Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد حجم المسام في المبيضين مثقف للفئران الصغار دون تقطيع المسلسل. استخدام الجهاز كاملة الفلورة والأنسجة المقاصة، تمزيقها المادية يتم استبداله بتقطيع الضوئية. هذا الأسلوب من إعداد العينة والتصور يحافظ على سلامة الجهاز ويسهل الآلي التقدير الكمي للخلايا المحددة.
Abstract
البحوث في مجال البيولوجيا الإنجابية الثدييات غالباً ما ينطوي على تقييم الصحة العامة المبايض والخصيتين. على وجه التحديد، في الإناث، وغالباً ما يتم تقييم اللياقة البدنية المبيض بتصور والتحديد الكمي للمسام وبويضات. نظراً لأن المبيض أنسجة ثلاثية الأبعاد معتمة، النهج التقليدية تتطلب مشقة تشريح الأنسجة إلى مقاطع المسلسل العديد من أجل تصور خلايا في جميع أنحاء الجهاز كامل. وعلاوة على ذلك، لأنه عادة ما يستتبع القياس الكمي بهذا الأسلوب سجل مجموعة فرعية فقط من أقسام مفصولة بقطر تقريبي البويضات، عرضه لعدم دقتها. هنا، هو وصف بروتوكول يستخدم بدلاً من ذلك إزالة الأنسجة الجهاز كله وتلطيخ الفلورة من المبايض الماوس وضع تصور للمسام وبويضات. ومقارنة بالأساليب التقليدية، هذا البروتوكول مفيد لتصور خلايا داخل المبيض لأسباب عديدة: 1) المبيض لا تزال سليمة في جميع أنحاء عينة التحضير والتجهيز؛ 2) يمكن فحص المبايض صغيرة، وصعبة للقسم، بسهولة؛ 3) يتحقق القياس الكمي الخلوية أكثر سهولة ودقة؛ و 4) الجهاز كله تصويرها.
Introduction
من أجل دراسة تكوين الخلوية والسمات المورفولوجية المبايض الثدييات، العلماء غالباً ما تعتمد على التجارب في فيفو متبوعاً بتلوين إيمونوهيستولوجيكال المبايض البارافين المضمنة. أكثر مؤخرا رغم ذلك، ثقافة الجهاز المبيض كله قد ثبت أن بديل فعال لدراسة وظيفة المبيض1،2،،من34 لأن هذه التقنية يمكن أن يقترن بالتصور أفضل و أدوات القياس الكمي. تقليديا، تحليلاً مورفولوجيا المبيض يعتمد على إعادة بناء هيكل المبيض ثلاثي الأبعاد من مقاطع المسلسل البارافين مضمن، ولكن، بالإضافة إلى كونها شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، متسلسل تقطيع الأنسجة البارافين مضمن لا ضمان إعادة البناء السليم للجهاز، وكثيراً ما فقدت أقسام أو أمر بسوء في العملية.
بالإضافة إلى التحديات التقنية المرتبطة بتقطيع المسلسل، وهناك أيضا اختلافات في الأساليب المستخدمة بشكل روتيني لتقدير أرقام جريب كل المبيض5،6. تباين المنهجية المستخدمة حاليا ويضعف التحليل التلوي لاحتياطي المبيض عبر الدراسات5،7. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف أرقام جريب من المقالات والبحوث المختلفة بالوقت أو أكثر بين الإعمار إنمائية مماثلة ضمن سلالة معينة6. هذه الاختلافات الكبيرة في التحديد الكمي جريب المبلغ عنها يمكن أن يؤدي إلى الارتباك وعرقلت إجراء مقارنات عبر الدراسة. تجريبيا، يؤديها النهج التقليدية لتحديد مقدار جريب من مقاطع المسلسل العد المسام عدد محدد سلفا من المقاطع (مثلاً كل الخامسة، العاشرة، أو قسم آخر). ينشأ تقلب في تهم المسام باستخدام هذا النهج ليس فقط من التواتر في المقاطع التي يتم عدها، بل أيضا من الاختلافات في سمك الفرع، والخبرة التقنية في توليد مقاطع المسلسل5،6. بالإضافة إلى قابليته، عيب آخر لتقطيع الأنسجة التقليدية أن تقطيع المبايض صغيرة من صغار الحيوانات تنطوي على تحديات خاصة وتعتمد اعتماداً كبيرا على اتجاه الأنسجة8.
