Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera folliklar i odlade äggstockarna av unga möss utan seriell sektionering. Använda hela orgel immunofluorescens och vävnad clearing, ersätts fysiska snittning med optisk snittning. Denna metod för provberedning och visualisering underhåller orgel integritet och underlättar automatiserade kvantifiering av specifika celler.
Abstract
Forskning inom området för däggdjur reproduktionsbiologi innebär ofta utvärdera övergripande hälsa för äggstockar och testiklar. Specifikt, i kvinnor bedöms cystor fitness ofta av visualisera och kvantifiera folliklar och oocyter. Eftersom äggstockarna är en ogenomskinlig tredimensionella vävnad, kräver traditionella metoder mödosamt skivning vävnaden i många seriella sektioner för att visualisera cellerna i hela hela orgeln. Dessutom eftersom kvantifiering av denna metod innebär vanligtvis scoring endast en delmängd av avsnitten åtskilda av ungefärlig diameter en äggcell, är det benägna att felaktighet. Här beskrivs ett protokoll som istället utnyttjar hela orgel vävnad clearing och immunofluorescens färgning av mus äggstockarna att visualisera folliklar och oocyter. Jämfört med mer traditionella metoder, detta protokoll är fördelaktigt för att visualisera celler i äggstocken för många skäl: 1) äggstocken förblir intakt under hela provberedning och bearbetning. (2) små äggstockar, som är svåra att avsnitt, kan undersökas med lätthet; (3) cellulär kvantifiering uppnås lättare och korrekt; och 4) hela orgeln avbildas.
Introduction
För att studera cellulära sammansättningen och morfologiska egenskaper av däggdjur äggstockar, forskare förlitar sig ofta på i vivo experiment följt av immunohistological färgning av paraffin inbäddade äggstockarna. Mer nyligen dock hela äggstocken orgelkultur har visat sig vara ett effektivt alternativ till studien äggstockarnas funktion1,2,3,4 eftersom tekniken kan kopplas till bättre visualisering och verktyg för kvantifiering. Traditionellt, analys av äggstockscancer morfologi är beroende av rekonstruktionen tredimensionella cystor arkitekturen från paraffin inbäddade seriell avsnitt, men, förutom att vara mödosam och tidskrävande, seriellt snittning paraffin inbäddade vävnad gör inte garanti ordentlig ombyggnad av orgeln, och sektioner ofta förloras eller mis beställde i processen.
Förutom de tekniska utmaningar i samband med seriell sektionering, finns det också variationer i de metoder som rutinmässigt används för att kvantifiera follikeln nummer per äggstock5,6. Det metodologiska variabilitet som för närvarande används försämrar meta-analys av äggreserven över studier5,7. Till exempel varierar follikeln nummer från olika forskningsartiklar 10-faldig eller mer mellan liknande utvecklingsmässiga åldrar inom en viss stam6. Dessa stora skillnader i rapporterade follikeln kvantifiering kan leda till förvirring och har hindrat cross-studien jämförelser. Experimentellt, traditionella metoder för follikeln kvantifiering från seriell avsnitt utförs genom att räkna folliklar av ett fördefinierat antal sektioner (t.ex. var femte, tionde, eller andra avsnitt). Variabilitet i follikeln räknar med detta synsätt uppstår inte bara från periodiciteten i vilka delar räknas men även från variationer i snittjocklek och teknisk erfarenhet inom generera serial avsnitten5,6. Förutom dess variationer är en annan nackdel med traditionell vävnad snittning att snittning av små äggstockar från unga djur är särskilt utmanande och starkt beroende av vävnad orientering8.
Protokollet nedan beskriver en rutinmässigt används äggstock kultur teknik1 men förbättrar kraftigt traditionella follikeln kvantifiering genom att ersätta fysiska snittning med vävnad clearing och optisk snittning med konfokalmikroskopi8 ,9. Rensa med vävnad nedsänkning (utan behovet av transkraniell perfusion eller elektrofores) i en urea - och sorbitol-baserade lösning (t.ex. ScaleS(0)10) visat sig vara kompatibla med immunfärgning och tillåtet för minskning av avfärgningstiden utan att kompromissa med djup Imaging. Andra rapporterade metoder (t.ex., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12och ClearT212) är antingen mer tidsödande eller Tillåt inte djupgående optisk upplösning av provet. Optisk snittning är fördelaktigt eftersom det är mindre arbetsintensivt och upprätthåller de en orgel tredimensionella arkitektur7,8. En annan fördel med denna metod är att beredningen av proverna inte kräver kostsamma reagenser att rensa vävnaden och kan utföras med relativ lätthet.
