Summary
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare i follicoli nelle ovaie colte di giovani topi senza sezionamento seriale. Mediante immunofluorescenza di intero organo e tessuto di compensazione, sezionamento fisico viene sostituito con sezionamento ottico. Questo metodo di preparazione del campione e visualizzazione mantiene l'integrità dell'organo e facilita la quantificazione automatizzata di cellule specifiche.
Abstract
Ricerca nel campo della biologia riproduttiva nei mammiferi spesso coinvolge valutare la salute generale delle ovaie e testicoli. In particolare, nelle femmine, fitness ovarico è spesso valutata da visualizzare e quantificare i follicoli e gli ovociti. Perché l'ovaio è un tessuto tridimensionale opaco, gli approcci tradizionali richiedono faticosamente affettare il tessuto in numerose sezioni di serie al fine di visualizzare le cellule in tutto l'intero organo. Inoltre, poiché la quantificazione di questo metodo implica, generalmente, segnando solo un sottoinsieme delle sezioni separate dal diametro approssimativo di un ovocita, è incline ad inesattezza. Qui, un protocollo è descritto che invece utilizza organo intero tessuto compensazione e colorazione di immunofluorescenza delle ovaie del mouse per visualizzare i follicoli e gli ovociti. Rispetto ad approcci più tradizionali, questo protocollo è vantaggioso per la visualizzazione di celle all'interno dell'ovaio per numerose ragioni: 1) l'ovaio rimane intatto in tutta la preparazione del campione e trattamento; 2) piccole ovaie, che sono difficili da sezione, possono essere esaminate con facilità; 3) cellulare quantificazione avviene più facilmente e con precisione; e 4) l'intero organo imaged.
Introduction
Al fine di studiare la composizione cellulare e caratteristiche morfologiche delle ovaie dei mammiferi, gli scienziati spesso si affidano in vivo esperimenti seguiti dalla macchiatura immunohistological delle ovaie di paraffina. Più recentemente comunque, coltura di organo intero ovaio ha dimostrato di essere un'alternativa efficace per studiare la funzione ovarica1,2,3,4 perché la tecnica può essere accoppiata con migliore visualizzazione e strumenti di quantificazione. Tradizionalmente, analisi della morfologia ovarica dipende dalla ricostruzione tridimensionale ovarico architettura dalla paraffina sezioni di serie, ma, oltre ad essere laboriosa e richiede tempo, sezionamento in serie del tessuto paraffina non garanzia di ricostruzione adeguata dell'organo, e sezioni sono spesso persi o mis-ordinati nel processo.
Oltre le sfide tecniche associate di sezionamento seriale, ci sono inoltre variazioni nei metodi abitualmente utilizzati per quantificare numeri follicolo per ovaia5,6. La variabilità metodologica attualmente utilizzata altera la meta-analisi della riserva ovarica attraverso studi5,7. Ad esempio, numeri di follicolo da articoli di ricerca diversi possono variare da 10 volte o più tra simili età inerente allo sviluppo all'interno di un ceppo specifico6. Queste grandi differenze nella quantificazione riferito follicolo possono portare a confusione e hanno ostacolato i confronti Croce-Studio. Sperimentalmente, gli approcci tradizionali alla quantificazione del follicolo da sezioni di serie vengono eseguiti da follicoli di un numero predeterminato di sezioni di conteggio (ad esempio, ogni quinto, decimo, o altra sezione). Variabilità nei conteggi di follicolo utilizzando questo approccio deriva non solo dalla periodicità in quali sezioni sono contati, ma anche da variazioni di spessore della sezione e l'esperienza tecnica nella generazione di sezioni di serie5,6. Oltre alla sua variabilità, un altro svantaggio del taglio di tessuto tradizionale è che il sezionamento delle ovaie piccole dagli animali giovani è particolarmente difficile e dipende molto dal tessuto orientamento8.
