Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera insulin uttrycker 3D murina pancreatoids från friflytande e10.5 dissocierade bukspottskörteln stamfäder och den associerade mesenchyme.
Abstract
Bukspottkörteln är ett komplext organ sammansatt av många olika celltyper som samverkar för att reglera blod glukos homeostas och matsmältningen. Dessa celltyper inkluderar enzym-utsöndrar acinar celler, en arborized duktal system som ansvarar för transport av enzymer i tarmen och hormonproducerande endokrina celler.
Endokrina betacellerna är den enda Celltypen i kroppen som producerar insulin att sänka blodsockernivåerna. Diabetes, en sjukdom som kännetecknas av en förlust eller dysfunktion av beta-celler, är att nå epidemiska proportioner. Därför är det nödvändigt att upprätta protokoll för att undersöka beta-cell utveckling som kan användas vid screening för att härleda den drog- och cellbaserade therapeutics. Medan den experimentella undersökningen av mus utveckling är nödvändigt, är in-vivo studier mödosam och tidskrävande. Odlade celler ger en bekvämare plattform för screening; de är dock inte behålla den cellulära mångfald, arkitektoniska organisation och cellulära interaktioner hittade invivo. Därför är det viktigt att utveckla nya verktyg för att undersöka pankreas organogenes och fysiologi.
Bukspottskörteln epitelceller utvecklas i nära association med mesenchyme från uppkomsten av organogenes som cellerna organisera och differentieras till komplexa, fysiologiskt behöriga vuxna organ. Den pankreas mesenchyme ger viktiga signaler för endokrina utveckling, varav många inte är förstått ännu, således svårt att sammanfatta under in vitro- kulturen. Här beskriver vi ett protokoll till kultur tredimensionella, cellulär komplex musen organoids att behåller mesenchyme, kallas pancreatoids. E10.5 murina bukspottskörteln knoppen är dissekeras, separerade och odlade i en byggnadsställning-fri miljö. Dessa flytande celler montera själv med mesenchyme omsluter den framkallande pancreatoid och en robust antalet endokrina betacellerna utveckla tillsammans med den acinar och kanal celler. Detta system kan användas för att studera cell öde bestämning, strukturella organisationen och morfogenes, cell-cell interaktioner under organogenesen eller för läkemedel, liten molekyl eller genetisk screening.
Introduction
Avgränsar mekanismer normala utveckling och fysiologi är av största vikt att förstå sjukdomen etiologi och slutligen odla behandlingsmetoder. Medan odling och differentiera stamceller möjliggör snabb och hög genomströmning analys av utveckling, det begränsas av befintliga kroppen av kunskap om mekanismer som reglerar cell öde och artificiellt recapitulates utveckling i en relativt homogen, tvådimensionell stat1,2. Inte bara i vivo utveckling påverkas av yttre påverkan, med olika celltyper i nisch och miljö tillhandahåller parakrin signaler och organisatoriskt stöd för att vägleda organogenes, men funktionen av dessa celler också beroende av deras omgivningen för vägledning3,4,5. Med tanke på betydelsen av dessa externa ledtrådar, begränsning av differentiering protokoll, och mödosamma beskaffenhet i vivo musmodeller, behövs nya system för att undersöka grundläggande utvecklingsprocesser och fysiologi.
Uppkomsten av protokollen att generera tredimensionella, komplexa organoids ger ett bekvämt och kongruent system för att studera organogenes, fysiologi, drogen effekt och även patogenes. Inrättande av murina organoids för olika system såsom den mage6 och tarmen7 har utökat vår förståelse för organogenes, ger ett verktyg för att studera utvecklingsmässiga komplexiteten med färre restriktioner än i vivo och in vitro- modeller. På grund av dessa framsteg i det murina organoid bildandet och tillkomsten av mänskliga pluripotenta stamceller celler, human intestinal8, retinal9, nedsatt10,11, och cerebral12 organoids har producerats, och detta repertoaren är endast begränsad av den befintliga kunskapen om mekanismerna för utveckling.