Specifikt, det protokoll som beskrivs har optimerats för odlade mus äggstockarna på postnatal dag fem men har utförts på äggstockarna alltifrån postnatal dag 0 - 10. Metoden använder sig av en äggstock kultur system där vävnaden naturligt tillmäter membranet som är det odlade, underlätta orgel hantering och manipulation. Kultur systemet beskrivs kan användas för att upprätthålla explanterad äggstockarna för upp till 10 dagar och att bedöma hur olika experimentella förhållanden kan störa äggcellen överlevnad13. Rapporteringsgräns förfarandet utförs med icke-kommersiella bildbehandling paketet FIJI-ImageJ14 och kan utföras på de flesta persondatorer. Bilder som används för kvantifiering kan dessutom göras allmänt tillgängliga för forskarsamhället, vilket möjliggör framtida metaanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cornell Universitys institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) har godkänt alla de metoder som beskrivs här, enligt protokoll 2004-0038 till JCS.
1. beredning av instrument och kultur Media
- Torka av arbetsområdet rent med 10% blekmedel och tillåta lut kvar på ytan med arbete området i minst 5 min. Efter 5 min, ta bort överflödig lut med rent hushållspapper och 70% etanol (EtOH). Rengöra mikroskopet dissekera noggrant med 70% EtOH.
Obs: Det är viktigt att arbetsområdet är åtminstone delvis sterila att undvika kontaminering av orgel kulturer. - Wrap ren pincett och sax med en pappershandduk som fuktats med 70% EtOH fram till tidpunkten för användning.
Obs: De idealiska dissektion verktyg kan variera beroende på ålder/storleken på äggstocken. Bästa resultat erhålls med hjälp av en vass micro dissekera sax, två fina spetsen pincett (antingen nummer 5 eller 55) och en micro dissekera iris sax. - I ett koniskt rör, göra 50 mL av äggstocken kulturmassmedia och varm i 37 ° C vattenbad.
- För att göra äggstock odlingsmedium4, komplettera 1 x Minimal Essential Media (MEM) med 10% fetalt bovint Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 0,25 µg/mL Amfotericin B (t.ex. 45 mL av MEM, 5 mL av värme inaktiverat FBS, 1,25 mL HEPES och 0,5 mL av 100 x lager av penicillin, streptomycin och amfotericin B).
- Förbereda plåtar och skär före äggstock kulturen.
- I en vävnadskultur huva, tillsätt 1 mL av äggstocken odlingsmedium på en 35 mm vävnadsodling tallrik.
- Före blöt infoga membran med odlingssubstratet. Lägga till tillräckligt många media, vanligtvis ca 0,55 mL per väl, med 24-väl carrier vävnadsodling plattan, och placera en cellkultur infoga i brunnen. Kontrollera att skärets membran berör media.
- Förbereda antalet 35 mm plattor och brunnar med cell kultur skär enligt det förväntade antalet äggstockarna i experimentet. Placera de 35 mm plattor innehållande 1 mL odlingssubstrat och 24-väl carrier plattan som innehåller kultur media och skär i en 37 ° C, 5% CO2och atmosfäriska O2 inkubator.
- Ordna en värmeplatta bredvid dissektion tillämpningsområdet och Ställ in temperaturen till 37 ° C. Hålla en 37 ° C, 5% CO2 och atmosfäriska O2 inkubatorn nära dissektion rummet.
2. äggstocken dissektion och orgelkultur
Obs: Äggstockarna kan vara dissekeras i rumstemperatur så länge exponering för icke-ideala temperaturen är minimal.
- Avliva honmöss postnatal dag 5, genom halshuggning, en i taget.
