Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere follikler i kulturperler eggstokkene unge mus uten føljetong snitting. Bruke hele organ immunofluorescence og vev clearing, erstattes fysisk snitting med optisk snitting. Denne metoden for eksempel Creation og visualisering opprettholder orgel integritet og muliggjør automatisert kvantifisering av bestemte celler.
Abstract
Forskning innen pattedyr reproduktive biologi innebærer ofte evaluere den globale tilstanden eggstokker og testikler. Spesielt i kvinner, er ovarian fitness ofte vurdert av visualisere og kvantifisere follicles og oocytes. Eggstokken er en ugjennomsiktig tredimensjonale vev, krever tradisjonelle tilnærminger møysommelig kutting vevet i mange føljetong seksjoner for å visualisere celler gjennom hele orgel. Videre, fordi kvantifisering av denne metoden innebærer vanligvis scoring bare et delsett av delene med omtrentlig diameteren på en oocyte, det er utsatt for feil. Her er en protokoll beskrevet som utnytter stedet hele organ tissue clearing og immunofluorescence flekker av musen eggstokkene å visualisere follicles og oocytes. I forhold til mer tradisjonelle tilnærminger, denne protokollen er fordelaktig for å visualisere celler i eggstokken av mange grunner: 1) eggstokken forblir intakt hele prøven forberedelse og behandling. 2) liten eggstokkene, som er vanskelig å delen, kan undersøkes med letthet; 3) mobilnettet kvantifisering er lettere og nøyaktig oppnådd; og 4) hele orgel fotografert.
Introduction
For å studere mobilnettet sammensetning og morfologiske funksjoner i pattedyr eggstokkene, avhengige forskere ofte i vivo eksperimenter etterfulgt av immunohistological farging av parafin innebygd eggstokkene. Mer nylig skjønt, hel eggstokk orgel kultur har vist seg for å være et effektivt alternativ til å studere eggstokkfunksjonen1,2,3,4 fordi teknikken kan kombineres med bedre visualisering og kvantifisering verktøy. Tradisjonelt avhenger analyse av eggstokkene morfologi gjenoppbygging tredimensjonale ovarian arkitektur fra innebygd føljetong parafinsnitt, men er arbeidskrevende og tidkrevende, serielt snitting parafin innebygd vev ikke garanti riktig gjenoppbygging av orgelet, og deler ofte blir borte eller mis bestilt i prosessen.
I tillegg de tekniske utfordringene knyttet til serielle skjæring, finnes det også variasjoner i metodene som rutinemessig brukes å kvantifisere hårsekken tall per eggstokk5,6. Metodologiske variasjon brukt svekker meta-analyse av eggstokkene reserve over studier5,7. For eksempel kan hårsekken tall fra forskjellige forskningsartikler variere fra 10 ganger eller mer alderen lignende utviklingsmessige innenfor en bestemt belastning6. Disse store forskjellene i rapporterte hårsekken kvantifisering kan føre til forvirring og har hindret kryss-studie sammenligninger. Eksperimentelt, tradisjonelle tilnærminger til hårsekken kvantifisering fra føljetong deler utføres ved å telle follicles av et forhåndsdefinert antall snitt (f.eks hver femte, tiende, eller andre delen). Variasjon i hårsekken teller bruker denne tilnærmingen oppstår ikke bare fra periodisitet i hvilke deler telles, men også fra variasjoner i snittykkelse og teknisk erfaring generere føljetong punkt5,6. I tillegg til sin variasjon er en annen ulempe av tradisjonelle vev snitting at inndeling av små eggstokkene fra ung dyrene er spesielt utfordrende og svært avhengig av vev retning8.
Protokollen nedenfor beskriver en rutinemessig brukes eggstokk kultur teknikk1 men forbedrer på tradisjonelle hårsekken kvantifisering ved å erstatte fysiske snitting med vev clearing og optisk snitting ved bruk av AC confocal mikroskopi8 ,9. Fjerne bruker vev nedsenking (uten behovet for Transkraniell perfusjon eller geleelektroforese) i en urea og sorbitol-løsning (f.eks ScaleS(0)10) vist seg kompatibel med immunostaining og tillatt for reduksjon av clearing tid uten at dybdeskarphet bildebehandling. Andre rapporterte metoder (f.eksScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12og ClearT212) er enten mer tidkrevende eller tillater ikke grundig optisk oppløsning av utvalget. Optisk snitting er en fordel fordi det er mindre arbeidsintensiv og opprettholder den organ tredimensjonale arkitektur7,8. En annen fordel med denne tilnærmingen er at forberedelse av prøvene krever ikke dyrt reagenser fjerne vevet og kan gjennomføres med relativ letthet.