Av särskilt intresse är generationen av bukspottskörteln organoids, som en myriad av sjukdomar plågar olika bukspottskörteln celltyper, däribland acinar celler och kanaler i exokrin pankreasinsufficiens13, acinar celler i pankreatit14, och beta-cellerna i diabetes15. Få kunskap om utvecklingen av dessa olika celltyper kan stöd för att förstå deras patologi och kan också fungera som en plattform för personlig drogkontroll eller transplantation. Tidigare, Greggio et al. utvecklat en metod att skapa murina bukspottskörteln organoids som recapitulate i vivo morfogenes och utveckla organiserad, tredimensionella, komplexa strukturer består av alla större bukspottskörteln epitelceller typer16,17. Detta är ett stort steg framåt i fältet bukspottskörteln, särskilt som gör celler in vitro- kan aktivera biologisk undersökning av beta-cell utveckling. Dock en brist på endokrina celler bildas i detta protokoll såvida organoids transplanterades in i vävnaden, där nischen kunde interagera och ge instruktions cues17. Mesenchyme utgör den största delen av den nisch, tungt kuvertering utveckla epitel från tidiga organogenesen till senare stadier inklusive endokrina delaminering och differentiering3,4, 18. Samspelet mellan mesenchyme med utveckla bukspottkörteln är ännu ett exempel av yttre signalering och vikten av att upprätthålla i vivo cellulära komplexitet att studera organogenes.
Här, beskriver vi hur man skapar tredimensionella bukspottskörteln organoids, kallas pancreatoids, från dissocierade e10.5 murina bukspottskörteln stamfäder. Dessa pancreatoids behålla infödda mesenchyme själv montera i friflytande villkor och generera alla stora bukspottskörteln celltyper, däribland en robust antal endokrina betacellerna19. Detta tillvägagångssätt är bäst lämpad för analys av endokrina utveckling, eftersom tidigare protokoll saknar robust endokrin differentiering. Dock använder protokollet för bukspottskörteln organoids som beskrivs av Greggio et al. är bättre lämpad för analys av bukspottskörteln epitelial förgrening och morfogenes, som förgrening är mer begränsade i pancreatoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs för denna metod godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén av Baylor College of Medicine.
1. beredning av mus embryonala dag 10.5 bukspottskörteln stamfäder
Obs: Detta protokoll behöver inte följas under sterila förhållanden fram till steg 2, men det är optimalt att sterilisera dissektion verktyg och spraya med 70% etanol före användning.
- Ställ in för dissektion, fylla en ishink och placera en behållare av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i isen. Ren två spetsig pincett och dissektion sax med 70% etanol. Ligger nära området dissektion, en behållare med minst tre Borsilikat kapillär-rör munnen pipett, en tändare, och filtreras 1000 µL pipettspetsar.
- Bered minst 1 mL 1,25 mg/mL kallt dispase utspädd i steriliserat vatten och plats i den andra brunnen 12 väl platta på is. Sätta PBS i den första, tredje och fjärde brunnar av 12 väl plåt. Placera 1 mL 0,05% Trypsin i en 1,5 mL röret på is. Pre värma en skakande inkubator till 37 oC.
- Euthanize e10.5 timed-dräktiga möss enligt IACUC riktlinjer. Spraya i buken med 70% etanol att rengöra regionen innan du gör ett V-shaped snitt vid underlivet av musen med sax och pincett och fortsätta det upp till membranet.
Obs: Uppkomsten av en vaginal plugg i detta protokoll anger dygn 0,5. Använder 5 - 6 veckor gamla möss, fungerar en viktökning på mer än 2 g som en sekundär åtgärd av framgångsrika impregnering.- Noggrant punktskatt livmodern genom att göra ett snitt på den översta laterala delen av livmodern, dra orgeln uppåt från musen, och efter detta snitt ner till genitala regionen innan du upprepar på motsatt sida. Placera den i en 10 cm petriskål med kall PBS.
Obs: Det är möjligt att få organoids från e11.5 separerade celler, men till skillnad från den e10.5 pancreatoids, dessa organoids kännetecknas inte ännu och därmed får inte behålla förmåga att differentieras till alla tre stora bukspottskörteln härstamningar.