Obs: Dödshjälp måste utföras enligt IACUC riktlinjer närvarande vid anläggningen där forskningen utförs. - Spray djuret med 70% EtOH. Placera djuret på toppen av torr pappershandduk under mikroskopet dissektion. Placera en 35 mm vävnadsodling maträtt som innehåller äggstockarna kulturmassmedia nära mikroskopet dissektion.
- Med pincett eller en mikro dissektion iris sax, gör ett snitt genom huden av djuret och in i bukhålan, med försiktighet inte för att skära i tarmarna. Driva tarmarna ur bukhålan och lokalisera äggstockarna. Extrahera äggstockarna och placera dem i 35-mm vävnadsodling skålen som innehåller kultur media.
- När äggstockarna har varit dissekerade från djuret, öka förstoringen av mikroskopet dissektion för att bättre visualisera äggstockarna och bifogade vävnad. Med ren fin spets pincett, ta bort alla icke-äggstocksvävnad, såsom bursa och fettvävnad. Var noga med att hålla äggstockarna intakt när du tar bort den bifogade icke-äggstocksvävnad.
- När äggstockarna är isolerade, placera paret i pre blötläggas cell kultur skär av transportören 24-väl plattan (se steg 1.4.2 och 1.4.3) och justera volymen på medellång och säkerställa att det är tillräckligt att hålla orgeln fuktiga (utan helt dränka det).
Varning: Var noga med att inte peta ett hål i membranet i cellen kultur Skäret vid överföring av äggstockarna. - Explanterad plats organ i en 37 ° C, 5% CO2och atmosfäriska O2 inkubator.
- Upprepa steg 2.1-2.6 tills äggstockarna hos varje djur är dissekeras och placeras på cellkulturen infoga Skyltens 24 brunnar innehållande äggstock odlingssubstratet.
- Förändring äggstock odlingssubstratet varannan dag, använder värmde äggstock media alikvoter från 37 ° C vattenbad och gå vidare till Del3 i protokollet vid önskad experimentell tidpunkten.
3. vävnad fixering
- I en 15 mL koniska rör, förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (t.ex. Tillsätt 2 mL av 16% PFA elektronmikroskopi grad till 6 mL 1 x PBS).
Försiktighet: PFA är ett farligt ämne och bör hanteras under en kemisk huva. - Fixa odlade äggstockarna, utan att ta bort vävnad från kultur skäret, genom att täcka vävnaden med nylagade 4% PFA lösningen. Försegla kanterna på plattan med plast lim (för att undvika avdunstning) och placera proverna vid 4 ° C över natten.
Obs: För att underlätta hantering och vävnad integritet, Undvik undantränger äggstockarna cell kultur infoga under hela förfarandet. Odlade äggstockar kopplad till ytan av Skäret är fördelaktiga för hantering utan att skadas eller förlora orgeln. - Skölj vävnaden 3 x med 70% EtOH och antingen gå vidare till steg 4.1 eller lagra den i scintillation injektionsflaskor fylld med 70% EtOH vid 4 ° C tills vidare bearbetning.
Obs: Om du använder vävnad endogenously uttrycker fluorescerande proteiner, förvaring av prov med 70% EtOH kan kraftigt minska signalen. Alternativt kan vävnad sköljas och lagras i PBS med 0,2% natriumazid (NaN3). NaN3 är dock mycket giftiga och utgör en fara för allvarliga inandning. Gör stamlösning i dragskåp och hantera bära lämplig personlig skyddsutrustning såsom ett laboratorium kappa och nitril handskar.
4. hela Mount immunofluorescens
- Placera den fasta vävnaden i 1 x PBS på RT för minst 4 h före steget permeabilisering 4.3.
- Förbered permeabilisering lösning och blockerande lösning.
- Bered permeabilisering som beskrivs. Till 1 x PBS, tillsätt 0,2% polyvinylalkohol (PVA), 0,1% natrium natriumborhydrid (NaBH4) lösning (från 12 wt.% i 14 M lösning av natriumhydroxid (NaOH)) och 1,5% polyetylenglykol tert -octylphenyl eter (icke-jonisk tensid tvättmedel). I en 50 mL konisk tub, tillsätt 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 50 µL av NaBH4och 750 µL av icke-jonisk tensid tvättmedel och sedan lägga till ultrarent vatten upp till 50 mL och skaka väl i rumstemperatur tills blandningen är helt i lösningen.