البروتوكول أدناه يصف أسلوب1 ثقافة مبيض تستخدم بشكل روتيني ولكن يحسن إلى حد كبير على التقدير الكمي جريب التقليدية عن طريق استبدال تمزيقها المادية مع أنسجة تطهير وتمزيقها الضوئية باستخدام مجهر [كنفوكل]8 ،9. مسح استخدام الغمر الأنسجة (بدون الحاجة لنضح transcranial أو التفريد) في اليوريا والسوربيتول-يستند إلى نظام الحل (مثلاً، ScaleS(0)10) ثبت متوافق مع إيمونوستينينج ويسمح للحد من مسح وقت دون المساس بعمق للتصوير. أساليب أخرى تم الإبلاغ عنها (مثلاً، ScaleA2،من810، سيدب11، كليارت12و ClearT212) أما أكثر تستغرق وقتاً طويلاً أو عدم السماح بالدقة البصرية متعمقة للعينة. تقطيع الضوئية مفيد لأنه أقل كثيفة العمالة ويحتفظ الجهاز هيكل ثلاثي الأبعاد7،8. فائدة أخرى من هذا النهج هو أن إعداد العينات التي لا تتطلب الكواشف باهظة التكلفة لإزالة الأنسجة، ويمكن أن تجري بسهولة نسبية.
على وجه التحديد، البروتوكول وصف قد الأمثل المبايض الماوس المستزرعة في يوم الولادة خمسة لكن أجريت على المبايض بدءاً من يوم الولادة 0-10. الأسلوب يجعل استخدام نظام الثقافة المبيض الذي تولي الأنسجة بالطبع للغشاء الذي كان هو مثقف، تسهيل التعامل مع الجهاز والتلاعب. يمكن استخدام نظام الثقافة ووصف للحفاظ على اكسبلانتيد المبايض لمدة تصل إلى 10 أيام وتقييم ظروف تجريبية مختلفة كيف قد تتداخل مع بقاء البويضات13. تتم باستخدام الصورة غير التجارية تجهيز الحزمة فيجي-إيماجيج14 إجراء التقدير الكمي ووصف ويمكن أن تجري في معظم أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة على ذلك، الصور المستخدمة للقياس الكمي يمكن أن يتاح على نطاق واسع للمجتمع العلمي، مما يسمح للتحليل التلوي مستقبلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جامعة كورنيل "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) وافق جميع الأساليب الموصوفة هنا، تحت بروتوكول عام 2004-0038 لهيئة الأركان المشتركة.
1-إعداد الصكوك وثقافة وسائل الإعلام
- مسح منطقة عمل نظيفة مع التبييض 10% والسماح التبييض تبقى على سطح منطقة العمل لمدة 5 دقائق على الأقل. بعد 5 دقائق، قم بإزالة المبيض الزائد مع مناشف ورقية نظيفة و 70% إيثانول (EtOH). تنظيف مجهر تشريح دقيق مع 70% EtOH.
ملاحظة: من المهم أن تكون مساحة العمل على الأقل شبه معقم لتفادي تلوث ثقافات الجهاز. - التفاف الملقط نظيفة ومقص مع منشفة ورقية مبللة ب 70% EtOH حتى وقت الاستخدام.
ملاحظة: قد تختلف أدوات تشريح مثالية وفقا للعمر/حجم المبيض. يتم الحصول على أفضل النتائج من استخدام واحد حاد الصغرى تشريح مقص، هما خير نصيحة الملقط (أما رقم 5 أو 55) وواحدة مايكرو تشريح قزحية مقص. - في أنبوب مخروطي، جعل 50 مل من وسائط الثقافة المبيض والدافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- لجعل المبيض الثقافة المتوسطة4، الملحق 1 × وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى (MEM) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 25 مم (حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 4 (حبيس)، 100 وحدة/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين B (مثلاً 45 مل MEM، 5 مل حرارة إبطال FBS و 1.25 مل هيبيس 0.5 مل من الأسهم x 100 البنسلين، ستربتوميسين، والامفوتريسين ب).
- إعداد لوحات وإدراج قبل ثقافة المبيض.
- في غطاء زراعة الأنسجة، إضافة 1 مل من المبيض الثقافة المتوسطة إلى طبق استنبات الأنسجة 35 ملم.