- Noggrant punktskatt livmodern genom att göra ett snitt på den översta laterala delen av livmodern, dra orgeln uppåt från musen, och efter detta snitt ner till genitala regionen innan du upprepar på motsatt sida. Placera den i en 10 cm petriskål med kall PBS.
- I ljus dissektion Mikroskop, placera petriskål och öppna försiktigt uterin vävnaden genom att placera två tången mellan varje embryo och peeling vävnad från gulesäcken. Överföra embryon genom att greppa gulesäcken försiktigt med pincett och plats i en 10 cm petriskål med färsk, kall PBS. Placera petriskål på is.
Obs: Det är viktigt att omsorgsfullt bort embryon, helst bibehållas inom gulesäcken, som kraftfullt borttagning kan dra navelsträng, rippning vävnad av embryot och äventyra den strukturella integriteten. - Placera flera PBS droppar på en 10 cm petriskål lock. Använd dessa droppar för att överföra embryot under dissektion som embryoniskt vävnader avlägsnas för att säkerställa synlighet. Överföra ett embryo till en PBS droppe och ta försiktigt bort från gulesäcken med pincett, medan återstående embryona bo i PBS på is (figur 1A). Ta bort huvudet innan du flyttar embryot till en ny PBS droppe använder tången lätt ösa embryot upp, att inte skada vävnad (figur 1B).
Obs: Vävnaden kan behöva överföras oftare till färska PBS droppar än beskrivs här, beroende på opaciteten i vätskan.- I en ny droppe PBS, ta bort forelimb knopparna använder tången (figur 1B). Placera pincetten i öppningen där lem bud var närvarande och försiktigt riva endast de flesta externa vävnaden anteriorly (figur 1B). Rotera embryo och upprepa i posterior riktning, stannar vid bakbenet knoppen. Vid denna punkt, bör mag-tarmkanalen vara synliga (figur 1B).
- Den bakre regionen i mag-tarmkanalen har en svag böj (figur 1F). Sätt tången bakom denna böj i öppningen mellan mag-tarmkanalen och spinal regionen av kroppen väggen. Lossa mag-tarmkanalen, arbeta dig långsamt uppåt tills den främre regionen nås där regionen hjärt ansluter (figur 1B-E).
Valfritt: Ta bort primordial hjärtat och levern knopparna från ventrala regioner av mag-tarmkanalen, lämnar endast kontinuerlig gut röret. De första gångerna detta protokoll utförs kan det vara lättare att lämna hjärtat och levern som ventrala sevärdheter tills morfologi av mag-tarmkanalen och dorsala bukspottskörteln knoppen är mer bekant (figur 1C och D ). - Överföra mag-tarmkanalen till färska PBS droplet-programmet.
- Ta tången och nyp försiktigt vävnaden under den utskjutande knoppen och tarmen och lyft den yttre vävnaden av (figur 1D-F).
Obs: Den dorsala bukspottskörteln bud ligger mellan magen och tarmen (figur 1C-G). Bukspottskörteln knoppen under ska se ut en runda, knölig struktur (figur 1G). - Placera pincetten där knoppen ansluter till tarmen och nypa uppåt för att lossa knoppen (figur 1G). Tvätta en gång i en ny PBS bubbla innan du överför knoppen i första brunnen av 12 väl plattan i kalla PBS på is. Upprepa tills alla knoppar samlas in från embryon och placeras i den första brunnen av 12 väl plattan.
- Placera 12 väl skålen under mikroskopet ljus dissektion. Räkna antalet bukspottskörteln knoppar framgångsrikt dissekeras för att senare beräkna delningsfaktorn.
- Plats en filtrerad 1000 µL pipettspetsen i munnen pipetten med ett kapillärrör bifogas. Lågan sterilisera kapillärröret och skapa en böj i röret för användarvänlighet. Använda kapillären för att överföra knoppar till den andra väl innehållande kalla dispase lösningen i 2 min innan den överförs till tredje brunnen med ren PBS (figur 1G).