Il protocollo sottostante descrive un ovaio ordinariamente usato cultura tecnica1 ma migliora notevolmente sulla quantificazione del follicolo tradizionale sostituendo sezionamento fisico con il tessuto di compensazione e sezionamento ottico mediante microscopia confocale8 ,9. Pulizia con immersione del tessuto (senza la necessità di transcranial aspersione o elettroforesi) in un - e sorbitolo-a base di urea soluzione (ad es., ScaleS(0)10) si è rivelato compatibile con immunostaining e ammessi per la riduzione del tempo di compensazione senza compromettere la profondità dell'imaging. Altri metodi segnalati (ad es., ScaleA28,10, SeeDB11, clean12e ClearT212) sono più tempo che consumano o non consentono approfondita risoluzione ottica del campione. Sezionamento ottico è vantaggioso perché è meno laborioso e mantiene l'architettura tridimensionale7,8 dell'organo. Un altro vantaggio di questo approccio è che la preparazione dei campioni non richiede costosi reagenti per cancellare il tessuto e può essere condotta con relativa facilità.
In particolare, il protocollo descritto è stato ottimizzato per le ovaie coltivati del topo al quinto giorno postnatale ma è stato condotto su ovaie che vanno dal giorno postnatale 0 - 10. Il metodo si avvale di un sistema di cultura dell'ovaia in cui il tessuto naturalmente si attacca alla membrana su cui è coltivato, facilitando l'utilizzo dell'organo e manipolazione. Il sistema di cultura descritto può essere utilizzato per mantenere explanted ovaie per fino a 10 giorni e di valutare come le diverse condizioni sperimentali possono interferire con ovocita sopravvivenza13. La procedura di quantificazione descritta viene eseguita utilizzando il pacchetto FIJI-ImageJ14 di elaborazione delle immagini non commerciali e può essere condotta sulla maggior parte dei personal computer. Inoltre, immagini utilizzate per la quantificazione possono essere reso ampiamente disponibile per la comunità scientifica, consentendo in tal modo futura meta-analisi.
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Protocol
Cornell University istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i metodi descritti qui, sotto protocollo 2004-0038 JCS.
1. preparazione di strumenti e mezzi di coltura
- Pulire l'area di lavoro pulito con candeggina al 10% e lasciare che la candeggina rimanere sulla superficie della zona di lavoro per almeno 5 min. Dopo 5 minuti, rimuovere la candeggina in eccesso con carta pulita asciugamani e 70% di etanolo (EtOH). Pulire il microscopio per dissezione accuratamente con 70% EtOH.
Nota: È importante che l'area di lavoro essere almeno semi-sterile per evitare la contaminazione delle colture d'organo. - Avvolgere pulite pinze e le forbici con un tovagliolo di carta inumidito con 70% EtOH fino al momento dell'uso.
Nota: Gli strumenti di dissezione ideale possono variare secondo l'età/dimensioni dell'ovaia. Risultati migliori si ottengono utilizzando un tagliente micro dissezione scissor, due pinze punta fine (sia la numero 5 o 55) e un micro dissezione Forbici iris. - In un tubo conico, portare 50 mL di terreni di coltura dell'ovaia e riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.
- Per rendere il terreno di coltura di ovaio4, supplemento 1 x dispositivo essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, 0,25 µ g/mL Amfotericina B (ad es., 45 mL di MEM, 5 mL di calore inattivato FBS, 1,25 mL di HEPES e 0,5 mL di brodo di x 100 di penicillina, streptomicina e amfotericina B).
- Preparare piatti e inserti prima la cultura dell'ovaia.
- In una cappa di coltura del tessuto, aggiungere 1 mL di terreno di coltura dell'ovaia ad una piastra di coltura del tessuto di 35 mm.
- Pre-immersione inserire membrana con terreno di coltura. Aggiungi media sufficiente, di solito circa 0,55 mL al bene, alla piastra di coltura del tessuto di vettore 24 pozzetti e posto una coltura cellulare inserire nel pozzo. Assicurarsi che la membrana dell'inserto non tocca il supporto.