- نقع قبل إدراج غشاء مع المتوسط الثقافة. إضافة وسائط كافية، عادة حوالي 0.55 مل الواحد جيدا، إلى لوحة زراعة الأنسجة الناقل 24-جيدا، ومكان ثقافة خلية إدراج في البئر. تأكد من أن يلامس الغشاء الإدراج وسائط الإعلام.
- إعداد عدد لوحات 35 ملم والآبار مع إدراج ثقافة الخلية وفقا للعدد المتوقع من المبايض في التجربة. وضع لوحات 35 ملم يحتوي على 1 مل من وسائط الثقافة ولوحة الحامل 24-جيدا التي تحتوي على وسائط الثقافة ويدرج في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وحاضنة2 O الغلاف الجوي.
- ترتيب لوحة الساخن بجوار نطاق التشريح وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. تبقى 37 درجة مئوية، 5% CO2 وحاضنة2 O الغلاف الجوي بالقرب من الغرفة تشريح.
2-تشريح المبيض وثقافة الجهاز
ملاحظة: يمكن تشريح المبيض في درجة حرارة الغرفة طالما تعرض لدرجة حرارة غير المثالية الحد الأدنى.
- Euthanize الفئران الإناث في يوم ما بعد الولادة 5، بقطع الرأس، في وقت واحد.
ملاحظة: يجب أن تجري القتل الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC الحالي في مرفق حيث يتم إجراء البحث. - رش الحيوان مع 70% EtOH. مكان الحيوان على رأس منشفة ورقية جافة تحت مجهر التشريح. ضع طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على وسائط الثقافة المبيض قريبة من مجهر التشريح.
- بالملقط أو تشريح الجزئي قزحية مقص، جعل شق من خلال الجلد من الحيوان وفي تجويف البطن، باستخدام الحذر لا إلى خفض في الأمعاء. دفع الأمعاء خارج تجويف البطن وتحديد مكان المبايض. استخراج المبايض ووضعها في طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على وسائط الثقافة.
- مرة واحدة وقد تم تشريح المبيض من الحيوان، قم بزيادة التكبير مجهر التشريح من أجل تصور أفضل المبايض وأي أنسجة المرفقة. مع تنظيف الملقط تلميح جيد، وإزالة جميع الأنسجة غير المبيض، مثل بورصة والأنسجة الدهنية. احرص على الاحتفاظ المبايض سليمة عند إزالة الأنسجة غير المبيض المرفقة.
- متى المبايض معزولة، وضع الزوج في إدراج ثقافة الخلية قبل غارقة بليت 24-جيدا الناقل (الرجوع إلى الخطوات 1.4.2 و 1.4.3) وضبط مستوى الصوت على المديين المتوسط والتأكد من أنها كافية لإبقاء الجهاز رطبة (دون تماما غمر عليه).
تنبيه: كن حذراً لا لكزه ثقب في الغشاء لإدراج ثقافة الخلية عند نقل المبيض. - مكان اكسبلانتيد الأجهزة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وحاضنة2 O الغلاف الجوي.
- كرر الخطوات من 2.1-2.6 حتى يتم تشريح المبايض كل حيوان ووضعها في خلية ثقافة إدراج لوحة 24-البئر الذي يحتوي على مستنبت المبيض.
- تغير المتوسط الثقافة المبيض كل يومين، استخدام استعد مختبرين وسائط المبيض من حمام مائي 37 درجة مئوية والشروع في الجزء 3 من البروتوكول في الوقت المطلوب التجريبية النقطة.
3-الأنسجة التثبيت
- في أنبوب مخروطي 15 مل، إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (مثلاً، إضافة 2 مل 16% PFA الميكروسكوب الإلكتروني الصف إلى 6 مل من برنامج تلفزيوني س 1).
