Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57599

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere insulin uttrykke 3D murine pancreatoids fra frittflytende e10.5 dissosiert bukspyttkjertelen progenitors og den tilknyttede mesenchyme.

Abstract

Bukspyttkjertelen er en komplisert organ består av mange forskjellige celletyper som arbeider sammen for å regulere blod glukose homeostase og fordøyelse. Disse celletyper inkluderer enzym-sekresjon acinar celler, en arborized ductal system ansvarlig for transport av enzymer til gut, og hormon-produserende endokrine cellene.

Endokrine beta-cellene er den eneste celle i kroppen som produserer insulin til å senke blodsukkernivået. Diabetes, en sykdom karakterisert ved tap eller dysfunksjon av beta-cellene, har nådd epidemiske proporsjoner. Derfor er det viktig å etablere for å undersøke beta-celle utvikling som kan brukes for screening formål for å utlede stoffet, og cellen-basert therapeutics. Mens eksperimentelle etterforskningen av musen utvikling er viktig, er i vivo studier arbeidskrevende og tidkrevende. Kultivert celler gir en enklere plattform for screening; men de er ikke opprettholde mobilnettet mangfold, arkitektoniske organisasjonen og mobilnettet interaksjoner fant i vivo. Dermed er det avgjørende å utvikle nye verktøy for å undersøke bukspyttkjertelen organogenesen og fysiologi.

Bukspyttkjertelen epitelceller utvikle i nært samarbeid med mesenchyme fra utbruddet av organogenesen celler organisere og skille ut komplekse, fysiologisk kompetente voksne orgel. Bukspyttkjertelen mesenchyme gir viktig signaler for endokrine utvikling, hvorav mange ikke er godt forstått ennå, dermed vanskelig å recapitulate under i vitro kulturen. Her beskriver vi en protokoll til kultur tredimensjonale, mobilnettet komplekse musen organoids som beholder mesenchyme, kalt pancreatoids. E10.5 murint bukspyttkjertelen bud er dissekert, avstand og kultivert i en stillaset miljø. Disse flytende cellene samle selv mesenchyme innhyllende utvikle pancreatoid og en robust rekke endokrine beta-cellene utvikle den acinar og rør cellene. Dette systemet kan brukes til å studere celle skjebne besluttsomhet, strukturelle organisasjon og morphogenesis, celle-celle samhandlingene under organogenesen, eller for narkotika, små molekyl eller genetisk screening.

Introduction

Det er viktig å forstå sykdom etiologien og til slutt dyrke behandlingsmetoder skildre mekanismer for normal utvikling og fysiologi. Dyrking og skille stamceller kan rask og høy gjennomstrømming analyse av utviklingen, det er begrenset av den eksisterende kroppen av kunnskap om mekanismer regulere celle skjebne og kunstig viser utviklingen i en relativt homogen, todimensjonal tilstand1,2. Ikke bare i vivo utvikling påvirket av ytre påvirkninger, med ulike celletyper i nisje og miljø gir paracrine signaler og organisatoriske å veilede organogenesen, men funksjonen til disse cellene også avhengig av deres omgivelser for veiledning3,4,5. Gitt viktigheten av disse eksterne signaler, begrensningene for differensiering protokoller og arbeidskrevende natur i vivo musen modeller, for nye systemer å undersøke eksperimentelt grunnleggende utviklingsprosesser og fysiologi.

Fremveksten av protokoller for å generere tredimensjonale, komplekse organoids gir en praktisk og sammenfallende system for å studere organogenesen, fysiologi, narkotika effekt og selv patogenesen. Etablere murine organoids for forskjellige systemer som magen6 og tarmen7 har utvidet vår forståelse av organogenesen, gir et verktøy for å studere utviklingsmessige kompleksiteten med færre begrensninger enn i vivo og i vitro modeller. På grunn av disse fremskritt i murine organoid dannelsen og utviklingen av menneskelig pluripotent stilk celler, menneskelige tarmen8, netthinnen9, nyre10,11og cerebral12 organoids har blitt produsert, og dette repertoar er bare begrenset av de eksisterende kunnskapen om mekanismer for utvikling.