- Preparare il numero di piastre di 35 mm e pozzetti con inserti di cultura cellulare secondo il numero previsto di ovaie nell'esperimento. Posizionare le piastre di 35 mm contenente 1 mL di terreno di coltura e della placca 24 pozzetti contenenti terreni di coltura e inserti in un 37 ° C e 5% CO2atmosferica incubatore di2 O.
- Organizzare un piatto caldo accanto all'ambito di dissezione e impostare la temperatura a 37 ° C. Mantenere a 37 ° C, 5% CO2 e l'incubatore di2 O atmosferica è vicino alla sala di dissezione.
2. ovaia dissezione e coltura di organo
Nota: Le ovaie possono essere sezionate a temperatura ambiente, purché l'esposizione alla temperatura non ideale è minima.
- Eutanasia i topi femminili postnatale giorno 5, per decapitazione, uno alla volta.
Nota: L'eutanasia dovrà svolgersi secondo le linee guida IACUC presenti presso la struttura dove viene eseguita la ricerca. - Spruzzare l'animale con 70% EtOH. Metti l'animale nella parte superiore il tovagliolo di carta asciutto sotto il microscopio di dissezione. Mettere un piatto di coltura del tessuto 35 mm contenenti terreni di coltura di ovaio vicino il microscopio di dissezione.
- Con pinze o forbici iris micro dissezione, fare un'incisione attraverso la pelle dell'animale e nella cavità addominale, prestando attenzione a non per tagliare negli intestini. Spingere gli intestini fuori della cavità addominale e individuare le ovaie. Estrarre le ovaie e metterli nella piastra di coltura del tessuto 35 mm contenenti terreni di coltura.
- Una volta che le ovaie sono state sezionate dall'animale, è possibile aumentare l'ingrandimento del microscopio dissezione al fine di visualizzare meglio le ovaie e qualsiasi tessuto allegata. Con pinze a punta fine di pulire, rimuovere tutto il tessuto non-ovarico, come bursa e tessuto adiposo. Prestare attenzione a mantenere le ovaie intatte quando si rimuove il tessuto ovarico-non associato.
- Una volta che le ovaie sono isolate, inserire la coppia gli inserti di cultura delle cellule pre-impregnati della placca 24 pozzetti (fare riferimento ai passaggi 1.4.2 e 1.4.3) e regolare il volume del mezzo per assicurare che è sufficiente mantenere l'organo umido (senza completamente sommergendola).
Attenzione: Fare attenzione a non fare un buco nella membrana dell'inserto cultura cellulare quando si trasferiscono le ovaie. - Posto espiantati organi in un 37 ° C e 5% CO2atmosferica incubatore di O2 .
- Ripetere i passaggi da inserire 2.1-2.6 fino a quando le ovaie di ciascun animale sono sezionate e posto sulla coltura delle cellule della piastra 24 pozzetti contenenti il terreno di coltura dell'ovaia.
- Modifica il terreno di coltura dell'ovaia ogni 2 giorni, usando riscaldato aliquote media dell'ovaia da bagnomaria a 37 ° C e procedere alla parte 3 del protocollo nel punto desiderato tempo sperimentale.
3. fissazione del tessuto
- In una provetta conica da 15 mL, preparare la paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS): 1x (ad esempio, aggiungere 2 mL di grado di microscopia elettronica PFA 16% a 6 mL di PBS 1X).
Attenzione: PFA è una sostanza pericolosa e deve essere gestito sotto una cappa chimica. - Difficoltà le ovaie coltivate, senza rimuovere il tessuto dall'inserto di cultura, coprendo il tessuto con la soluzione preparata di PFA 4%. Sigillare i bordi della piastra con adesivo di plastica (per evitare l'evaporazione) e posto i campioni a 4 ° C durante la notte.
Nota: Al fine di facilitare la manipolazione e l'integrità del tessuto, evitare spostando le ovaie dall'inserto di cultura cellulare durante tutta la procedura. Coltivate ovaie attaccate alla superficie dell'inserto sono vantaggiose per la movimentazione senza danneggiare o perdere l'organo. - Sciacquare il tessuto 3 x con 70% EtOH e o procedere con il passo 4.1 o negozio in scintillazione fiale riempita con 70% EtOH a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.