Obs: När du överför knoppar från dispase till PBS, Undvik att vidröra vävnaden till spetsen av kapillärröret. Om vävnad fastnar på toppen av röret, Pipettera upp och ner eller skaka i ren PBS lösningen tills lossade. - Pipettera knoppar upp och ner, och överföra till den fjärde brunnen med ren PBS. Slutligen, använda kapillär enhet överför knoppar till 1,5 mL röret med 0,05% Trypsin. Placera röret i förväg värmde 37 oC shaker och skaka på 1,500 rpm för 4 min.
- Virvel för ca 10 s sedan omedelbart placera röret i en centrifug och spin för 5 min på 200 g. ta bort allt men ungefärligt 50 µL av lösningen försiktigt för att inte störa centrifugeras cellerna (figur 1G).
- Plats en filtrerad 1000 µL pipettspetsen i munnen pipetten med ett kapillärrör bifogas. Lågan sterilisera kapillärröret och skapa en böj i röret för användarvänlighet. Använda kapillären för att överföra knoppar till den andra väl innehållande kalla dispase lösningen i 2 min innan den överförs till tredje brunnen med ren PBS (figur 1G).
2. odla dissocierade stamfäder för att bilda Pancreatoids
Obs: Följande bör utföras i en steril atmosfär i en standard vävnadsodling huva, använda sterila standardförfaranden.
- För varje bud som samlas in, lägga till 400 µL organogenesen media16,17 (tabell 1) centrifugeras cellerna. Puls vortex tre gånger och platta 100 µL per brunn en låg fästpunkt 96 tavla väl, dela knoppar i förhållandet 1:4 (figur 1G).
- Kolla under mikroskopet att visualisera separerade celler fritt flytande (figur 1H). Placera kultur skålen i en 37 oC inkubator med 5% CO2 på en rocker på medellång hastighet.
- Övervaka pancreatoids dagligen. Ersätt med 100 µL av färska media var 3 dagar, noggrant pipettering media under mikroskopisk kontroll i huven för att ta bort medan pancreatoid i brunnen. Alternativt kan färsk 100 µL av media läggas till en ny brunn och pancreatoid överförs med hjälp av borosilikatglas kapillärrör bifogas mun pipett och 1000 µL filtreras pipettspetsen.
3. bearbetningen Pancreatoids för Immunofluorescerande Imaging
- Bearbeta pancreatoids för Immunofluorescerande bilder, först förbereda 4% PARAFORMALDEHYD/PBS, pH7.4 (PFA) lösning. Plats 50 µL av 4% PFA i brunnar i en 96 väl tallrik.
- Med Borsilikat kapillärrör och munnen pipett med 1000 µL filtrerade pipettspetsen, överföra pancreatoids från odlingsmedium som tar så lite media som möjligt i färska brunnen med 4% PFA. Ange på navigeringsknappen i rumstemperatur i 15 min.
- Överföra pancreatoids från 4% PFA i en brunn med 100 µL av färska PBS, rock i rumstemperatur i 5-10 min. Upprepa för totalt tre färska PBS tvättar.
Obs: Protokollet kan pausas här, med pancreatoids lagras i 100 µL av PBS på 4 oC i upp till en vecka.
- För wholemount imaging (rekommenderas om antikroppar är lämplig, alternativa tillvägagångssätt i avsnitt 3.3. och mikroskopi i 3.4.), överföra från PBS i 50 µL 5% åsna serum i 1 x PBS med 0,1% Nonjonaktivt rengöringsmedel (PBST) till block. Rock övernattning på 4 oC eller alternativt för 4 h i rumstemperatur.
- Överföra pancreatoids till en ny brunn som innehåller primära antikroppar utspädd i 50 µL av 5% åsna serum i 1 x PBST. Optimalt, rock för 24 h vid 4 oC (minst 12 h men upp till 36 h).
Obs: Antikroppar som anges i Tabell av material mot Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) och Pdx1 (1: 100) är lämpliga för wholemount färgning; andra antikroppar kräva optimering. - Överför pancreatoids till en brunn innehållande 100 µL av färska PBST tvätta och rock i 30 min i rumstemperatur. Upprepa detta steg för totalt tre färska PBST tvättar.