Av spesiell interesse er generasjonen av bukspyttkjertelen organoids, som en rekke sykdommer plager ulike bukspyttkjertelen celletyper, inkludert acinar celler og kanaler i exocrine pancreatic mangelfull13acinar celler i pankreatitt14, og cellene i diabetes15. Få kunnskap om utviklingen av disse forskjellige celletyper kan hjelpe forstå deres patologi og kan også fungere som en plattform for personlig narkotikarelaterte screening eller transplantasjon. Tidligere utviklet Greggio et al. en metode for å opprette murine bukspyttkjertelen organoids som recapitulate i vivo morphogenesis og utvikle organisert, tredimensjonale, komplekse strukturer består av alle de store bukspyttkjertelen epithelial celle typene16,17. Dette er et stort skritt fremover innen bukspyttkjertelen, spesielt som gjør celler i vitro kan aktivere biologiske undersøkelser av beta-celle utvikling. Men en knapphet på endokrine celler dannet i denne protokollen med mindre organoids ble transplantert inn i vev, hvor nisje kan samhandle og gi opplæring stikkordene17. Mesenchyme utgjør den største delen av nisje, tungt innhyllende utvikle epitel fra tidlige stadier av organogenesen til senere stadier inkludert endokrine delaminering og differensiering3,4, 18. Samspillet av mesenchyme med utvikle bukspyttkjertelen er nok et eksempel på ytre signalisering og viktigheten av å opprettholde i vivo mobilnettet kompleksitet å studere organogenesen.

Her beskriver vi hvordan å generere tredimensjonale bukspyttkjertelen organoids, kalt pancreatoids, fra avstand e10.5 murint bukspyttkjertelen progenitors. Disse pancreatoids beholder opprinnelig mesenchyme, selv montere frittflytende forhold og generere alle store bukspyttkjertelen celletyper, inkludert en robust endokrine beta-cellene19. Denne metoden er best egnet for analyse av endokrine utvikling, som tidligere protokoller mangler robust endokrine differensiering. Imidlertid bruker protokollen for bukspyttkjertelen organoids som beskrevet av Greggio et al. passer bedre for analyse av bukspyttkjertelen epithelial forgrening og morphogenesis, som forgrening er mer begrenset i pancreatoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk beskrevet i denne metoden ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Baylor College of Medicine.

1. utarbeidelse av mus embryonale dag 10.5 bukspyttkjertelen Progenitors

Merk: Denne protokollen trenger ikke følges under sterile forhold til trinn 2, men det er optimalt å sterilisere disseksjon verktøy og spray med 70% etanol før bruk.