Spesielt protokollen beskrevet er optimalisert for kulturperler musen eggstokkene på postnatal dag fem, men har blitt utført på eggstokkene fra postnatal dag 0 - 10. Metoden gjør bruk av en eggstokk kultur-systemet som vevet naturlig festes til membranen som er det kultivert, tilrettelegging orgel håndtering og manipulasjon. Kultur systemet beskrevet kan brukes til å vedlikeholde explanted eggstokkene opptil 10 dager og for å vurdere hvordan ulike eksperimentelle forhold kan forstyrre oocyte overlevelse13. Kvantifisering fremgangsmåten ved hjelp av ikke-kommersielle bildebehandlingen pakken FIJI-ImageJ14 og kan gjennomføres på de fleste datamaskiner. Videre kan bilder brukes for kvantifisering gjøres tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, og dermed gir for fremtidige meta-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cornell Universitys institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) har godkjent alle metodene som er beskrevet her, under 2004-0038-protokollen til JCS.
1. forberedelse av instrumenter og kultur medier
- Tørk arbeidsområdet rengjøre med 10% blekemiddel og la bleke på arbeidsflaten området i minst 5 minutter. Etter 5 min, fjerne overflødig blekemiddel med ren papirhåndklær og 70% etanol (EtOH). Rengjør dissecting mikroskopet grundig med 70% EtOH.
Merk: Det er viktig at arbeidsområdet være minst semi sterilt å unngå forurensning av orgel kulturer. - Bryte ren tang og saks med et papirhåndkle fuktet med 70% EtOH inntil bruk.
Merk: Ideelle disseksjon verktøyene kan variere alder/størrelsen av eggstokkene. Best resultat oppnås ved hjelp av en skarp mikro dissecting saks, to fin spiss tang (enten nummer 5 eller 55) og en mikro dissekere iris saks. - I en konisk tube, gjøre 50 mL av eggstokk kultur medier og varm i et 37 ° C vannbad.
- For å gjøre eggstokk kultur medium4, supplere 1 x Minimal Essential Media (MEM) med 10% fosterets Bovine Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 0,25 µg/mL Amfotericin B (f.eks 45 mL MEM, 5 mL av varme inaktivert FBS 1,25 mL HEPES og 0,5 mL 100 x lager penicillin, streptomycin og amfotericin B).
- Forberede plater og setter inn før eggstokk kulturen.
- I vev kultur hette, kan du legge til 1 mL av eggstokk kultur medium i en 35 mm vev kultur plate.
- Pre suge inn membran med kultur medium. Legge til tilstrekkelig medier, vanligvis ca 0.55 mL per Vel, 24-og bærer vev kultur plate og sted en cellekultur inn i brønnen. Kontroller at den sette membran berører media.
- Forberede 35 mm plater og brønner med celle kultur setter av forventet antall eggstokkene i eksperimentet. Plass 35 mm platene som inneholder 1 mL av kultur medier og 24-og bærer plate som inneholder kultur medier og setter inn 37 ° C, 5% CO2, og atmosfærisk O2 inkubator.
- Ordne en kokeplate ved disseksjon omfanget og sette temperaturen til 37 ° C. Holde en 37 ° C, 5% CO2 og atmosfærisk O2 inkubator nær dissekere rommet.
2. eggstokk disseksjon og orgel kultur
Merk: Eggstokkene kan være dissekert ved romtemperatur eksponering ikke-ideelle temperaturen er minimal.
- Euthanize kvinnelige musene på postnatal dag 5, ved halshogging, en om gangen.