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو مادة خطرة وينبغي التعامل معها تحت غطاء كيميائية. - إصلاح المبايض مثقف، دون إزالة الأنسجة من إدراج الثقافة، التي تغطي النسيج مع الحل منهاج العمل 4% الطازجة. ختم حواف اللوحة بمادة لاصقة بلاستيكية (لتجنب التبخر) ووضع العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تجنب بغية تسهيل المناولة وسلامة الأنسجة، مما أدى إلى تشريد المبايض من إدراج ثقافة الخلية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. مفيدة للتعامل مع المبايض مثقف يعلق على سطح الإدراج يتم دون إتلاف أو فقدان الجهاز. - شطف الأنسجة 3 x مع 70% EtOH وأما المضي قدما إلى الخطوة 4.1 أو مخزن في قنينات التﻷلؤ مليئة 70% EtOH في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: إذا كان استخدام أنسجة اندوجينوسلي الإعراب عن البروتينات الفلورية، وتخزين العينات مع 70% EtOH قد يقلل كثيرا من الإشارات. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تشطف الأنسجة والمخزنة في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.2% (نان3). غير أن نان3 عالية السمية ويشكل خطرا استنشاق خطيرة. جعل الحل الأسهم في غطاء الدخان والتعامل مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل قفازات معطف والنتريل مختبر.
4-كله جبل الفلورة
- ضع الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني 1 x في الرايت للحد ني ح 4 قبل الخطوة permeabilization 4.3.
- إعداد حل حظر وحل بيرميبيليزيشن.
- إعداد permeabilization الحل كما هو موضح. إلى برنامج تلفزيوني 1 x، إضافة 0.2 ٪ الكحول البولي فينيل (PVA) و 0.1% الصوديوم بورهيدريد (نأبه4) الحل (من 12 wt.% حل هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) م 14) 1.5% البولي إثيلين غليكول ثالثي-أوكتيلفينيل الاثير (المنظفات غير الأيونية الفاعل). في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 5 مل 10 × برنامج تلفزيوني، 0.1 غرام من بولي و 50 ميليلتر من نأبه4ميليلتر 750 من المنظفات غير الأيونية الفاعل، ثم أضف عالي النقاوة المياه تصل إلى 50 مل وتحرض جيدا في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح الخليط تماما في الحل.
- إعداد حل حظر كما هو موضح. لبرنامج تلفزيوني 1 x، إضافة الفاعل غير الأيونية 0.1% المنظفات، 0.15% من 2.5 م جليكاين الأس الهيدروجيني 7.4، مصل الماعز العادي 10%، 3% ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.2% نان3، 100 وحدة/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين باء إعداد حل الأسهم 2.5 جليكاين متر بتذويب ز 93.8 من جليكاين في الماء عالي النقاوة إلى حجم 500 مل نهائي (درجة الحموضة 7.4) وحل أسهم من 10% نان3 بتذويب 5 غ في 50 مل الماء عالي النقاوة؛ ثم، في أنبوب 50 مل مخروطية إعداد حل حظر بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني x 10، 50 ميليلتر من المنظفات غير الأيونية الفاعل، ميليلتر 750 حل الأسهم جليكاين، 5 مل مصل الماعز، 1.5 غرام من جيش صرب البوسنة، 1 مل من نان3 حل الأسهم ، و 0.5 مل أسهم x 100 البنسلين، ستربتوميسين، والامفوتريسين B. إضافة الماء عالي النقاوة حتى وحدة تخزين نهائي لتصفية 50 مل وحقنه بالحل النهائي.
- إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني 1 x من القنينة ثم قم بإضافة حل permeabilization كافية لتغرق المبايض تماما. ضع العينة في حل بيرميبيليزيشن على شاكر مداري (مثلاً، نوتاتور) في درجة حرارة الغرفة ح 4.
ملاحظة: قد تختلف وقت الحضانة وفقا لسمك الجهاز. - استبدال الحل بيرميبيليزيشن بما يكفي حل حظر إلى غمر تماما المبايض. ختم القنينة بمادة لاصقة بلاستيكية وتترك الأنسجة حضانة للحد أدنى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
- إعداد إضعاف جسم أساسي في عرقلة الحل وفقا لورقة البيانات الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: لاحظ أن الأجسام المضادة ليست كلها متوافقة مع وكيل التخليص. متوسط حجم كل عينة بحاجة هو ما يقرب من 750 ميليلتر.- لتقدير حجم بويضتها، استخدم TAp63 (العلامة النووي البويضيه) ومفه (العلامة هيولى الخلية الجرثومية).
ملاحظة: الأجسام المضادة التي تستخدم في الصور الفلورة الماوس المضادة-p63 وارنب المضادة-مفه). يمكن أن يكون الحل جسم الأولية المعاد 2 x أو أكثر إذا كانت مخزنة في 4 درجات مئوية بين تلطيخ البروتوكولات والتعامل معها بشكل صحيح لتجنب النمو الجرثومي.