Nota: Se usando il tessuto in modo endogeno che esprimono le proteine fluorescenti, conservare i campioni con 70% EtOH può ridurre notevolmente il segnale. In alternativa, tessuto può essere risciacquato e conservato in PBS con 0,2% di sodio azide (NaN3). NaN3 , tuttavia, è altamente tossico e rappresenta un pericolo di inalazione seria. Rendere la soluzione di riserva nella cappa fumi e gestire indossando appropriati indumenti personali come un cappotto e nitrile guanti di laboratorio.
4. l'intero Monte immunofluorescenza
- Posizionare il tessuto fisso in 1X PBS a RT per un minimo di 4 h prima del passaggio di permeabilizzazione 4.3.
- Preparazione della soluzione di permeabilizzazione e soluzione bloccante.
- Preparare la soluzione di permeabilizzazione come descritto. Di PBS 1X, aggiungere 0,2% di alcol polivinilico (PVA), soluzione di 0,1% sodio boroidruro (NaBH4) (da 12 wt.% in soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 14 M) e 1,5% glicole polietilenico tert -octylphenyl etere (detergente tensioattivo non ionico). In una provetta conica da 50 mL, aggiungere 5 mL di PBS: 10x, 0,1 g di PVA, 50 µ l di NaBH4e 750 µ l di detergente tensioattivo non ionico, quindi aggiungere ultrapura fino a 50 mL di acqua e agitare bene a temperatura ambiente fino a quando il composto è completamente in soluzione.
- Preparare soluzione bloccante come descritto. Per PBS 1X, aggiungere 0,1% tensioattivi non ionici detergente, 0,15% di 2,5 M glicina, pH 7.4, siero di capra normale 10%, 3% albumina di siero bovino (BSA), 0,2% NaN3, 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 0,25 µ g/mL di amfotericina B. preparare una soluzione stock di 2.5 M glicina sciogliendo 93,8 g di glicina in acqua ultrapura ad un volume finale di 500 mL (pH 7,4) e una soluzione di riserva del 10% NaN3 sciogliendo 5 g in 50 mL di acqua distillata; quindi, in una provetta conica da 50 mL preparare la soluzione di blocco aggiungendo 5 mL di PBS 1x 10, 50 µ l di detergente tensioattivo non ionico, 750 µ l di soluzione madre di glicina, 5 mL di siero di capra, 1,5 g di BSA, 1 mL di soluzione madre di NaN3 e 0,5 mL di brodo di x 100 di penicillina, streptomicina e amfotericina B. Aggiungere acqua distillata fino ad un volume finale di 50 mL e siringa filtro la soluzione finale.
- Rimuovere e scartare il PBS 1X dal flaconcino e quindi aggiungere sufficiente soluzione di permeabilizzazione per immergere completamente le ovaie. Il campione viene posto in soluzione di permeabilizzazione su agitatore orbitale (ad esempio, nutator) a temperatura ambiente per 4 h.
Nota: Il tempo di incubazione può variare in funzione dello spessore dell'organo. - Sostituire la soluzione di permeabilizzazione con sufficiente soluzione bloccante per sommergere completamente le ovaie. Sigillare il flaconcino con l'adesivo di plastica e lasciare il tessuto in incubazione per un minimo di 12 ore a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
- Preparare la diluizione di anticorpo primario in soluzione bloccante secondo il datasheet del costruttore.
Nota: Si noti che non tutti gli anticorpi sono compatibili con l'agente di compensazione. Il volume medio necessario per campione è circa 750 µ l.- Per la quantificazione degli ovociti, utilizzare TAp63 (marcatore nucleare dell'ovocita) e MVH (marcatore citoplasmatica delle cellule di germe).