Merk: Euthanasia må utføres i henhold til IACUC retningslinjer finnes på anlegget der forskning blir utført. - Spray dyret med 70% EtOH. Plassere dyret på tørr papirhåndkle under disseksjon mikroskop. Plass en 35 mm vev kultur parabol med eggstokk kultur medier nær disseksjon mikroskopet.
- Med tang eller en mikro disseksjon iris saks, ta et snitt gjennom huden av dyret og i bukhulen, bruker forsiktig ikke for å kutt i tarmen. Presse tarmen ut av bukhulen og Finn eggstokkene. Ekstra eggstokkene og plassere dem i 35 mm vev kultur parabol med kultur medier.
- Når eggstokkene har blitt dissekert fra dyret, øker du forstørrelsen av disseksjon mikroskopet for å bedre bilde eggstokkene og alle tilknyttede vev. Med ren fin spiss tang, fjerne alle ikke-ovarian vev, som bursa og fettvev. Pass på å holde eggstokkene intakt når du fjerner det vedlagte ikke-ovarian vev.
- Når eggstokkene er isolert, plassere paret i pre-gjennomvåt celle kultur skivene av transportøren 24-vel platen (se trinn 1.4.2 og 1.4.3) og justere volumet på mediet slik at det er tilstrekkelig å holde orgelet fuktig (uten helt submerging det).
Forsiktig: Vær forsiktig med å rote et hull i membranen av celle kultur sette ved overføring av eggstokkene. - Sted explanted organer 37 ° C, 5% CO2, og atmosfærisk O2 inkubator.
- Gjenta 2.1-2.6 til eggstokkene av hvert dyr er dissekert og plassert på cellekultur sett av 24-vel plate som inneholder eggstokk kultur medium.
- Endre eggstokk kultur mediet hver 2 dager, bruker varmet eggstokk medier dele fra en 37 ° C vannbad og videre til del 3 av protokollen på ønsket eksperimentelle tidspunktet.
3. vev fiksering
- I en 15 mL konisk tube, forberede 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) (f.eks legge 2 mL av 16% PFA elektronmikroskop karakteren til 6 mL 1 x PBS).
Forsiktig: PFA er et farlig stoff og skal håndteres under kjemiske hette. - Fastsette kulturperler eggstokkene, uten å fjerne vev fra kultur-innsatsen ved å dekke vevet med nylagede 4% PFA løsning. Forsegle kantene på platen med plast lim (for å unngå fordampning) og sted prøvene på 4 ° C over natten.
Merk: For å lette håndtering og vev integritet, unngå fortrenge eggstokkene på Sett inn celle kultur gjennom hele prosedyren. Kultivert eggstokkene festet til overflaten av sette er fordelaktig for håndtering uten skade eller miste orgel. - Skyll vevet 3 x 70% EtOH og enten fortsette til trinn 4.1 eller lagre det i scintillation ampuller fylt med 70% EtOH på 4 ° C før videre behandling.
Merk: Hvis bruker vev endogenously uttrykke fluorescerende proteiner, lagring prøvene med 70% EtOH kan sterkt forringe signalet. Vev kan eventuelt skylt og lagret i PBS med 0,2% Natriumazid (NaN3). NaN3 er imidlertid svært giftig og utgjør en alvorlig innånding fare. Gjøre lager løsningen i avtrekksvifte og håndtere Bruk riktig personlig verneutstyr som en laboratoriet frakk og nitril hansker.
4. hele Mount Immunofluorescence
- Sett fast vev i 1 x PBS på RT i minst 4 timer før det permeabilization trinnet 4.3.
- Forberede permeabilization løsning og blokkerer løsning.
- Forberede permeabilization løsning som beskrevet. Legge til 0,2% polyvinylalkohol (PVA), 0,1% natrium borohydride (NaBH4) løsning (fra 12 wt.% i 14 M natriumhydroksid (NaOH) løsning) og 1,5% polyetylenglykol tert -octylphenyl Eter (ikke-ioniske surfactant vaskemiddel) 1 x PBS. I en 50 mL konisk tube, legge til 5 mL 10 x PBS, 0.1 g PVA, 50 µL NaBH4og 750 µL av ikke-ioniske surfactant vaskemiddel, og deretter legge ultrapure vann opp til 50 mL og rist godt ved romtemperatur til blandingen er helt i løsningen.