- Överföra pancreatoids till en ny brunn innehållande sekundära antikroppar utspädd i 50 µL av 5% åsna serum i 1 x PBST. Skydda plattan från ljus och placera i 4 oC, gunga för optimalt 24 h (minst 12 h men upp till 36 h).
Obs: Alla sekundära antikroppar som anges i den Tabell för material - och DAPI nukleära motfärg som passar wholemount färgning. - Överföra pancreatoids till en ny brunn innehållande 100 µL av 1 x PBST och rock i rumstemperatur i 30 min. Upprepa för totalt tre tvättar i 1 x PBST. I tredje och sista tvätten, lägga till 300 nM DAPI.
- Slutligen, placera i 100 µL av ren PBS och butiken på 4 oC skyddas från ljus för upp till en vecka innan imaging av konfokalmikroskopi, även om bästa resultaten kommer från imaging omedelbart efter färgning. För att förhindra förflyttning av pancreatoids under imaging men förhindra uttorkning, placera varje pancreatoid i en 20 µL droppe PBS. Om pancreatoids inte finns kvar fortfarande, minska PBS volym.
- Överföra pancreatoids till en ny brunn som innehåller primära antikroppar utspädd i 50 µL av 5% åsna serum i 1 x PBST. Optimalt, rock för 24 h vid 4 oC (minst 12 h men upp till 36 h).
- För frusna snitt, överföra pancreatoids från PBS i 30% sackaroslösning övernattning på 4 oC.
- Lägga till bädda in media i en bubbla under en dissektion Mikroskop. Med pincett under mikroskopisk kontroll, Blötlägg pancreatoids genom att försiktigt trycka genom bädda media flera gånger att ta bort kvarvarande sackaros innan du överför till en vävnad block med frysta bädda media.
- Placera i vävnad block på torris tills fryst och avsnitt på kryostaten på 8 µm.
Obs: Avsnitten kan förvaras vid-80 oC eller immunostained omedelbart. - Tillåta sektioner från-80 oC Tina i rumstemperatur i cirka 5 minuter tills de är torra. Rita en hydrofoba barriär pennan hydrofoba pap runt vävnaden och blocket använder 5% åsna serum utspätt i 1 x PBST för 30 min i rumstemperatur.
- Ta bort media och ersätta omedelbart med primära antikroppar utspätt i 5% åsna serum utspätt i 1 x PBST övernattning på 4 oC.
- Ta bort den primära lösningen och tvätta vävnader tre gånger med 1 x PBST för 10 min varje. Efter detta, lägga till sekundära antikroppar lösningen spädas i 5% åsna serum utspätt i 1 x PBST för 1 h i rumstemperatur och skydda bilder från ljus.
- Ta bort sekundära lösningen och tvätta diabilder tre gånger i 1 x PBST för 10 min varje. I den sista tvätten, lägga till 300 nM DAPI.
- Ta bort media och tillsätt montering media och ett täckglas. Store glider bort från ljuset i 4 oC tills det att bilden.
4. isolering av RNA från Pancreatoids för avskrift analys
- Samla in pancreatoids med hjälp av borosilikatglas kapillär bifogas en mun pipett med en filtrerad 1000 µL pipettspetsen för sterilitet och plats till 500 µL av syra guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform lösning i en 1,5 mL tub. Förvaras vid-80 oC eller omedelbart gå vidare till RNA isolering.
- För RNA isolering, Tina prover på isen om det behövs och tillsätt 100 µL av kloroform. Vortex väl och plats i 4 oC för 15 min. cool före en centrifug-4 oC.
- Placera rören i centrifug och snurra i 20 min vid 12 000 g på 4 oC.
- Ta försiktigt bort rören för att inte störa separation av lager. Med 200 µL pipett samla en klar vattenlösning och placera i en ny 1,5 mL tub, lämnar efter sig en liten mängd till buffert från den vita protein och rosa DNA skikt. Rör inte spetsen på pipetten till någonting i denna process och inte vidrör väggarna i 1,5 mL röret.
- Tillsätt 500 µL av 100% isopropanol till nya röret som innehåller vattenskiktet och vortex. Låt stå i rumstemperatur i 20 min, längre på isen, eller för maximal nederbörd lämna över natten vid-20 oC.