- Bered blockerande som beskrivs. Till 1 x PBS, Lägg 0,1% icke-jonisk tensid tvättmedel, 0,15% 2,5 M glycin pH 7,4, 10% normala get serum, 3% bovint serumalbumin (BSA), 0,2% NaN3100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 0,25 µg/mL amfotericin B. förbereda en stamlösning av 2,5 M glycin genom upplösning 93,8 g av glycin i ultrarent vatten till en 500 mL slutlig volym (pH 7,4) och en stamlösning av 10% NaN3 genom upplösning 5 g i 50 mL ultrarent vatten; sedan, i en 50 mL konisk tub förbereda blockerande lösningen genom att tillsätta 5 mL 10 x PBS, 50 µL av icke-jonisk tensid tvättmedel, 750 µL av glycin stamlösning, 5 mL av geten serum, 1,5 g BSA, 1 mL NaN3 stamlösning , och 0,5 mL av 100 x lager av penicillin, streptomycin och amfotericin B. Lägg till ultrarent vatten upp till en slutlig volym 50 mL och spruta filter den slutliga lösningen.
- Ta bort och kassera 1 x PBS från injektionsflaskan och sedan lägga till tillräckligt permeabilisering lösning för att helt dränka äggstockarna. Placera provet i permeabilisering lösning i orbitalskak (t.ex. nutator) vid rumstemperatur i 4 h.
Obs: Inkubationstiden kan variera tjockleken orgel. - Ersätta den permeabilisering lösningen med tillräckligt blockerande lösning att helt dränka äggstockarna. Försegla injektionsflaskan med plast limmet och lämna vävnaden inkubation i minst 12 timmar vid rumstemperatur i orbitalskak.
- Förbereda primär antikropp utspädning i blockerande lösning enligt tillverkarens datablad.
Obs: Observera att inte alla antikroppar är kompatibel med clearing agent. Den genomsnittliga volymen som behövs per prov är ca 750 µL.- För äggcell kvantifiering, Använd TAp63 (nuclear äggcellen markör) och MVH (cytoplasmiska bakteriecellen markör).
Obs: De antikroppar som används i immunofluorescens bilderna är musen anti-p63 och kanin anti-MVH). Primär antikropp lösningen kan vara återanvända 2 x eller mer om lagras vid 4 ° C mellan färgprotokoll och hanteras på rätt sätt för att undvika bakterietillväxt.
- För äggcell kvantifiering, Använd TAp63 (nuclear äggcellen markör) och MVH (cytoplasmiska bakteriecellen markör).
- Placera insatsen som innehåller vävnaden i en 24-väl tallrik och tillsätt ca 750 µL primär antikropp lösning. Se till att äggstockarna är helt nedsänkt. Försegla plattan med plast lim att minimera avdunstning och lämna vävnaden inkubation för 4 dagar vid rumstemperatur i orbitalskak.
- Förbered tvättlösningen.
- Förbered tvättlösningen som beskrivs. Gör 1 x PBS, tillsätt 0,2% PVA och 0,15% icke-jonisk tensid rengöringsmedel. Tillsätt 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 75 µL av icke-jonisk tensid tvättmedel och ultrarent vatten upp till en slutlig volym 50 ml i en 50 mL konisk tub.
- Ta bort primär antikropp utspädning och Lägg generöst med tvättlösningen. Se alltid till att dränka äggstockarna. Tillåta äggstockarna i blöt i lösningen över natten i rumstemperatur på den roterande blandare.
- Ersätta tvättlösningen och inkubera i orbital shaker för 2 h eller mer.
- Upprepa steg 4,9 en ytterligare gång.
- Bered den sekundära antikroppar utspädningen i blockering lösning.
Obs: De sekundära antikroppar som används är antimus 488 fluorescerande färgämne upp i get- och anti-kanin 594 fluorescerande färgämne upp i geten. Se steg 4,5. för den genomsnittliga volymen som behövs per prov. - Avlägsna tvättlösningen från äggstockarna och lägga till sekundära antikroppar lösning. Ljuskänsligt proverna (wrap plattan med aluminiumfolie) och försegla plattan med plast lim att minimera avdunstning. Inkubera prover i orbitalskak i rumstemperatur i 2 dagar.