- Forberede blokkerer løsning som beskrevet. 1 x PBS, legge til 0,1% ikke-ioniske surfactant vaskemiddel, 0,15% av 2.5M glysin pH 7.4, 10% normal geit serum, 3% bovin serum albumin (BSA), 0,2% NaN3, 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL amfotericin B. forberede en lagerløsning av 2.5 M glysin ved å løse opp 93.8 g glysin i ultrapure vann til et 500 mL siste volum (pH 7.4) og en lagerløsning 10% NaN3 ved å løse opp 5 g i 50 mL ultrapure vann. deretter, i et 50 mL konisk rør forberede blokkerer løsningen ved å legge til 5 mL 10 x PBS, 50 µL av ikke-ioniske surfactant vaskemiddel, 750 µL av glysin lager løsning, 5 mL av geit serum, 1,5 g av BSA, 1 mL av NaN3 lagerløsning , og 0,5 mL 100 x lager penicillin, streptomycin og amfotericin B. Legg ultrapure vann til et endelig antall 50 mL og sprøyte den endelige løsningen.
- Fjerne og forkaste 1 x PBS fra ampullen, og deretter legger nok permeabilization løsning for å helt Senk eggstokkene. Plass prøven i permeabilization løsning på en orbital shaker (f.eks nutator) i romtemperatur 4 h.
Merk: Inkubasjonstiden varierer avhengig orgel tykkelsen. - Erstatte den permeabilization løsningen med nok blokkerer løsning å absolutt dykke eggstokkene. Forsegle ampullen med plast limet og la vevet rugende i minst 12 h ved romtemperatur på en orbital shaker.
- Forberede primære antistoff fortynning i blokkering løsning som produsentens dataark.
Merk: Legg merke til at ikke alle antistoffer er kompatible med clearing agent. Det gjennomsnittlige volumet trengs per prøve er ca 750 µL.- Oocyte kvantifisering, bruke TAp63 (kjernefysisk oocyte markør) og MVH (cytoplasmatiske bakterie celle markør).
Merk: Antistoffene brukes i immunofluorescence bilder er musen anti-p63 og kanin anti-MVH). Den primære antistoff løsningen kan bli gjenbrukt 2 x eller mer hvis lagret i 4 ° C mellom Fargeprotokoller og håndtert på riktig måte for å unngå bakterievekst.
- Oocyte kvantifisering, bruke TAp63 (kjernefysisk oocyte markør) og MVH (cytoplasmatiske bakterie celle markør).
- Plasser innsatsen som inneholder vevet i en 24-vel plate og legge til ca 750 µL av primære antistoff løsning. Kontroller at eggstokkene helt senkes. Forsegle platen med plast limet å minimere fordampning og la vevet rugende i 4 dager ved romtemperatur på en orbital shaker.
- Forberede vask løsning.
- Forberede vask løsning som beskrevet. Gjøre 1 x PBS, legge 0,2% PVA og 0,15% ikke-ioniske surfactant vaskemiddel. I en 50 mL konisk tube, legge 5 mL 10 x PBS, 0.1 g PVA, 75 µL av ikke-ioniske surfactant vaskemiddel og ultrapure vann til et endelig antall 50 mL.
- Fjern primær antistoff fortynning og legge til en generøs mengde vask løsning. Sørg alltid for å senke eggstokkene. Tillate eggstokkene å suge i løsningen over natten i romtemperatur på orbital shaker.
- Erstatt vask løsningen og ruge på orbital shaker 2 timer eller mer.
- Gjenta trinnet 4,9 en ekstra tid.
- Forberede den sekundære antistoff fortynning i blokkering løsning.
Merk: Sekundær antistoffer brukes er anti-musen 488 fluorescerende fargestoff i geit og anti-kanin 594 fluorescerende fargestoff i geit. Se trinn 4.5. for det gjennomsnittlige volumet nødvendig per prøve. - Fjerne vask løsningen fra eggstokkene og legge til sekundære antistoff løsning. Beskytte prøvene fra lys (wrap plate med aluminiumsfolie) og forsegle platen med plast limet å minimere fordampning. Inkuber prøver på en orbital shaker ved romtemperatur for 2 dager.