- لتقدير حجم بويضتها، استخدم TAp63 (العلامة النووي البويضيه) ومفه (العلامة هيولى الخلية الجرثومية).
- وضع الإدراج التي تحتوي على الأنسجة في صفيحة 24-جيدا وإضافة ميليلتر حوالي 750 من حل جسم الأولية. التأكد من أن المبايض مغمورة تماما. ختم اللوحة بمادة لاصقة بلاستيكية للتقليل من التبخر وترك الأنسجة حضانة لمدة 4 أيام في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
- إعداد الحل الغسيل.
- إعداد الحل الغسيل كما هو موضح. جعل 1 x PBS، إضافة المنظفات غير الأيونية الفاعل بولي و 0.15 في المائة 0.2%. في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 5 مل 10 × برنامج تلفزيوني، 0.1 غرام بولي، ميليلتر 75 من المنظفات غير الأيونية الفاعل والماء عالي النقاوة حتى وحدة تخزين نهائي من 50 مل.
- إزالة تمييع جسم الابتدائي وإضافة كمية سخية من الحل الغسيل. تأكد دائماً تغرق في المبيضين. السماح المبايض نقع في الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري.
- استبدال الحل الغسيل واحتضان على شاكر المداري ح 2 أو أكثر.
- كرر الخطوة 4.9 مرة أخرى.
- إعداد إضعاف جسم الثانوية في عرقلة الحل.
ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم صبغة الفلورسنت 488 الماوس المضادة المثارة في الماعز وصبغة الفلورسنت 594 أرنب المضادة المثارة في الماعز. راجع الخطوة رقم 4، 5. بحاجة لمتوسط حجم كل عينة. - إزالة الحل الغسيل من المبايض وإضافة حل جسم الثانوية. حماية العينات من الضوء (لوحة التفاف مع رقائق الألومنيوم) وختم اللوحة بمادة لاصقة البلاستيكية لتقليل التبخر. احتضان العينات في شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
ملاحظة: مواصلة حماية العينات من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم خلال جميع الخطوات اللاحقة الحضانة. - إزالة الحل جسم الثانوية من العينات وإضافة الحل الغسيل. تبني على شاكر مداري ح 8.
ملاحظة: إذا كان المطلوب هو تلطيخ 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، إضافة 50 نانوغرام/مل من DAPI للخطوة الأولى من المياه والصرف الصحي (~ 8 ح الحاضنات). - استبدال غسالة الحل بالنسبة المياه والصرف الصحي بين عشية وضحاها.
- أثناء إعداد الحل المقاصة (انظر القسم 5)، تحل محل بين عشية وضحاها الغسيل الحل مع حل جديد وتبقى العينات على شاكر المداري عند درجة حرارة الغرفة.
5-المبيض المقاصة والتصوير
- إعداد ScaleS(0) مسح الحل.
- إعداد ScaleS(0) مسح الحل10 عن طريق إضافة الكواشف في نسبة معينة: 40% D-(-) السوربيتول (w/v)، 10% والغليسيرول واليوريا 4.3 م 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، الرقم الهيدروجيني 8.1 (مثلاً في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 2.5 مل الجلسرين، 10 غم السوربيتول ، 5 مل من [دمس]، و 12 مل من اليوريا م 9 لإجمالي حجم 25 مل. مزيج الحل بعكس عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وديغا قبل الاستخدام).
- إزالة الحل الغسيل وغمر العينات في مسح الحل. للحصول على أفضل النتائج المحافظة على العينات على شاكر المداري.
- استبدال الحل المقاصة 2 × يوميا حتى يصبح شفاف (حوالي 2 أيام) من الأنسجة.
- مرة واحدة يتم مسح الأنسجة، إعداد العينة للتصوير بعناية إزالة الغشاء إدراج تحتوي على المبايض مثقف مع غرامة تلميح مشرط ووضع العينة على شريحة زجاجية.
- الشروع في تصوير العينات في مجهر قادرة على تقطيع الضوئية.
6-البويضيه الكمي
ملاحظة: هناك العديد من برامج الكمبيوتر المختلفة التي تكون قادرة على تحديد الخلايا. المبين أدناه بروتوكول البويضيه التقدير الكمي باستخدام حزمة تجهيز الصورة غير تجارية، فيجي-إيماجيج14.