- Centrifugera vid 12 000 g i 15 min på 4 oC till pellet RNA. Ta bort isopropanol utan att störa pelleten.
Obs: Eftersom pancreatoids är små, det är troligt pelleten inte kommer att synas. - Tillsätt kall, 75% etanol och Invertera röret flera gånger. Placera i centrifugen och snurra på 9 000 x g under 10 minuter vid 4 oC. ta bort den etanol och spin för 2 min vid 9 000 x g.
- Använd 200 µL pipett för att ta bort alla återstående etanol i röret, utan att kontakta regionen pelleten är bosatt i. Lämna locket öppet på röret för 5-10 min i rumstemperatur att säkerställa avdunstning av kvarvarande etanol.
- Återsuspendera pelleten i av vortexa i 20 µL av rent, nuclease-gratis vatten.
Tillval: Värme RNA vid 65 oC i 3 min och omedelbart återvända till isen. RNA kan lagras vid-80 oC eller omedelbart användas för omvänd Transkription och qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Noggrann dissektion av musembryon på e10.5 från livmoderns horn bör ge oskadade embryon i PBS för ytterligare dissektion (figur 1A). Mag-tarmkanalen kan effektivt avlägsnas från embryot (figur 1B), tillåter urskiljning av dorsala bukspottskörteln bud vid korsningen av tarmen och magen (figur 1C-F). E10.5 bukspottskörteln knoppen har tidigare präglats; progenitorceller bör uttrycka Pdx1, Sox9, Ptf1a, och Hes120,21,22,23. Efter vävnad behandlingssteg, dissocierade bukspottskörteln enstaka celler eller små grupper av celler kan visualiseras genom ljusmikroskop (figur 1G-H).
I organogenesen media, dessa friflytande, byggnadsställning-fria celler själv montera och organisera i tredimensionella pancreatoids som växer och kvarstå i minst tio dagar i kultur (figur 2A). Pancreatoids har morfologiska likheter med i vivo bukspottkörteln, med grenig morfogenes förekommer. Med hjälp av transgena möss, kan olika celltyper eller processer övervakas i realtid. Exempelvis kan använder Ins1-andra24 möss för att markera bildandet av endokrina betacellerna, pancreatoids avbildas i dagliga att visualisera beta cell utveckling (figur 2B). Vidare genom att ändra odlingsbetingelser, lägga till små molekyler, droger eller att manipulera genomet, inte bara kan cellen öde bestämning bedömas men förändringar i struktur och morfologi kan också undersökas. Här visar vi tillämpningen av protein kinase C aktivare phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) vid höga koncentrationer (160 nM), som förändrar morfologin av utveckla pancreatoids, leder till löst associerade epitelceller och ökade förgrening 19 (figur 2C).
För att bedöma associering av bukspottskörteln mesenchyme vävnad med bukspottskörteln epitelceller, kan immunfärgning utföras för markörer för varje vävnad. Immunfärgning av kanalen markör, DBA25,26, med en endokrina markör, Chga27och atomkärnor präglas av DAPI avslöja flera härstamning bildande i pancreatoids (figur 3A). Mesenchyme markör, Vimentin, målat tillsammans med bukspottskörteln stamceller markör (från e9.0 till ungefärligt e15.5) Pdx1, visar att mesenchyme omsluter pancreatoid (figur 3B). Immunfärgning kan också användas för att undersöka morfologi, med Pdx1 avslöjande förgrenande strukturer, liksom olika markörer celltyper sevärdheter. I figur 3C, vi visualiserar beta cell utveckling av färgning för epitelial markören Pdx1 och beta cell markören Ins. med qPCR analys, avskrifter av stamfäder och differentiera celler en bedömas, såsom stamfader gener Pdx1 och Hes1, och differentierade markörer Prss3, Isl1, Hnf6, Prss1, Nkx6-1, och Ins1 (figur 4),.