Obs: Fortsätta skydda proverna från ljus med hjälp av aluminiumfolie under alla efterföljande inkubationsstegen. - Ta bort sekundär antikropp lösning från proverna och Lägg tvättlösningen. Inkubera i orbitalskak för 8 h.
Obs: Om 4,6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning önskas, tillsätt 50 ng/mL DAPI till första tvättningen (~ 8 h inkubation). - Ersätta tvättlösningen för en övernattning tvätta.
- Medan du förbereder clearing lösningen (se avsnitt 5), ersätta övernattnings tvättlösningen med färsk lösning och förvara proverna i den roterande skakapparaten i rumstemperatur.
5. äggstockarna Clearing och Imaging
- Förbered ScaleS(0) clearing lösning.
- Förbereda ScaleS(0) clearing lösning10 genom att lägga till reagenser i viss proportion: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glycerol, 4,3 M urea och 20% dimetyl sulfoxid (DMSO), pH 8,1 (t.ex. i en 50 mL konisk tub, tillsätt 2,5 mL glycerol, 10 g sorbitol , 5 mL av DMSO och 12 mL 9 M urea för en total volym på 25 mL. Blanda lösningen genom inversion vid 50 ° C i 30 min och degas före användning.)
- Avlägsna tvättlösningen och dränka proverna i clearing lösning. Upprätthålla prover på den roterande blandare för bättre resultat.
- Ersätta den röjningen lösningen 2 x dagligen tills vävnaden blir transparent (cirka 2 dagar).
- När vävnaden är avmarkerad, förbereda provet för avbildning genom att noggrant avlägsna infoga membranet som innehåller odlade äggstockarna med en fin spets skalpell och placera provet på en glasskiva.
- Gå vidare till imaging proverna på Mikroskop kan optisk snittning.
6. äggcellen kvantifiering
Obs: Det finns många olika datorprogram som klarar att kvantifiera celler. Beskrivs nedan är ett protokoll för äggcell kvantifiering med hjälp av icke-kommersiell bearbetning avbildningspaketet, FIJI-ImageJ14.
- Använda en tillplattad maximalstyrkan projektion av Z -stack bilden serien på specifika cellulära markörer av intresse (utan kanalen DAPI), konvertera bilden till en svart och vit 8-bitars bild under typ i listrutan bild menyn.
- Under bilden nedrullningsbara menyn Markera fliken Justera och välj sedan tröskeln.
- Manuellt justera tröskeln till en nivå som bäst identifierar varje enskilda äggcellen. När nivån bestäms, klicka på Verkställ för att generera en svartvit bild. En gång fullständig, kvantifiera provet undersökning med ikonen Oval eller Freehand .
Obs: FIJI-ImageJ har olika alternativ för att finjustera bilden som kommer att användas för partikel kvantifiering. Exempelvis i Process | Binära flik, det finns olika alternativ som kan användas för att förbättra upptäckten av vad som ska räknas. I figur 4var de alternativ som används för att bättre individualisera folliklar erodera, följt av fylla hål, och slutligen vattendelare. - Under analysera nedrullningsbara menyn, Välj analysera partiklar. Ställa in parametrar enligt önskad upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll innehåller 6 stora steg efter dissektion av äggstockarna, som beskrivs i figur 1. Figur 2 , Figur 3 , Figur 4 highlightar mest roman av detta protokoll, som omfattar optimering av vävnad clearing för äggstockar och hela vävnad äggcellen kvantifiering med FIJI-ImageJ. Figur 2A visar bilder av en obildade 5-dagars postnatal fast äggstock före (vänster) och 1 h efter (höger) lägga till clearing lösning på äggstocken. Äggstockarna börjar bli genomskinlig inom minuter att vara nedsänkt i clearing lösning. När rensat, blir små äggstockar som avbildas i figur 2A svåra att hantera utan att skada. Därför är arbetar med odlade explanterad äggstockar fördelaktigt eftersom de blivit ansluten till den porösa ytan av Infoga membranet som de är odlade. Tillbehör av ovaryen att infoga membranet gör att försöksledaren att hantera membran infoga i stället för äggstocken (figur 2B och figur 3). Även äggstockarna odlade i närheten kommer säkring och figur 2B visar anslutna smält äggstockarna före (vänster) och efter röjning (höger) på hematoxylin färgas prover.