- استخدام إسقاط مسطح أقصى شدتها من سلسلة الصورة Zالمكدس لعلامات محددة الخلوية للفائدة (بدون قناة DAPI)، تحويل الصورة إلى صورة 8 بت أبيض وأسود ضمن نوع في الصورة القائمة المنسدلة القائمة.
- ضمن القائمة المنسدلة صورة ، تسليط الضوء على علامة التبويب ضبط ثم ثم حدد عتبة.
- ضبط الحد الأدنى إلى مستوى أفضل ويحدد كل البويضيه الفردية يدوياً. حالما يتم تحديد المستوى، انقر فوق تطبيق لتوليد صورة أبيض وأسود. وبمجرد الانتهاء، تحديد حجم العينة التي تحدد استخدام رمز شكل بيضوي أو حر .
ملاحظة: فيجي-إيماجيج على خيارات مختلفة لتهذيب الصورة التي سيتم استخدامها لتحديد حجم الجسيمات. على سبيل المثال، في عملية | ثنائي علامة التبويب، وهناك الخيارات المختلفة التي يمكن استخدامها لتحسين الكشف عن ما سيتم حسابها. في الشكل 4، كانت الخيارات المستخدمة تفريد المسام أفضل أرد، متبوعاً سد الثغرات، وأخيراً لمستجمعات المياه. - إطار تحليل القائمة المنسدلة، حدد تحليل الجزيئات. تعيين المعلمات وفقا للدقة المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتضمن هذا البروتوكول 6 خطوات رئيسية بعد تشريح المبيض، كما هو مبين في الشكل 1. الشكل 2 , الشكل 3 , الشكل 4 إبراز السمات الأكثر رواية لهذا البروتوكول، التي تشمل الاستفادة المثلى أنسجة إزالة المبيضين والأنسجة كله البويضيه الكمي استخدام فيجي-إيماجيج. ويبين الشكل 2A الصور جاهل 5 أيام بعد الولادة المبيض الثابتة قبل (يسار) وح 1 بعد (يمين) إضافة إلى حل المقاصة المبيض. سوف يبدأ المبيض لتصبح شفافة في غضون دقائق من يجري المغمورة في مسح الحل. بمجرد مسح، يصبح من الصعب على التعامل معها دون الأضرار المبايض صغيرة مثل واحد تصويرها في الشكل 2 ألف . ولذلك، العمل مع المبايض اكسبلانتيد مثقف مفيد نظراً لأنها أصبحت تعلق على سطح مسامية الغشاء إدراج الذي هم مثقف. مرفق المبيض إلى إدراج الغشاء يسمح المجرب للتعامل مع إدراج غشاء بدلاً من المبيض نفسه (الشكل 2B و الشكل 3). أيضا، سوف الصمامات المبيض المزروع بالقرب ويظهر الشكل 2B تعلق المبايض تنصهر قبل (يسار) وبعد مسح (يمين) في الهيماتوكسيلين الملون عينات.
أداء تمزيقها الضوئية لاستزراع المبيض دون تطهير ممكن؛ ومع ذلك، الخلايا العميقة داخل الأنسجة لها إشارة مفادها أن من الصعب التفريق بين من الخلفية وهذا النقص في إشارة واضحة يعوق الكمي البويضيه السليم (الشكل 3A). وعلى النقيض من الشكل 3 ألف، هو الشكل 3B صورة تمثيلية من عينة المسح الذي الكمي البويضيه طوال كامل الجهاز من الممكن. يوضح الشكل 3 أن تصوير الجهاز كله من المبايض مثقف المطهرة يمكن أن يجري دون خسائر كبيرة في إشارة عميقة داخل الأنسجة والصور مثل واحد يظهر (الشكل 3B) يمكن قياسها كمياً سهولة. نهج واحد للتحديد الكمي لبويضات في عينات كهذه تحويل سلسلة Z-كومة من المقاطع البصرية إلى "أقصى كثافة الإسقاط" وثم مواصلة معالجة الملف مع حزمة معالجة صورة. الرقم 4 و تكميلية الشكل 1 إبراز الخطوات المستخدمة لقياس عدد بويضات في الشكل 3B استخدام فيجي-إيماجيج. ويشمل تكميلية الجدول 1 الجسيمات (البويضيه) القياس الكمي فيجي-ImageJ. التحديد الكمي للجسيمات باستخدام هذا الأسلوب أيضا يسمح لتحليل المسام مختلفة استناداً إلى حجم بويضتها، نظراً لأن المعلومات المتعلقة بكل من عدد الجسيمات والمنطقة المقابلة لكل الجسيمات يحسب بالبرنامج والمقدمة إلى المستخدم.