Nota: Gli anticorpi utilizzati nelle immagini di immunofluorescenza sono mouse anti-p63 e coniglio anti-MVH). La soluzione di anticorpo primario può essere riutilizzato 2 volte o più se conservato a 4 ° C tra protocolli di colorazione e gestito correttamente per evitare la crescita batterica.
- Per la quantificazione degli ovociti, utilizzare TAp63 (marcatore nucleare dell'ovocita) e MVH (marcatore citoplasmatica delle cellule di germe).
- Collocare l'inserto contenente il tessuto in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere circa 750 µ l di soluzione di anticorpo primario. Garantire che le ovaie sono completamente sommerse. Sigillare la piastra con adesivo di plastica per minimizzare evaporazione e lasciare il tessuto incubando per 4 giorni a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
- Preparare la soluzione di lavaggio.
- Preparare la soluzione di lavaggio come descritto. Fare 1X PBS, aggiungere 0,2% PVA e 0,15% detergente tensioattivo non ionico. In una provetta conica da 50 mL, aggiungere 5 mL di PBS: 10x, 0,1 g di PVA, 75 µ l di detergente tensioattivo non ionico e acqua ultrapura fino ad un volume finale di 50 mL.
- Rimuovere la diluizione di anticorpo primario e aggiungere una generosa quantità di soluzione di lavaggio. Assicurarsi sempre di immergere le ovaie. Consentire le ovaie in ammollo nella soluzione durante la notte a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
- Sostituire la soluzione di lavaggio e incubare su agitatore orbitale per 2 ore o più.
- Ripetere il passaggio 4.9 una ulteriore tempo.
- Preparare la diluizione di anticorpo secondario nella soluzione di blocco.
Nota: Gli anticorpi secondari utilizzati sono anti-topo 488 tintura fluorescente generato in capra e anti-coniglio 594 tintura fluorescente generato in capra. Vedere il punto 4.5. il volume medio necessario per campione. - Rimuovere la soluzione di lavaggio dalle ovaie e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario. Proteggere i campioni dalla luce (piastra di avvolgere con carta stagnola) e sigillare la piastra con adesivo di plastica per minimizzare evaporazione. Incubare i campioni su agitatore orbitale a temperatura ambiente per 2 giorni.
Nota: Continuare a proteggere i campioni dalla luce utilizzando il foglio di alluminio durante tutte le fasi di incubazione successiva. - Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario dai campioni e aggiungere la soluzione di lavaggio. Incubare su agitatore orbitale per 8 h.
Nota: Se si desidera la macchiatura 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), aggiungere 50 ng/mL di DAPI per la prima fase di lavaggio (~ 8 ore di incubazione). - Sostituire la soluzione di lavaggio per un lavaggio durante la notte.
- Mentre si prepara la soluzione di schiarimento (Vedi sezione 5), sostituire il pernottamento con fresca la soluzione di lavaggio e mantenere i campioni su agitatore orbitale a temperatura ambiente.
5. ovaia di compensazione e di Imaging
- Preparare ScaleS(0) soluzione di compensazione.
- Preparare ScaleS(0) compensazione soluzione10 aggiungendo reagenti nella proporzione specificata: 40% D-(-) sorbitolo (w/v), 10% glicerolo, urea 4,3 M e 20% di dimetilsolfossido (DMSO), pH 8.1 (ad es. in una provetta conica da 50 mL, aggiungere 2,5 mL di glicerolo, 10 g di sorbitolo , 5 mL di DMSO e 12 mL di urea 9 M per un volume totale di 25 mL. Mescolare la soluzione di inversione a 50 ° C per 30 min e degassare prima dell'uso).
- Rimuovere la soluzione di lavaggio e immergere i campioni in soluzione di compensazione. Per ottenere risultati migliori mantenere campioni su agitatore orbitale.
- Sostituire la soluzione di schiarimento 2 volte al giorno fino a quando il tessuto diventa trasparente (circa 2 giorni).
- Una volta che il tessuto è deselezionato, preparare il campione per l'imaging rimuovendo con cura la membrana inserto contenente le ovaie coltivate con una multa punta di bisturi e posizionando il campione su un vetrino.