Utför den optisk snittning av odlade äggstockarna utan clearing är möjligt; dock celler djupt i vävnaden har en signal som är svår att skilja från bakgrunden och denna brist på tydlig signal hindrar korrekt äggcellen kvantifiering (figur 3A). I motsats till figur 3Aär figur 3B en representativ bild av en rensas prov där äggcellen kvantifiering i hela hela orgeln är möjligt. Figur 3B visar att hela orgel avbildning av rensas odlade äggstockarna kan föras utan betydande förlust av signal djup inom vävnad och bilder som den som visas (figur 3B) lätt kan kvantifieras. En metod för att kvantifiera oocyter i prover som dessa är av omvandla Z-stack serien av optiska sektioner till en maximal intensitet projektion och sedan ytterligare bearbetning av filen med ett avbildningspaket för bearbetning. Figur 4 och kompletterande Figur1 Markera stegen används för att kvantifiera antalet oocyter i figur 3B med FIJI-ImageJ. Kompletterande Tabell1 inkluderar FIJI-Imagejs partikel (äggcell) kvantifiering. Kvantifiering av partiklar med den här metoden också tillåter för analys av olika folliklar baserat på äggcellen storlek, eftersom information om både antalet partiklar och motsvarande område av varje partikel beräknas av programvara och tillhandahålls till den användaren.
Figur 1: Schematisk bild av hela protokollet. Visuell Sammanfattning av protokollet början med dissektion i äggstockarna (1), följt av äggstocken kultur (2), vävnad fixering med 4% PFA (3), immunfärgning med specifika antikroppar (4), rensa vävnad för deep imaging (5), att erhålla den optiska avsnitt med en Confocal Mikroskop (6) och slutar med äggcellen kvantifiering (7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: skillnaden i vävnad opacitet mellan un-rensade och rensade äggstockarna. (A) äggstocken från en postnatal dag fem pup utan clearing (vänster) och efter mild clearing av ca 1 h (höger). (B) flera äggstockarna odlade i nära närhet till varandra i sju dagar. Två olika förstoringar av varje prov visas. Längst till vänster bilder är utan clearing och längst till höger bilder är med röjningen. Äggstockarna kommer att fästa vid membranet i kultur skäret och kan hanteras bättre om de hålls kopplade i hela protokollet. För att förbättra kontrasten av vävnad för bildåtergivning med vitt ljus, var äggstockarna nersänkt i hematoxylin för 5 min efter fixering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunofluorescens avbildning av un-rensade och rensade äggstockarna. Äggstockarna från postnatal dag 5 valpar var odlade i 7 dagar och färgas enligt den hela mount immunofluorescens färgning protokollet beskrivs. Visas i rött är celler märkta med musen vasa homolog (MVH) att identifiera könsceller och i grönt är celler märkta med den nukleära äggcell-specifik markören, p63. DAPI, användes i blått, till att märka alla cellkärnor. (A) immunofluorescens bild av äggstockarna utan clearing. (B) immunofluorescens bild av äggstockarna med röjningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Visual arbetsflöde att kvantifiera oocyter med FIJI-ImageJ programvara. För att underlätta analys av data, kan bilder som härrör från de confocal plan reduceras till en maximal intensitet projektion i stället för en 3D-bild. Med maximal intensitet projektionen, kan användaren definiera bild tröskelparametrar på ett sådant sätt att målet partiklarna blivit uppenbart. När den förenkla bilden framställs, används programvaran att räkna oocyterna. Att kritiskt granska bilder samtidigt fastställa parametrar är avgörande. Denna figur visar ett exempel på hur tröskelvärdet partikel/äggcell kan ställas in. Texten ovanför varje bild belyser den parameter som används för att få bilden i FIJI-ImageJ. Programvaran genererar en tabell med området mätning av partiklar (se kompletterande Tabell1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: Visual arbetsflöde att kvantifiera oocyter med FIJI-ImageJ programvara (lägre förstoring). Denna figur visar äggcellen kvantifiering för två äggstockarna i närheten. Stegen utförs är samma som i figur 4. 