaires à tremper dans la solution du jour au lendemain à la température ambiante sur l’agitateur orbital.
- Remplacer la solution de lavage et incuber dans l’agitateur orbital pendant 2 h ou plus.
- Répétez l’étape 4.9 un délai supplémentaire.
- Préparer la dilution de l’anticorps secondaire en bloquant la solution.
Remarque : Les anticorps secondaires utilisés sont anti-souris 488 colorant fluorescent soulevées dans chèvre et anti-lapin 594 colorant fluorescent déclenché chez les caprins. Voir l’étape 4.5. pour le volume moyen nécessaire par exemple. - Enlever la solution de lavage des ovaires et ajouter la solution d’anticorps secondaire. Protéger les échantillons de la lumière (plaque envelopper avec du papier aluminium) et sceller la plaque avec de la colle plastique pour minimiser l’évaporation. Incuber les échantillons dans un agitateur orbital à température ambiante pendant 2 jours.
NOTE : Continuer à protéger les échantillons de la lumière à l’aide de papier d’aluminium pendant toutes les étapes subséquentes de l’incubation. - Retirer les échantillons de solution d’anticorps secondaire et ajouter la solution de lavage. Incuber dans un agitateur orbital pendant 8 h.
Remarque : Si une coloration 4, 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) est souhaitée, ajouter 50 ng/mL de DAPI à la première étape de lavage (environ 8 h d’incubation). - Remplacer la solution de lavage pour un lavage au jour le jour.
- Pendant la préparation de la solution de compensation (voir section 5), remplacer la nuit solution avec une solution fraîche de lavage et conserver les échantillons dans l’agitateur orbital à température ambiante.
5. cellules ovariennes de compensation et d’imagerie
- Préparer ScaleS(0) solution de compensation.
- Préparer ScaleS(0) clearing solution10 en ajoutant des réactifs dans la proportion donnée : 40 % D-(-) sorbitol (p/v), 10 % de glycérol, urée de 4,3 M et 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO), pH 8,1 (p. ex. dans un tube conique de 50 mL, ajouter 2,5 mL de glycérol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO et 12 mL d’urée de 9 M pour un volume total de 25 mL. Mélanger la solution en le retournant à 50 ° C pendant 30 min et dégazer avant l’utilisation.)
- Enlever la solution de lavage et submerger les échantillons en solution de compensation. Pour de meilleurs résultats conserver des échantillons dans l’agitateur orbital.
- Remplacer la solution de nettoyage 2 fois par jour jusqu'à ce que le tissu devient transparents (environ 2 jours).
- Une fois que le tissu est effacé, préparation des échantillons pour l’imagerie en enlevant soigneusement la membrane insert contenant les ovaires cultivées avec une fine pointe bistouri et en plaçant l’échantillon sur une lame de verre.
- Passez à l’imagerie des échantillons sur un microscope capable de sectionnement optique.
6. Quantification de l’ovocyte
Remarque : Il existe de nombreux logiciels différents qui sont en mesure de quantifier les cellules. Décrit ci-dessous est un protocole de quantification d’ovocytes en utilisant le paquet de traitement image non-commerciale, Fidji-ImageJ14.
- Utilisant une projection de l’intensité maximale aplatie de la Z -série d’image pile pour les marqueurs cellulaires spécifiques d’intérêt (sans la chaîne DAPI), convertir l’image en noir et blanche image 8 bits sous Type dans la liste déroulante Image menu.
- Sous le menu d’Image en menu déroulant, sélectionnez l’onglet ajuster , puis sélectionnez seuil.
- Régler manuellement le seuil à un niveau qui identifie mieux chaque ovocyte individuel. Une fois que le niveau est déterminé, cliquez sur appliquer pour générer une image en noir et blanc. Une fois terminé, quantifier l’échantillon délimiter à l’aide de l’icône de forme ovale ou Freehand .
NOTE : Fidji-ImageJ a différentes options pour affiner l’image qui sera utilisée pour la quantification des particules. Par exemple, dans processus | Binaire onglet, il y a différentes options qui peuvent servir à améliorer la détection de ce qui sera compté. Dans la Figure 4, les options permettant de mieux individualiser follicules a Erode, suivie de remplir les trouset enfin le bassin versant. - Sous le menu déroulant ci- analyser , sélectionnez analyser les particules. Réglez les paramètres selon la résolution souhaitée.