- Procedere per i campioni su un microscopio in grado di sezionamento ottico di imaging.
6. ovocita quantificazione
Nota: Ci sono molti programmi di diversi computer che sono in grado di quantificare le cellule. Descritto di seguito è un protocollo per la quantificazione degli ovociti utilizzando il pacchetto di elaborazione di immagine non-commerciale, FIJI-ImageJ14.
- Utilizzando una proiezione bidimensionale intensità massima della serie immagine dello stack Z -per i marcatori cellulari specifici di interesse (senza il canale DAPI), convertire l'immagine in un'immagine di 8 bit bianca e nero sotto tipo in discesa l'immagine dal menu.
- Sotto il menu a discesa immagine , selezionare la scheda di regolazione e quindi selezionare soglia.
- Regolare manualmente la soglia ad un livello che meglio identifica ogni ovocita individuo. Una volta determinato il livello, fare clic su applica per generare un'immagine in bianco e nero. Una volta completato, è possibile quantificare il campione delineating usando l'icona ovale o Freehand .
Nota: Figi-ImageJ ha diverse opzioni per ottimizzare l'immagine che verrà utilizzata per la quantificazione delle particelle. Per esempio, nel processo di | Binario scheda, ci sono diverse opzioni che possono essere utilizzati per migliorare la rilevazione di ciò che sarà conteggiato. In Figura 4, le opzioni utilizzate per meglio individuare follicoli era Erode, seguita da riempire i buchie infine spartiacque. - Selezionare dal menu a discesa analizza , analizza le particelle. Impostare i parametri secondo la risoluzione desiderata.
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Representative Results
Questo protocollo comprende 6 fasi principali dopo la dissezione delle ovaie, come indicato nella Figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 evidenziare le caratteristiche più innovative del presente protocollo, che includono l'ottimizzazione del tessuto di compensazione per le ovaie e la quantificazione di ovocita intero tessuto utilizzando FIJI-ImageJ. La Figura 2A Mostra immagini di un incolto 5-giorno postnatale dell'ovaia fisso prima (sinistra) e 1 h dopo (adestra) aggiungendo soluzione schiarimento all'ovaia. L'ovaio inizierà a diventare traslucido pochi minuti essere stato immerso in soluzione di compensazione. Una volta eliminato, ovaie piccole come quella fotografata in Figura 2A diventano difficili da gestire senza danneggiare. Pertanto, lavorare con ovaie explanted coltivate è vantaggioso perché diventano associati alla superficie porosa della membrana inserto su cui vengono coltivati. Collegamento dell'ovaia alla membrana inserto permette lo sperimentatore gestire l'inserimento della membrana, piuttosto che l'ovaio stesso (Figura 2B e Figura 3). Inoltre, fonderanno ovaie coltivate nelle immediate vicinanze e Figura 2B spettacoli collegato ovaie fuse prima (sinistra) e dopo (a destra) su ematossilina di schiarimento macchiato campioni.
Eseguire il sezionamento ottico delle ovaie coltivate senza compensazione è possibile; Tuttavia, le cellule profonde all'interno del tessuto hanno un segnale che è difficile distinguere dallo sfondo e questa mancanza di segnale chiaro ostacola quantificazione corretta degli ovociti (Figura 3A). In contrasto con la Figura 3A, Figura 3B è un'immagine rappresentativa di un campione deselezionata in cui è possibile quantificazione degli ovociti durante tutto l'intero organo. Figura 3B dimostra che imaging organo intero delle ovaie coltivate cancellate può essere condotta senza una significativa perdita di segnale profondo all'interno del tessuto e immagini come quella indicata (Figura 3B) può essere facilmente quantificato. Un approccio per quantificare gli ovociti in esempi come questi è convertendo la serie Z-stack di sezioni ottiche in una proiezione di intensità massima e poi ulteriormente l'elaborazione del file con un pacchetto di elaborazione di immagine. Figura 4 e Figura 1 supplementare evidenziare i passaggi utilizzati per quantificare il numero di ovociti in Figura 3B utilizzando FIJI-ImageJ. Supplemental tabella 1 include quantificazione delle particelle (ovocita) di FIJI-ImageJ. Quantificazione delle particelle utilizzando questo metodo inoltre permette l'analisi di diversi follicoli basato sulla dimensione degli ovociti, perché informazioni su sia il numero di particelle e della corrispondente zona di ogni particella sono calcolati dal software e comunicate alla utente.