Merk: Fortsett beskytte prøvene fra lys med aluminiumsfolie i alle påfølgende inkubasjon trinnene. - Fjern sekundær antistoff løsning fra prøvene og legge vask løsning. Ruge på en orbital shaker 8 h.
Merk: Hvis 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) flekker er ønskelig, legge 50 ng/mL av DAPI til første vask trinn (~ 8 h inkubasjon). - Erstatte vask løsningen for en overnatting vask.
- Klargjøring av clearing løsningen (se avsnitt 5), erstatte overnatting vaske løsningen med frisk løsning og holde prøvene på orbital shaker ved romtemperatur.
5. eggstokk Clearing og Imaging
- Forberede ScaleS(0) fjerne løsningen.
- Forberede ScaleS(0) fjerne løsning10 ved å legge reagenser i gitt andelen: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glyserol, 4,3 M urea og 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) pH 8.1 (f.eks i et 50 mL konisk rør, legge 2,5 mL glyserol, 10 g sorbitol , 5 mL av DMSO og 12 mL av 9 M urea for et totalt volum på 25 mL. Bland løsning av inversjon ved 50 ° C i 30 min og degas før bruk.)
- Fjern vask løsningen og senke eksemplene i fjerne løsning. Opprettholde prøver på orbital shaker for bedre resultater.
- Erstatte clearing løsning 2 x daglig til vev blir gjennomsiktig (ca 2 dager).
- Når vev er fjernet, forberede prøven for bildebehandling ved å nøye fjerne sett inn membranen som inneholder kulturperler eggstokkene med en bot tips skalpell og plassere prøven på et glass lysbilde.
- Fortsett til bildebehandling eksemplene på et mikroskop kan optisk snitting.
6. oocyte kvantifisering
Merk: Det finnes mange forskjellige programmer som er kunne kvantifisere celler. Beskrevet nedenfor er en protokoll for oocyte kvantifisering bruker ikke-kommersielle bildet behandling pakken, FIJI-ImageJ14.
- Bruke en flat maksimale intensitet projeksjon av Z -stakken bildet serien for bestemte mobilnettet markørene av interesse (uten DAPI kanalen), konvertere bildet til et svart-hvitt 8-bits bilde under Type i rullegardinlisten bilde menyen.
- Under rullegardinmenyen bildet Merk kategorien Juster og velg terskel.
- Manuelt justere terskelen til et nivå som beste identifiserer hver individuelle oocyte. Når graden bestemmes, klikk Bruk for å generere en svart / hvitt bilde. En gang fullført, kvantifisere prøven ved å skildre bruke ikonet ovale eller Frihånd .
Merk: FIJI-ImageJ har ulike alternativer å finjustere bildet som skal brukes for partikkel kvantifisering. For eksempel i prosessen | Binære kategorien, finnes det ulike alternativer som kan brukes til å forbedre gjenkjenning av hva som skal telles. I Figur 4var alternativene som bedre individualisere follikler Eroder, etterfulgt av fylle hull, og til slutt vannskille. - Velg analyser partiklerpå rullegardinmenyen analyser . Angi parameterne i henhold til ønsket oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen inneholder 6 viktige trinn etter Disseksjon av eggstokkene, som beskrevet i figur 1. Figur 2 , Figur 3 , Figur 4 merke de mest romanen funksjonene i denne protokollen, inkluderer optimalisering av vev fjerne for eggstokkene og hele vev oocyte kvantifisering bruker FIJI-ImageJ. Figur 2A viser bilder av et uncultured 5 dagers postnatal fast eggstokk før (tilvenstre) og 1 time etter (høyre) legge clearing løsning på eggstokken. Eggstokken begynner å bli gjennomsiktig bare minutter fra å være neddykket i fjerne løsning. Når fjernet, bli liten eggstokkene som avbildet i figur 2A vanskelig å håndtere uten å skade. Derfor er arbeider med kulturperler explanted eggstokkene en fordel fordi de blir knyttet til den porøse overflaten av sett inn membranen som de er kulturperler. Vedlegg av eggstokken til sett inn membranen kan eksperimentator håndtere membran innsatsen i stedet for eggstokken selv (figur 2B og Figur 3). Også eggstokkene kultivert i nærheten vil sikring og figur 2B viser knyttet smeltet eggstokkene før (til venstre) og etter (til høyre) på hematoxylin farget prøver.