Figur 1: skissera av dissektion, dissociation, och plätering av e10.5 bukspottskörteln stamfäder för den pancreatoid generationen. (A) brightfield bilden av e10.5 embryo. (B) schematiskt arbetsordning dissektion, börjar överst till vänster. Röda, streckade linjer visar regioner att skära, medan den gröna regionen är mag-tarmkanalen. Huvudet avlägsnas först, följt av borttagning av forelimb knoppar och öppnandet av sidan av organismen. (C) magtarmkanalen noggrant avlägsnas, med hjärta och lever knopparna sticker ut från den ventrala regionen i tarmkanalen. Magen, dorsala bukspottskörteln bud, och tarmen kan visualiseras, som visas i bilden brightfield. (D) avlägsnande av hjärtat och levern knoppar. Schematiska är till vänster och brightfield bilden är till höger. (E) Pinching av vävnad runt den dorsala bukspottskörteln bud att exponera knoppen för dissektion. Schematiska är till vänster och brightfield bilden är till höger. (F) i mag-tarmkanalen med den dorsala bukspottskörteln bud under brightfield mikroskopi. I bilden till vänster syns böjen i tarmen, där tången kan placeras när du lossar mag-tarmkanalen från regionen spinal. Till höger visar hög förstoring brightfield bilden både rygg- och ventrala bukspottskörteln knopparna. (G) avlägsnande av de dorsala bukspottskörteln knopp bearbetning av vävnad innan dissociation, resuspension i organogenesen media, och plätering. (H) brightfield bilden visar dissocierade celler omedelbart efter bordläggningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Övervakning pancreatoids över tid. (A) Brightfield bilder av pancreatoids på dag 1, dag 2 och dag 3. Skala barer = 100 um. (B) Manipulation av odlingsbetingelser att undersöka pankreas morfogenes. Här, leder tillägg av höga nivåer av PMA till lossade epitelial struktur och ökad förgrening, som visualiseras genom brightfield mikroskopi på dag 1 och 2. Skala barer = 100 µm. (C) Ins1-andra musen pancreatoids på dag 4, dag 5, dag 6, dag 7 och dag 9, med utvecklingen av betacellerna anges med andra i grönt. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunfärgning av pancreatoids. (A) immunfärgning pancreatoid dag 5 att markera kanaler av DBA i röd, endokrina celler av Chga i grönt och kärnor av DAPI blåmarkerade. (B) immunfärgning pancreatoid dag 7 att markera mesenchyme av Vimentin i röda och bukspottskörteln föräldraparets av Pdx1 i grönt. (B) immunfärgning pancreatoid dag 7 att markera betacellerna av Insulin i röda och bukspottskörteln föräldraparets av Pdx1 i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Avskrift analys. Kvantitativ PCR av dag 7 pancreatoids markörer av stamfäder och särskiljande celler. Jämförelse i vivo murina vävnad visas i Scavuzzo et al. (2017). resultaten är normaliserad till Gapdh. N = 2, skala barer är SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Komponent | Förkortning | Slutlig koncentration |
| Penicillin-Streptomycin | P/S | 1% |
| FBS-fria medier komplettera | 10% | |
| Beta-merkaptoetanol | bME | 0,1 mM |
| Phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat | PMA | 16 nM |
| Y-27632 eller ROCK-hämmare | RI | 10 uM |
| Epidermal tillväxtfaktor | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| sura Fibroblast tillväxtfaktor, Fibroblast tillväxtfaktor 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| Heparin natriumsalt | Heparin | 2 U/mL |
| Fibroblast tillväxtfaktor 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbeccos modifierade Eagle Medium/näringsämne blandning F-12 | DMEM/F12 | till 5 mL |
Tabell 1. Organogenesen media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av cellen kultur modeller är avgörande för korrekt modell utveckling, ge kliniskt relevanta celltyper, test drogen effekt eller ens transplantation till patienter. Dock går konstgjort igenom utveckling i en maträtt är utmanande eftersom vi är fortfarande långt ifrån förstå mekanismerna för organogenes och fysiologi invivo. In vitro- celler är således ineffektivt genererade, inte fullt fungerande, inte kan bibehållas under lång tid eller hysa andra avvikelser från jämförbara celler i kroppen. Detta beror på att många olika celltyper interagera medan komplexa morphogenetic förändringar sker för att påverka utveckling och fysiologi. Att få en förståelse för hur utvecklingen fortsätter genom att kombinera bekvämligheten av in vitro- skulle system bibehållen komplexitet i vivo utveckling ge ett värdefullt verktyg för biomedicinsk forskning.