  1. Sette opp for disseksjon, Fyll en isen bøtte og plassere en beholder fosfat bufret saltoppløsning (PBS) i isen. Rengjør to tynn tang og disseksjon saks med 70% etanol. Ligger nær disseksjon, en beholder med minst tre borosilicate kapillær rør, en munn pipette, en lighter, og filtrert 1000 µL pipette-spisser.
    1. Forbered minst 1 mL av 1,25 mg/mL kaldt dispase fortynnet i steriliserte vann og sted i andre godt av en 12 godt plate på is. Sette PBS i første, tredje og fjerde brønner av 12 vel plate. Sted 1 mL 0,05% Trypsin i en 1,5 mL tube på is. Forvarm en risting inkubator 37 oC.
  2. Euthanize e10.5 tidsbestemte-gravide mus IACUC retningslinjer. Spray magen med 70% etanol å rengjøre området før du gjør en V-formet snitt på kjønnsorganene av musen med saks og tang og Fortsett det mellomgulvet.
    Merk: En vaginal plugg i denne protokollen viser dag 0,5. Bruker 5 - 6-uke-gamle mus, fungerer en vektøkning mer enn 2 g som et sekundært forsvar av vellykket impregnering.
    1. Nøye avgiftsdirektoratet livmoren ved å gjøre et snitt på den øverste laterale delen av livmoren, trekke orgelet oppover fra musen, og etter denne snitt til kjønnsorganene regionen før gjenta på motsatt side. Legge den i en 10 cm Petriskål med kaldt PBS.
      Merk: Det er mulig å skaffe organoids fra e11.5 dissosiert celler, men i motsetning til e10.5-pancreatoids disse organoids ikke er ennå preget og dermed ikke beholder evnen til å skille ut alle tre store bukspyttkjertelen overleveringslinjer.
  3. Under en lys disseksjon mikroskop, plassere Petriskål og nøye åpne livmor vev ved å plassere to tang mellom hver embryoet og peeling vev fra plommesekken. Overføre embryo ved fatte plommesekken forsiktig med tang og plass i en 10 cm Petriskål med friske, kaldt PBS. Plass Petriskål på isen.
    Merk: Det er viktig å fjerne heedfully embryoer, fortrinnsvis vedlikeholdes i plommesekken, som kraftig fjerning kan trekke navlestrengen, ripping vev av fosteret, og at den strukturelle integriteten.
  4. Plasser flere PBS drops på 10 cm Petriskål lokk. Bruk disse dråper til å overføre fosteret under disseksjon extraembryonic vev er fjernet for å sikre synlighet. Overføre et embryo til en PBS dråpe og forsiktig fjerne fra plommesekken ved hjelp av pinsett, mens de resterende embryoene bo i PBS på is (figur 1A). Fjerne hodet før embryoet en ny PBS slipp ved hjelp av pinsett å lett øse fosteret, å ikke skade vev (figur 1B).
    Merk: Vevet kan må overføres oftere til frisk PBS dråper enn beskrevet her, avhengig av tettheten av væsken.
    1. I en ny PBS slipp, fjerne forlemen knoppene ved hjelp av pinsett (figur 1B). Plasser tang i åpningen der lem bud var til stede og forsiktig rive bare på de fleste eksterne tissue peke (figur 1B). Rotere embryoet gjenta i bakre retning, stopper ved hindlimb bud. På dette punktet, skal fordøyelsessystemet vises (figur 1B).
    2. Den bakre delen av fordøyelsessystemet har en liten sving (figur 1F). Sett tang bak denne svingen i åpningen mellom mage-tarmkanalen og spinal regionen kroppen veggen. Koble fordøyelsessystemet arbeide langsomt oppover til regionen mest fremre er nådd der hjerte regionen kobles (figur 1B-E).
      Valgfritt: Fjerne primordial hjerte og lever knoppene fra ventrale regionene i mage-tarmkanalen, forlater bare kontinuerlig gut røret. De første gangene denne protokollen utføres kan det være lettere å forlate hjerte og lever som ventrale landemerker til morfologi av mage-tarmkanalen og dorsal bukspyttkjertelen bud er mer kjent (figur 1C og D ).
    3. Overføre fordøyelsessystemet til frisk PBS slippverktøyet.
    4. Ta tang og forsiktig knip vevet under utstående bud og tarmen og litt løft ytre vev av (figur 1D-F).
      Merk: Dorsal bukspyttkjertelen knopp ligger mellom magen og tarmen (figur 1C-G). Bukspyttkjertelen knopp under burde ligne en runde, knobby struktur (figur 1G).
    5. Plasser tang der knoppen kobles til tarmen og knipe oppover å løsne bud (figur 1G). Vask en gang i en ny PBS boble før du overfører bud i den første brønnen av 12 godt plate i kalde PBS på is. Gjenta til alle knopper er Hentet fra embryo og plassert i første brønn av 12 godt plate.
  5. Plass 12 vel rett under lys disseksjon mikroskop. Antallet bukspyttkjertelen knopper er dissekert senere beregne delt forholdet.
    1. Sted en filtrert 1000 µL pipette tips i munnen pipette med et kapillær rør festet. Flammen sterilisere kapillarrør og opprette en sving i røret for brukervennlighet. Bruk av kapillær overføre knopper til den andre godt med kaldt dispase løsningen i 2 minutter før du overfører til den tredje godt med ren PBS (figur 1G).
      Merk: Mens overføre knopper fra dispase til PBS, unngå å berøre vevet til spissen av kapillarrør. Hvis vev fast på spissen av røret, Pipetter opp og ned eller riste i ren PBS løsningen til løsnet.
    2. Pipetter knopper opp og ned, og Overfør til fjerde brønnen med ren PBS. Til slutt bruker kapillær enheten overføring knopper til 1,5 mL røret med 0,05% Trypsin. Sett røret i forvarmes 37 oC shaker og rist på 1500 rpm for 4 min.
    3. Vortex for ca 10 s deretter umiddelbart sett røret i en sentrifuge og spinn for 5 min 200 g. fjerne alle men ca 50 µL løsning forsiktig til ikke forstyrr centrifuged cellene (figur 1G).