Utfører optisk inndeling av kultivert eggstokkene uten clearing er mulig; celler dypt i vevet har et signal som er vanskelig å skille fra bakgrunnen, og dette mangel på klart signal hindrer riktig oocyte kvantifisering (figur 3A). I motsetning til figur 3Aer 3B figur et representativt bilde av en ryddet prøve der oocyte kvantifisering gjennom hele orgel er mulig. Figur 3B viser at hele organ avbilding av ryddet kulturperler eggstokkene kan gjennomføres uten betydelige tap av signal dype vev og bilder som de som vises (figur 3B) kan kvantifiseres lett. En tilnærming for å kvantifisere oocytes i prøver som disse er å konvertere Z stabel serien av optisk deler til en maksimal intensitet projeksjon og deretter videre behandling filen med en bilde behandling pakke. Figur 4 og supplerende figur 1 markere trinnene å tallfeste antallet oocytes i figur 3B bruker FIJI-ImageJ. Supplerende tabell 1 inkluderer FIJI-ImageJ partikkel (oocyte) kvantifisering. Kvantifisering av partikler benytter denne metoden også tillater for analyse av ulike follikler basert på oocyte størrelse, fordi informasjon om både antall partikler og tilsvarende på hver partikkel er beregnet av programmet og gitt til den brukeren.
Figur 1: skjematisk fremstilling av hele protokollen. Visuelt sammendrag av protokollen som begynner med Disseksjon av eggstokkene (1), etterfulgt av eggstokk kultur (2), vev fiksering med 4% PFA (3), immunostaining med spesifikke antistoffer (4), fjerne vev for dype imaging (5), skaffe optisk delen ved hjelp av en AC confocal mikroskop (6) og slutter med oocyte kvantifisering (7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: forskjellen i vev tetthet un ryddet og ryddet eggstokkene. (A) eggstokk fra et postnatal dag fem pup uten å tømme (venstre) og etter milde clearing av ca 1 time (høyre). (B) flere eggstokkene kultivert i umiddelbar nærhet til hverandre i syv dager. To ulike forstørrelser av hvert utvalg vises. Venstre bilder er uten clearing og høyre bilder er med avregning. Eggstokkene vil legge til membranen av kultur sette og kan håndteres bedre hvis vedlagt i protokollen. For å forbedre kontrasten av vev bildevisning hvitt lys, ble eggstokkene neddykket i hematoxylin i 5 min etter fiksering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescence avbildning av un ryddet og ryddet eggstokkene. Eggstokkene fra postnatal dag 5 pups ble kultivert i 7 dager og farget etter hele mount immunofluorescence flekker protokoll beskrevet. Vist i rødt er celler merket med musen vasa homolog (MVH) til å identifisere bakterie celler og grønn er celler merket med den kjernefysiske oocyte-spesifikk markøren, p63. DAPI, ble i blått, brukt til å merke alle cellen kjerner. (A) Immunofluorescence bilde av eggstokkene uten clearing. (B) Immunofluorescence bilde av eggstokkene med avregning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Visual arbeidsflyt for hvordan kvantifisere oocytes FIJI-ImageJ programmvre. For å lette dataanalyse, kan bilder fra AC confocal flyene bli redusert til en maksimale intensitet projeksjon i stedet for et 3D-bilde. Den maksimale intensitet projeksjonen, kan brukeren definere bilde terskelparameterne slik at målet partikler bli tydelig. Når forenklet bildet er oppnådd, brukes programmet til å telle oocytes. Kritisk undersøke bilder under angivelse av parametrene er avgjørende. Denne illustrasjonen viser et eksempel på hvordan partikkel/oocyte terskelen kan angis. Teksten over hvert bilde høydepunkter parameteren brukes til å få bildet i FIJI-ImageJ. Programvaren genererer en tabell med områdemålenheten partikler (se supplerende tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: Visual arbeidsflyt for hvordan kvantifisere oocytes bruker FIJI-ImageJ programvare (forstørring). Denne illustrasjonen viser oocyte kvantifisering for to eggstokkene i nærheten. Trinnene utføres er det samme som i Figur 4. 