Figura 1: rappresentazione schematica del protocollo intero. Riepilogo visivo dell'inizio protocollo con dissezione dell'ovaia (1), seguita dalla cultura di ovaio (2), fissazione del tessuto con 4% PFA (3), immunostaining usando gli anticorpi specifici (4), compensazione del tessuto per profondo imaging (5), ottenendo la sezione ottica utilizzando un microscopio confocale (6) e termina con quantificazione degli ovociti (7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: differenza di opacità del tessuto tra le ovaie non liquidate e liquidate. (A) dell'ovaia da un giorno postnatale cinque pup senza cancellare (a sinistra) e dopo lieve schiarimento di circa 1 h (a destra). (B) ovaie più coltivate nella prossimità vicina a vicenda per sette giorni. Vengono visualizzati due diversi ingrandimenti di ogni campione. Immagini a sinistra sono senza immagini di compensazione e all'estrema destra sono con schiarimento. Ovaie attribuiranno alla membrana dell'inserto cultura e possono essere gestite meglio se mantenuto allegata in tutto il protocollo. Al fine di migliorare il contrasto del tessuto per l'imaging con luce bianca, le ovaie sono stati sommersi in ematossilina per 5 min dopo la fissazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: formazione immagine di immunofluorescenza delle ovaie non liquidate e liquidate. Ovaie da cuccioli postnatale giorno 5 sono state coltivate per 7 giorni e tinto secondo l'intero supporto l'immunofluorescenza che macchia protocollo descritto. In rosso è etichettate con omologo di mouse vasa (MVH) per identificare le cellule germinali e in verde le cellule sono cellule identificate con il nucleare dell'ovocita specifico marcatore, p63. DAPI, in blu, è stato usato per etichettare tutti i nuclei delle cellule. (A) immagine di immunofluorescenza delle ovaie senza compensazione. (B) immagine di immunofluorescenza delle ovaie con schiarimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: flusso di lavoro Visual per come quantificare gli ovociti utilizzando software di FIJI-ImageJ. Al fine di facilitare l'analisi dei dati, immagini derivate dagli aerei confocal possono essere ridotto a una proiezione di massima intensità invece di un'immagine 3D. Con la proiezione di massima intensità, l'utente può definire i parametri di soglia di immagine in modo tale che le particelle di destinazione diventano evidenti. Una volta ottenuta l'immagine semplificata, il software è usato per contare gli ovociti. Esaminare criticamente immagini durante l'impostazione dei parametri è cruciale. Questa figura mostra un esempio di come è possibile impostare la soglia di particella/ovocita. Il testo sopra ogni immagine mette in evidenza il parametro utilizzato per ottenere quell'immagine in FIJI-ImageJ. Il software genera una tabella con la misura di superficie delle particelle (Vedi Supplemental tabella 1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: flusso di lavoro Visual per come quantificare gli ovociti utilizzando software di FIJI-ImageJ (ingrandimento minore). Questa figura mostra la quantificazione degli ovociti per due ovaie nelle immediate vicinanze. I passaggi eseguiti sono lo stesso come in Figura 4. 2.436 particelle/follicoli sono stati contati dal software. Dati di quantificazione ottenuti dal software si trovano nella tabella supplementare 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare tabella 1: quantificazione del follicolo calcolato da FIJI-ImageJ. Questa tabella contiene l'elenco dei follicoli contati e della corrispondente zona generato dall'immagine nella Figura 1 supplementare. La dimensione delle particelle, utilizzata per la quantificazione è stata impostata da 10 µm2-infinito. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Lo studio della riproduzione dei mammiferi richiede utilizzando e quantificare le cellule specializzate che non sono ordinariamente favorevoli alla coltura delle cellule. Tuttavia, sistemi di coltura ex vivo sono efficaci a mantenere dell'ovaia e del follicolo vitalità1,15. Durante la coltura di ovaio, il tessuto richiede una maggiore superficie per lo scambio di sostanze nutritive tramite diffusione. Di conseguenza, 5 - giorno vecchio mouse ovaie sono ideali in dimensione e forma per coltura di organo. Questo protocollo è stato ottimizzato per ovaie mantenute per sette giorni nella cultura, ma dell'ovaia cultura lunghezza può essere regolata secondo la specifica domanda scientifica1,4. Risultati comparabili sono stati raggiunti in ovaie colture per appena tre giorni e fino a dieci giorni (dati non mostrati), ma le ovaie da animali di età superiore ai dieci giorni sono grandi e cultura non può essere efficace, evidenziando così una limitazione del protocollo.