2. dyrking dissosiert Progenitors å danne Pancreatoids

Merk: Følgende skal utføres i et sterilt atmosfære i standard vev kultur hette, ved hjelp av standard steril prosedyrer.

  1. For hvert bud samlet, legge til 400 µL organogenesen media16,17 (tabell 1) centrifuged cellene. Puls vortex tre ganger og plate 100 µL per brønn av en lav vedlegg 96 tallerkenen godt, dele knopper i 1:4 forholdet (figur 1G).
  2. Sjekk under mikroskopet visualisere dissosiert celler fritt flytende (figur 1H). Plass kultur rett i en 37 oC inkubator med 5% CO2 på en rocker på medium hastighet.
  3. Overvåke fremdriften av pancreatoids daglig. Erstatt med 100 µL av fersk media hver 3 dager, nøye pipettering media mikroskopiske kontroll i hette å fjerne samtidig la pancreatoid i brønnen. Alternativt kan frisk 100 µL av medier legges til en ny brønn og pancreatoid overføres ved hjelp av borosilicate kapillarrør knyttet til munnen pipette og 1000 µL filtrert pipette tips.

3. behandle Pancreatoids for Immunofluorescent Imaging

  1. Behandle pancreatoids for immunofluorescent bilder, først forberede 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) løsning. Plass 50 µL på 4% PFA i brønner på en 96 godt plate.
    1. Bruke borosilicate kapillær rør og munnen pipette 1000 µL filtrerte pipette spissen, overføre pancreatoids fra kultur medium tar så lite media som mulig i frisk brønnen med 4% PFA. Angi rocker i romtemperatur i 15 min.
    2. Overføre pancreatoids fra 4% PFA inn i en brønn med 100 µL av fersk PBS, rock ved romtemperatur for 5-10 min. Gjenta totalt av tre frisk PBS vasker.
      Merk: Protokollen kan pauses her, med pancreatoids lagret i 100 µL av PBS på 4 oC i opptil en uke.
  2. For wholemount avbildning (anbefalt hvis antistoffer er egnet, alternativ tilnærming i Seksjon 3.3. og mikroskopi i 3.4.), overføre fra PBS til 50 µL 5% esel serum i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisert vaskemiddel (PBST) til blokk. Rock overnatting på 4 oC eller 4 h ved romtemperatur.
    1. Overføre pancreatoids til en ny brønn som inneholder primære antistoffer fortynnet i 50 µL av 5% esel serum i 1 x PBST. Optimalt, rock 24 h på 4 oC (minst 12 h men opptil 36 h).
      Merk: Antistoffer oppført i Tabell for materiale mot Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400) og Pdx1 (1: 100) er egnet til wholemount farging; andre antistoffer krever optimalisering.
    2. Overføre pancreatoids til et godt som inneholder 100 µL av fersk PBST å vaske og rock i 30 min ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet for totalt tre frisk PBST vasker.
    3. Overføre pancreatoids til en ny brønn som inneholder sekundære antistoffer fortynnet i 50 µL av 5% esel serum i 1 x PBST. Beskytte platen fra lys og plasser i 4 oC, rocking optimalt 24 h (minst 12 h men opptil 36 h).
      Merk: Alle sekundære antistoffer oppført i Tabell av materialer og DAPI kjernefysiske counterstain er egnet for wholemount flekker.
    4. Overføre pancreatoids til en ny brønn som inneholder 100 µL av 1 x PBST og rock ved romtemperatur for 30 min. Gjenta totalt av tre vasker i 1 x PBST. I den tredje og siste vasken, legger du til 300 nM DAPI.
    5. Til slutt, plasser i 100 µL av ren PBS og butikk på 4 oC beskyttet fra lys for opptil en uke før imaging av AC confocal mikroskopi, selv om beste resultatene kommer fra imaging umiddelbart etter farging. For å forhindre bevegelse av pancreatoids under bildebehandling, men hindre uttørking, plassere hver pancreatoid i en 20 µL dråpe PBS. Hvis pancreatoids ikke værende likevel, redusere PBS volum.
  3. Frosne deler, overføre pancreatoids fra PBS til 30% sucrose løsning overnatting på 4 oC.
    1. Legge til innebygging medier i en boble under disseksjon mikroskop. Ved hjelp av pinsett mikroskopiske kontroll, nyt pancreatoids ved forsiktig skyve gjennom innebygging media flere ganger for å fjerne gjenværende sukrose før du overfører til en vev blokk med frosne innebygging media.
    2. Plass vev blokk på tørris til frosset og delen på kryostaten på 8 µm.
      Merk: Deler kan lagres på-80 oC eller immunostained umiddelbart.
    3. Tillate inndelinger fra-80 oC å tine i romtemperatur i ca 5 min til tørr. Tegne en hydrofobe barriere bruke hydrofobe pap pennen rundt vevet og blokken med 5% esel serum fortynnet i 1 x PBST i 30 min ved romtemperatur.
    4. Fjerne media og erstatte umiddelbart med primære antistoffer fortynnet i 5% esel serum fortynnet i 1 x PBST overnatting på 4 oC.
    5. Fjerne den primære løsningen og vask vev tre ganger med 1 x PBST i 10 min. Denne legge sekundære antistoff løsningen fortynnet i 5% esel serum fortynnet i 1 x PBST 1t ved romtemperatur og beskytte lysbilder fra lys.
    6. Fjerne sekundære løsningen og vask lysbilder tre ganger i 1 x PBST i 10 min. Legg til 300 i siste vask, nM DAPI.
    7. Fjerne media og legge monterer medier og en dekkglassvæske. Lagre lysbilder fra lys i 4 oC helt klar til å image.