2,436 partikler/follikler ble regnet av programvaren. Kvantifisering data fra programvaren finnes i supplerende tabell 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra tabell 1: hårsekken kvantifisering beregnet av FIJI-ImageJ. Denne tabellen inneholder telt follicles og tilsvarende området generert fra bildet i supplerende figur 1. Partikkelstørrelse brukes for kvantifisering ble satt fra 10 µm2-uendelig. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av pattedyr reproduksjon krever bruker og kvantifisere spesialiserte celler som ikke er rutinemessig mottakelig for cellekultur. Men er ex vivo kultur systemer effektiv på å opprettholde eggstokk og follicle levedyktighet1,15. Under eggstokk kultur krever vevet et større areal for utveksling av næringsstoffer gjennom spredning. Derfor 5 - dagers gammel mus eggstokkene er ideelle i størrelse og form for orgel kultur. Denne protokollen ble optimalisert for eggstokkene vedlikeholdes i syv dager i kultur, men eggstokk kultur lengde justeres etter den spesifikke vitenskapelige spørsmål1,4. Sammenlignbare resultater oppnådd i eggstokkene kultivert for så lite som tre dager og så lenge ti dager (data ikke vist), men eggstokkene fra dyr eldre enn ti dager er store og kultur kan ikke være så effektive, dermed fremhever en begrensning av protokollen.
Hvis ex vivo dyrking av eggstokkene ikke er nødvendig, er det mulig å fikse og flekken eldre eggstokkene med protokollen beskrevet, men endringer kan være nødvendig å justere til større vev størrelse9,16. Fargeprotokoll beskrevet er avhengig av passiv spredningen av antistoffer i organ, som betyr at det kan være mulig å flekken større eggstokkene med enten lengre antistoff inkubasjon trinn eller partisjonering vevet i noen mindre biter som kan bli rekonstruert etter bildebehandling. Bruk av urea og sorbitol i ScaleS(0) fjerne agent vist seg effektiv for neonatal kulturperler eggstokkene fordi det kreves en kortere inkubasjonstid enn rapportert for clearing agenter med urea og glyserol (ScaleA2)8,10 . Videre bruk av en lav konsentrasjon av natrium borohydride (NaBH4) i permeabilization løsningen redusert bakgrunnsstøy, og med lengre incubations av prøvene med primære og sekundære antistoffer, lettere flekker dypt i vevet. I tillegg forhindrer bruk av PVA i permeabilization og vask løsninger falske partikler stikker til vev17,18.
I denne protokollen, vil kultivert sunn eggstokkene legge til sett inn membranen, mens usunn eggstokkene løsne fra det fiksering og håndtering. Håndtering løst vev med tang vil skade eggstokken og sannsynlig kompromiss bildebehandling. Løst vev kan eventuelt innebygd i 5% agarose plugger eller behandlet med overføring Pipetter spissen åpning er bred nok ikke å skade den. Når det gjelder immunostaining, primære antistoffer enn de som brukes i denne protokollen kan utføre annerledes og kan kreve optimalisering i permeabilization og inkubasjon trinnene.
Til slutt, protokollen beskriver en alternativ tilnærming mot kvantifisere follikler fra unge eggstokkene sammenlignet med tradisjonelle innebygd føljetong parafinsnitt eller andre tidligere beskrevet volumetriske kvantifisering av hårsekkene fra hele mount bilder 5 , 9 , 16. avhengig forskerens krav, prosedyren for oocyte kvantifisering beskrevet i protokollen kan også bli brukt til karakteriserer ulike stadier av follikulær utvikling19. Partikkel området generert av programvaren kan brukes til å bestemme cellen diameter og dermed antyde follikulær fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rebecca Williams og Johanna Dela Cruz fra Cornell BRC Imaging og Andrew Recknagel for forslag og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet til National Institutes of Health grant S10-OD018516 (til Cornell Imaging anlegg), T32HD057854 til J.C.B. og R01-GM45415 til J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