Utvecklingen av organoids är en lovande avenue mot modellering komplexiteten i utveckling. I detta protokoll beskriver vi hur man gör bukspottskörteln organoids, kallas pancreatoids, som behåller infödda mesenchyme och kraftfullt genererar endokrina celler, om än pancreatoids inte uppvisar glukos lyhördhet. Detta verktyg kan användas för att undersöka mekanismer för utveckling samt funktionalitet i ett kultur-system som upprätthåller vävnad som finns i vivoheterogenitet. Detta kan dessutom användas för genetiska skärmar eller skärmen små molekyler eller droger. Detta är särskilt intressant, eftersom provning läkemedelskandidater i relativt homogen kultur cellsystem kan kringgå effekterna av dessa föreningar på andra närbesläktade celltyper.
Det finns flera kritiska steg under detta protokoll. Första, noggrann borttagning av embryon från livmodern är viktigt som att dra embryon ut kraftfullt kan rippa bukhålan och gör det svårt att urskilja magtarmkanalen för att erhålla bukspottskörteln knoppen (steg 1.3). Andra, ren dissektion av bukspottskörteln bud från magtarmkanalen är kritisk, eftersom tar överflödig vävnad kan leda till differentiering av andra celltyper (steg 1.4.4). För att göra detta, är det viktigt att nypa nedanför pankreas knoppen och lyft den överliggande vävnaden före isolera bukspottskörteln knoppen. Slutligen, när du flyttar knoppar från dispase tillbaka i PBS att tvätta, är det nödvändigt att använda ett Borsilikat kapillärrör och att inte låta vävnaden som tryck på kanten av röret öppningen, annars, vävnaden kommer att hålla sig till toppen av röret (steg 1.5.1). Undvik detta genom att börja mun pipettering lösning innan du flyttar mot knoppen, så att knoppen att gå in i röret i stället för på utsidan.
Denna metod tillåter bildandet av endokrina celler i en 3D pancreatoid, men den epiteliala förgrening är mer begränsad än andra befintliga protokoll16,17. Ytterligare, medan insulinproducerande endokrina celler form, de inte förevisar glukos lyhördhet. Således, ytterligare utredning av mognaden av dessa celler kommer att ge värdefull information både i generationen av funktionella pancreatoids samt till fältet i betacellen generation i allmänhet.
Generering av pancreatoids att utveckla endokrina celler, och i framtiden, som få glukos lyhördhet, potentiella konsekvenser för behandling av diabetes. Diabetes är en självskriven kandidat för regenerativ behandling, som betaceller är förlorade eller dysfunktionella och ersätta dessa celler kan potentiellt lindra komplikationer sjukdom. Framsteg har gjorts i differentiera hPSCs in i beta-cellerna, dock i diabetes, finns det ofta dysfunktioner till andra typer av celler i bukspottkörteln tillsammans med beta-celler, inklusive alfaceller eller acinar celler28,29, 30,31,32. Generera nya bukspottkörtelns vävnad för transplantation kan således helt ersätta den drabbade vävnaden. Med den ytterligare undersökningen av murina pancreatoid bildning och funktion, kan utvecklingsmässiga banan vara härmade för att generera mänskliga pancreatoids ur hPSCs. Dessa mänskliga pancreatoids kan användas för personlig medicin till skärmen för lyhördhet för droger i ett patient-specifika sammanhang och regenerativ behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jolanta Chmielowiec för bra diskussion angående protokollet och manuskript. Vi tackar också Benjamin Arenkiel för tillgång till confocal mikroskopet. Detta arbete fick stöd av NIH (P30-DK079638 till M.B.) och T32HL092332-13 M.A.S. och M.B., McNair medicinska stiftelsen (att M.B.) och confocal kärnan vid BCM intellektuella och utvecklingsstörningar Research Center (NIH U54 HD083092 från Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