رقم 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول بأكملها. ملخص البصرية من بداية البروتوكول مع تشريح المبيض (1)، تليها الثقافة المبيض (2)، تثبيت الأنسجة مع 4% منهاج عمل بيجين (3)، إيمونوستينينج باستخدام أجسام مضادة محددة (4)، إزالة الأنسجة لأعماق التصوير (5)، والحصول على استخدام المقطع الضوئية مجهر [كنفوكل] (6) وتنتهي مع بويضتها الكمي (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الفرق بين المبيضين الأمم المتحدة تم مسحها وتطهيرها في عتامة الأنسجة. (أ) المبيض من يوم الولادة خمسة ألجرو دون مسح (يسار) وبعد إزالة خفيفة لحوالي 1 ح (يمين). (ب) المبايض متعددة مثقف على مقربة من بعضها البعض لمدة سبعة أيام. وترد اثنين تكبير مختلفة لكل عينة. الصور الموجودة في أقصى اليسار دون الصور المقاصة وأقصى اليمين مع المقاصة. سوف نعلق على الغشاء لإدراج ثقافة المبايض ويمكن التعامل معها بشكل أفضل إذا أبقى المرفقة في جميع أنحاء البروتوكول. من أجل تحسين على النقيض الأنسجة للتصوير باستخدام الضوء الأبيض، المبايض كانت غارقة في توضع لمدة 5 دقائق بعد التثبيت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الفلورة تصوير المبايض غير المطهرة والمطهرة. المبايض من يوم الولادة 5 الجراء مثقف لمدة 7 أيام والملون وفقا الفلورة جبل كله تلطيخ البروتوكول المذكورة. يظهر باللون الأحمر الخلايا المسماة بالماوس فاسا هومولوج (مفه) لتحديد الخلايا الجرثومية والأخضر في الخلايا المسماة بالعلامة الخاصة بالبويضات النووية، p63. DAPI، في الزرقاء، استخدمت لتسمية كل خلية نواة. (أ) صورة الفلورة المبايض دون تطهير. (ب) صورة الفلورة المبايض مع المقاصة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: سير العمل مرئية لكيفية تحديد حجم بويضات استخدام البرمجيات فيجي-إيماجيج- من أجل تسهيل تحليل البيانات، يمكن تقليل الصور المستمدة من هذه الطائرات [كنفوكل] إلى إسقاط أقصى شدتها بدلاً من صورة ثلاثية الأبعاد. مع الإسقاط أقصى شدتها، تعريف المستخدم صورة العتبة المعلمات في مثل هذه طريقة أن الجزيئات المستهدفة أصبح واضحا. حالما يتم الحصول على صورة مبسطة، يستخدم البرنامج الاعتماد بويضات. فحص الصور خطيرة أثناء إعداد المعلمات أمر بالغ الأهمية. يظهر هذا الشكل مثال على كيف يمكن تعيين عتبة الجسيمات/البويضات. ويبرز النص أعلاه كل صورة المعلمة المستخدمة للحصول على تلك الصورة في فيجي-إيماجيج. البرنامج ينشئ جدولاً بقياس المساحة للجسيمات (انظر تكميلية الجدول 1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: سير العمل مرئية لكيفية تحديد حجم بويضات استخدام البرمجيات فيجي-إيماجيج (أقل التكبير)- يعرض هذا الشكل البويضيه التحديد الكمي المبايض اثنين على مقربة. الخطوات التي يؤديها هي نفسها كما في الشكل 4. أحصى جسيمات 2,436/المسام بالبرنامج. يمكن الاطلاع على بيانات القياس الكمي التي تم الحصول عليها من البرنامج التكميلي الجدول1. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الجدول 1: القياس الكمي جريب المحسوبة بفيجي-إيماجيج- يحتوي هذا الجدول على قائمة الأصوات التي تم فرزها المسام والمنطقة المقابلة التي تم إنشاؤها من الصورة في تكميلية الشكل 1. تم تعيين حجم الجسيمات المستخدمة للقياس الكمي من 10 ميكرون2-اللانهاية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتطلب دراسة استنساخ الثدييات استخدام والتحديد الكمي للخلايا المتخصصة غير قابلة بشكل روتيني لزراعة الخلايا. السابقين فيفو ثقافة أنظمة غير فعالة في الحفاظ على المبيض والمسام صلاحية1،15. خلال الثقافة المبيض، الأنسجة يتطلب مساحة أكبر لتبادل المواد الغذائية عن طريق نشر. ولذلك، الماوس 5-القديمة يوم المبايض مثالية في الحجم والشكل لثقافة الجهاز. هذا البروتوكول هو الأمثل المبايض الاحتفاظ لمدة سبعة أيام في الثقافة، ولكن يمكن تعديل طول المبيض الثقافة وفقا لمسألة علمية محددة1،4. تحققت نتائج مماثلة في المبيضين مثقف لقدر ضئيل من ثلاثة أيام، وما دامت عشرة أيام (البيانات لا تظهر)، ولكن المبيض من الحيوانات التي مضى عليها أكثر من عشرة أيام كبيرة والثقافة قد لا تكون فعالة، ومن ثم تسليط الضوء على وجود قيود على البروتوكول.