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Representative Results
Ce protocole comporte 6 étapes majeures après dissection des ovaires, comme indiqué dans la Figure 1. Figure 2 , Figure 3 , Figure 4 mettre en évidence les caractéristiques plus nouvelles du présent protocole, qui comprennent l’optimisation du tissu de compensation pour les ovaires et tissus toute quantification de l’ovocyte à l’aide de Fidji-ImageJ. Figure 2 a montre des images d’un inculte ovaire fixe postnatale 5 jours avant (gauche) et 1 h après (àdroite) ajout de solution de compensation à l’ovaire. L’ovaire commence à devenir translucide, quelques minutes d’être immergé dans la solution de compensation. Une fois désactivée, petits ovaires comme celle photographiée sur la Figure 2 a devient difficiles à gérer sans l’endommager. Par conséquent, travailler avec ovaires explants cultivés est avantageux parce qu’ils sont attachent à la surface poreuse de la membrane de l’insert sur lequel ils sont cultivés. L’attachement de l’ovaire à la membrane de l’insert permet l’expérimentateur gérer l’insertion de la membrane, et non l’ovaire lui-même (Figure 2 b et Figure 3). En outre, ovaires cultivées à proximité seront fusible et Figure 2 b montre attaché des ovaires fondus avant (gauche) et après avoir effacé (à droite) sur l’hématoxyline colorées des échantillons.
Effectuer la découpe optique des ovaires cultivées sans compensation n’est possible ; Toutefois, profondément dans le tissu des cellules ont un signal qui est difficile à distinguer de l’arrière-plan et cette absence de signal clair empêche quantification bon ovocyte (Figure 3 a). Contrairement à la Figure 3 a, 3 b Figure est une image représentative d’un échantillon déboisée dans lequel la quantification d’ovocytes tout au long de l’organe entier est possible. Figure 3 b montre que l’imagerie des organes entiers d’ovaires cultivées défrichées peut être menée sans perte significative de signal profondément dans les tissus et les images comme celle montrée (Figure 3 b) peut être facilement quantifié. Une approche de quantification des ovocytes dans les échantillons tels que ceux-ci consiste en convertissant la série Z-pile des sections optiques dans une Projection d’intensité maximale et surtransformation ensuite le fichier avec un package de traitement d’images. Figure 4 et Figure supplémentaire 1 mettent en évidence les étapes utilisées pour quantifier le nombre d’ovocytes dans la Figure 3 b à l’aide de Fidji-ImageJ. La Table 1 comprend quantification des particules (ovocyte) de Fidji-ImageJ. Quantification des particules à l’aide de cette méthode également permet l’analyse des follicules différentes selon la taille de l’ovocyte, parce que les informations sur le nombre de particules et la zone correspondante de chaque particule sont calculées par le logiciel et fournies à la utilisateur.
Figure 1 : représentation schématique de l’ensemble du protocole. Résumé visuel du début protocole avec dissection de l’ovaire (1), suivie de la culture de l’ovaire (2), fixation du tissu avec 4 % PFA (3), immunomarquage à l’aide d’anticorps spécifiques (4), tissu pour profond d’imagerie (5), l’obtention de la coupe optique à l’aide de compensation une microscope confocal (6) et se terminant avec la quantification de l’ovocyte (7). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : différence d’opacité des tissus entre ovaires non défrichées et compensés. (A) l’ovaire d’un jour après la naissance cinq chiot sans compensation (à gauche) et après compensation légère d’environ 1 h (à droite). (B) plusieurs ovaires cultivés à proximité les uns aux autres pendant sept jours. Deux grossissements différents de chaque échantillon sont présentés. Images à l’extrême gauche sont sans compensation et plus à droite des images sont avec compensation. Ovaires seront attache à la membrane de l’insert de culture et peuvent être mieux gérées si gardé attaché tout au long du protocole. Afin d’améliorer le contraste de tissu pour l’imagerie à l’aide de la lumière blanche, les ovaires ont été submergés dans l’hématoxyline pendant 5 min après fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : imagerie Immunofluorescence d’ovaires non compensés et déboisées. Ovaires de petits jour après la naissance, 5 ont été cultivées pendant 7 jours et colorées selon le support entier immunofluorescence souillant le protocole décrit. En rouge est étiquetés avec l’homologue de vasa de souris (MVH) pour identifier les cellules germinales et en vert les cellules sont marquées avec le marqueur d’ovocytes propres nucléaire, p63. DAPI, en bleu, a été utilisé pour étiqueter tous les noyaux des cellules. (A) image de Immunofluorescence des ovaires sans compensation. (B) image en Immunofluorescence d’ovaires avec compensation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : flux de travail Visual pour savoir comment quantifier les ovocytes à l’aide de logiciels de Fidji-ImageJ. Afin de faciliter l’analyse des données, images dérivées des plans confocal peuvent être réduites à une projection de l’intensité maximale au lieu d’une image 3D. Avec la projection de l’intensité maximale, l’utilisateur peut définir des paramètres de seuil d’image de telle sorte que les particules de cible deviennent évidents. Une fois l’image simplifiée est obtenue, le logiciel est utilisé pour compter les ovocytes. Examen critique des images tout en définissant les paramètres est crucial. Cette figure montre un exemple de comment le seuil de particules/ovocyte peut être défini. Le texte au-dessus de chaque image met en évidence le paramètre utilisé pour obtenir cette image dans Fidji-ImageJ. Le logiciel génère une table avec la mesure de la surface des particules (voir le tableau1 supplémentaire). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : flux de travail Visual pour savoir comment quantifier les ovocytes à l’aide de logiciels de Fidji-ImageJ (plus faible grossissement). Cette figure illustre la quantification d’ovocytes pour deux ovaires à proximité. Les mesures effectuées sont les mêmes que dans la Figure 4. 2 436 particules/follicules ont été dénombrées par le logiciel. Données de quantification obtenues à partir du logiciel se trouvent dans la Table 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
La Table 1 : quantification de follicule calculée par Fidji-ImageJ. Cette table contient la liste des follicules comptés et la superficie correspondante généré à partir de l’image dans la Figure 1. La taille des particules utilisée pour la quantification a été fixée à 10 µm2-infini. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’étude de la reproduction chez les mammifères nécessite à l’aide et à la quantification des cellules spécialisées qui ne sont pas systématiquement se prêtent à la culture cellulaire. Cependant, ex vivo systèmes de culture sont efficaces pour maintenir l’ovaire et le follicule viabilité1,15. Au cours de la culture de l’ovaire, le tissu nécessite une plus grande surface pour l’échange d’éléments nutritifs par diffusion. Par conséquent, 5 - jour vieille souris ovaires sont idéales dans la taille et de forme pour la culture de l’orgue. Ce protocole a été optimisé pour les ovaires maintenues pendant sept jours dans la culture, mais ovaire culture longueur peut être ajustée selon la question scientifique spécifique1,4. Des résultats comparables ont été obtenus dans les ovaires cultivées pour aussi peu que trois jours et jusqu'à dix jours (données non présentées), mais les ovaires d’animaux âgés de plus de dix jours sont grandes et la culture ne peut pas être aussi efficace, mettant ainsi en évidence une limitation du protocole.
Si ex vivo mise en culture de l’ovaire n’est pas nécessaire, il est possible de fixer et de tacher les ovaires plus âgés avec le protocole décrit, bien que les modifications peuvent être nécessaire pour s’adapter à la plus grande et tissu taille9,16. Le protocole de coloration décrit dépend de la diffusion passive des anticorps dans l’orgue, ce qui indique qu’il peut être possible de colorer les ovaires plus grands avec soit plus longues étapes de l’incubation anticorps ou en partitionnant le tissu en quelques petits morceaux qui peuvent reconstruit après l’imagerie. L’utilisation d’urée et de sorbitol dans le ScaleS(0) agent s’est avérée efficace pour ovaires cultivées néonatales parce qu’il a fallu une période d’incubation plus courte que celles de compensation déclarée pour les agents de compensation avec l’urée et du glycérol (ScaleA2)8,10 . En outre, l’utilisation d’une faible concentration de borohydrure de sodium (NaBH4) dans la solution de la perméabilisation diminue le bruit de fond et, avec plus de temps d’incubation des échantillons avec des anticorps primaires et secondaires, facilité coloration en profondeur dans les tissus. En outre, l’utilisation de PVA dans la perméabilisation et solutions de lavage empêche particules parasites d’adhérer au tissu17,18.
Dans ce protocole, ovaires sains cultivés seront fixe à la membrane de l’insert, tandis que les ovaires malsaines peuvent en détacher lors de la fixation et la manipulation. Tissu lâche de manutention avec une pince endommagera l’ovaire et l’imagerie susceptibles de compromis. Par ailleurs, tissu lâche peut être incorporé dans 5 % des prises d’agarose ou manipulé avec pipettes de transfert, tant que la pointe d’ouverture est suffisamment large ne pas pour l’endommager. En ce qui concerne l’immunomarquage, anticorps primaires autres que ceux utilisés dans le présent protocole peuvent effectuer différemment et peuvent nécessiter l’optimisation dans les étapes d’incubation et la perméabilisation.
Enfin, le protocole décrit une approche alternative pour quantifier les follicules de jeunes ovaires comparativement à paraffine traditionnelle intégrée sériées ou autre décrite précédemment dosage volumétrique des follicules de support entier images 5 , 9 , 16. en fonction des exigences du chercheur, la procédure pour quantification ovocyte décrite dans le protocole peut également être utilisé les caractériser différents stades de développement folliculaire19. La zone de particules produite par le logiciel peut être utilisée pour déterminer le diamètre de la cellule et ainsi déduire la phase folliculaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Rebecca Williams et Johanna Dela Cruz de l’imagerie de BRC de Cornell et Andrew Recknagel suggestions utiles et assistance technique. Ce travail a été soutenu à des instituts nationaux d’octroi de santé S10-OD018516 (à Cornell Imaging Facility), T32HD057854 à J.C.B. et R01-GM45415 à J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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