2 436 partiklar/folliklar räknades av programvaran. Rapporteringsgräns uppgifter som erhållits från programvaran kan hittas i kompletterande Tabell1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell1: follikeln kvantifiering beräknas av FIJI-ImageJ. Den här tabellen innehåller listan över räknade folliklar och motsvarande område genereras från bilden i kompletterande Figur1. Partikelstorlek används för kvantifiering sattes från 10 µm2-infinity. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien av däggdjur reproduktion kräver hjälp och kvantifiera specialiserade celler som inte rutinmässigt mottagliga för cellodling. Men är ex vivo kultur system effektiva på att upprätthålla äggstock och follikeln livskraft1,15. Under äggstock kultur kräver vävnaden en större yta för utbyte av näringsämnen genom diffusion. Därför 5 - dag-gammal mus äggstockarna är perfekta i storlek och form för orgelkultur. Detta protokoll var optimerad för äggstockarna kvar i sju dagar med kultur, men äggstock kultur längd kan justeras enligt den vetenskapliga fråga1,4. Jämförbara resultat har uppnåtts i äggstockarna odlade för så lite som tre dagar och så länge som tio dagar (inga data anges), men äggstockar från djur äldre än tio dagar är stora och kulturen kan inte vara lika effektivt, därmed belysa en begränsning av protokollet.
Om ex vivo odling av ovaryen inte behövs, går det att fixa och fläckar äldre äggstockarna med protokollet beskrivs, även om ändringar kan behöva anpassa sig till de största vävnad storlek9,16. Färgning protokollet beskrivs beror på passiv diffusion av antikroppar i organet, vilket indikerar att det kan vara möjligt att färga större äggstockar med antingen längre antikropp inkubationsstegen eller genom partitionering vävnaden till några mindre bitar som kan rekonstrueras efter imaging. Användning av urea och sorbitol i den ScaleS(0) clearing agent som visat sig effektiva för neonatal odlade äggstockarna eftersom det krävs en kortare inkubationstid än de rapporterade för clearing agenter med urea och glycerol (ScaleA2)8,10 . Dessutom användningen av en låg koncentration av natriumborhydrid (NaBH4) i vilket lösningen minskat bakgrundsljud och, tillsammans med längre inkubationer av proverna med primära och sekundära antikroppar, underlättas färgning djupt in i vävnaden. Dessutom förhindrar användningen av PVA i permeabiliseringen och tvättning lösningar falska partiklar fastnar till vävnad17,18.
I detta protokoll fäster odlade friska äggstockar vid infoga membranet, medan ohälsosamma äggstockarna kan lossna från det vid upptagning och hantering. Hantering lös vävnad med tången kommer skada äggstockar och sannolikt kompromiss imaging. Alternativt, lös vävnad kan vara inbäddad i 5% agaros pluggar eller hanteras med överföring pipetter så länge spetsen öppning är tillräckligt bred för att inte skada den. När det gäller immunfärgning, primära antikroppar än de som används i detta protokoll kan utföra annorlunda och kan kräva optimering i permeabilisering och inkubation steg.
Slutligen, protokollet beskriver ett alternativt tillvägagångssätt mot kvantifiera folliklar från unga äggstockarna jämfört med traditionella paraffin inbäddade seriell sektioner eller andra tidigare beskrivits volymetriska kvantifiering av folliklar från hela mount bilder 5 , 9 , 16. beroende på forskarens krav, förfarandet för äggcell kvantifiering beskrivs i protokollet kan också vara används karakterisera olika stadier av follikulär utveckling19. Området partikel som genereras av programvaran kan användas för att bestämma cell diameter och därmed härleda follikulära scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Rebecca Williams och Johanna Dela Cruz från den Cornell BRC Imaging och Andrew Recknagel för användbara förslag och tekniskt bistånd. Detta arbete fick stöd till National Institutes of Health grant S10-OD018516 (till Cornells Imaging anläggning), T32HD057854 till J.C.B. och R01-GM45415 till J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