إذا السابقين فيفو استزراع المبيض ليست هناك حاجة، فمن الممكن إصلاح ووصمة عار المبايض كبار السن مع بروتوكول وصف، على الرغم من أن التعديلات قد يكون مطلوباً لضبط حجم الأنسجة أكبر9،16. البروتوكول المصبوغة ووصف يعتمد على نشر السلبي من الأجسام المضادة في الجهاز، مما يشير إلى أنه قد يكون من الممكن وصمة عار المبايض أكبر مع أما الخطوات حضانة جسم أطول أو عن طريق تقسيم الأنسجة إلى أجزاء أصغر القليلة التي يمكن يمكن إعادة بنائها بعد التصوير. استخدام اليوريا والسوربيتول في ScaleS(0) مسح عامل أثبتت فعاليتها الولدان المبايض مثقف لأنه يتطلب فترة حضانة أقصر من تلك التي ذكرت لوكلاء التخليص مع اليوريا والجلسرين (ScaleA2)،من810 . وعلاوة على ذلك، استعمال تركيز منخفض من بورهيدريد الصوديوم (نأبه4) في حل بيرميبيليزيشن انخفض الضوضاء الخلفية، وجنبا إلى جنب مع إينكوبيشنز أطول من العينات مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي، ويسرت تلوين عميقة داخل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، يمنع استخدام بولي في بيرميبيليزيشن والغسيل حلول جزيئات زائفة من التمسك بالانسجة17،18.
في هذا البروتوكول، سوف نعلق المبايض مثقف صحي للغشاء إدراج، بينما المبايض غير صحية قد فصل من أنه عند التثبيت والمناولة. معالجة الأنسجة فضفاض مع الملقط سيضر بالمبيض وتصوير الحل الوسط المرجح. وبدلاً من ذلك، يمكن جزءا لا يتجزأ من 5% [اغروس] المقابس الأنسجة فضفاض أو التعامل مع نقل الماصات طالما تلميح فتح واسعة بما يكفي لا الضرر الذي. فيما يتعلق إيمونوستينينج، قد يختلف أداء الأجسام الأولية عدا تلك التي استخدمت في هذا البروتوكول وقد تتطلب التحسين في الخطوات بيرميبيليزيشن والحضانة.
وأخيراً، البروتوكول يصف نهج بديل نحو التحديد الكمي للمسام من المبايض الشباب بالمقارنة مع أقسام التسلسلية التقليدية البارافين مضمن أو الأخرى الموصوفة سابقا الكمي الحجمي للمسام من صور جبل كله 5 , 9 , 16-اعتماداً على متطلبات للباحث، الإجراء للقياس الكمي البويضيه الموصوفة في البروتوكول يمكن أيضا استخدام تميز مختلف مراحل التنمية جرابي19. يمكن استخدام منطقة الجسيمات التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج لتحديد قطر الخلية وهكذا الاستدلال المرحلة الجرابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر ريبيكا وليامز وجوانا ديلا كروز من "تصوير BRC كورنيل" وأندرو ريكناجيل للاقتراحات المفيدة والمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل إلى المعاهد الوطنية للصحة منحة S10-OD018516 ("مرفق" كورنيل للتصوير)، و T32HD057854 إلى J.C.B. و R01-GM45415 إلى J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