Se ex vivo coltura dell'ovaia non è necessario, è possibile fissare e macchia più anziani ovaie con il protocollo descritto, anche se le modifiche potrebbero essere necessario regolare per la più grande tessuto dimensione9,16. Il protocollo di colorazione descritto dipende dalla diffusione passiva degli anticorpi nell'organo, che indica che è possibile macchiare le grandi ovaie con entrambi passi più lunghi di incubazione dell'anticorpo o suddividendo il tessuto in pochi pezzi più piccoli che possono essere ricostruito dopo formazione immagine. L'uso di urea e sorbitolo in ScaleS(0) intermedium ha dimostrato efficace per ovaie coltivate neonatale perché ha richiesto un periodo di incubazione più breve rispetto a quelli riportati per gli agenti di schiarimento con urea e glicerolo (ScaleA2)8,10 . Inoltre, l'uso di una bassa concentrazione di sodio boroidruro (NaBH4) della soluzione di permeabilizzazione ha fatto diminuire il rumore di fondo e, insieme con le incubazioni più lungo dei campioni con anticorpi primari e secondari, facilitato la macchiatura profondo all'interno del tessuto. Inoltre, l'uso di PVA nella permeabilizzazione e soluzioni di lavaggio impedisce particelle spurie di attaccarsi al tessuto17,18.
In questo protocollo, ovaie sane coltivate attribuirà alla membrana inserto, mentre malsane ovaie possono staccare da esso caso di fissazione e di gestione. Gestione tessuto allentato con il forcipe danneggia l'ovaia e la formazione immagine probabile compromesso. In alternativa, tessuto allentato può essere incorporato nel 5% spine dell'agarosi o maneggiato con pipette di trasferimento fino a quando la punta di apertura è sufficientemente larga per non danneggiarlo. Per quanto riguarda immunostaining, gli anticorpi primari diversi da quelli utilizzati nel presente protocollo possono essere eseguita in modo diverso e possono richiedere ottimizzazione nei passaggi permeabilizzazione e incubazione.
Infine, il protocollo descrive un approccio alternativo verso quantificare follicoli dalle ovaie giovane rispetto alle sezioni di serie incastonato tradizionale di paraffina o altro precedentemente descritta quantificazione volumetrica dei follicoli da intero supporto immagini 5 , 9 , 16. in base ai requisiti del ricercatore, la procedura per quantificazione degli ovociti descritto nel protocollo può anche essere utilizzato il caratterizzare diverse fasi di sviluppo follicolare19. L'area delle particelle generata dal software può essere utilizzato per determinare il diametro delle cellule e così dedurre fase follicolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Rebecca Williams e Johanna Dela Cruz da BRC di Cornell, l'Imaging e Andrew Recknagel per utili suggerimenti e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di sovvenzione di salute S10-OD018516 (per Imaging Facility cornelliano), T32HD057854 a j.c.b. e R01-GM45415 per J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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