4. isolering av fra Pancreatoids for transkripsjon analyse

  1. Samle pancreatoids bruker borosilicate kapillær knyttet til en munn pipette med filtrerte 1000 µL pipette tips for sterilitet og plass til 500 µL av syre guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform løsning i en 1,5 mL tube. Lagre på-80 oC eller fortsette umiddelbart til RNA isolasjon.
  2. RNA isolering, tine prøvene på is eventuelt og legge 100 µL av kloroform. Vortex godt og plass i 4 oC i 15 min. kule pre en sentrifuge 4 oC.
    1. Plassere rør i sentrifuge og spinn for 20 min på 12.000 g ved 4 oC.
    2. Fjern forsiktig rør å ikke forstyrre separasjon av lag. Bruker en 200 µL pipette, samle den klare vandig løsningen og plasser i en ny 1,5 mL tube, etterlot et lite beløp til bufferen fra hvit protein lag og rosa DNA lag. Ikke berør tuppen av pipette noe i denne prosessen og ikke røre veggene av 1,5 mL tube.
    3. Legg til 500 µL av 100% isopropanol det nye røret som inneholder vandig lag og vortex. La sitte ved romtemperatur for 20 min, lenger på isen, eller for maksimal nedbør la over natten på-20 oC.
    4. Sentrifuge 12.000 g i 15 min på 4 oC til pellets RNA. Fjern isopropanol uten å forstyrre pellet.
      Merk: Som pancreatoids er små, er det sannsynligvis pellet ikke vil være synlig.
    5. Legg kaldt, 75% etanol og invertere røret flere ganger. Plasser i en sentrifuge og spinne 9000 x g i 10 min på 4 oC. Fjern etanol og spinn for 2 min 9000 x g.
    6. Bruk en 200 µL pipette for å fjerne eventuelle gjenværende etanol i røret, uten kontakter regionen i pellet ligger i. La lokket åpent på røret i 5-10 min ved romtemperatur å sikre fordampning av gjenværende etanol.
    7. Resuspend pellets i ved vortexing i 20 µL av ren, nuclease uten vann.
      Valgfritt: Varme RNA ved 65 oC 3 min og umiddelbart tilbake på isen. RNA kan lagres på-80 oC eller brukt omvendt transkripsjonstjenester og qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forsiktig Disseksjon av mouse embryoer på e10.5 fra livmor Hornet skal gi uskadet embryo i PBS for ytterligere disseksjon (figur 1A). Mage-tarmkanalen kan effektivt fjernet fra embryoet (figur 1B), tillater dømmekraft dorsal bukspyttkjertelen bud i krysset av intestine og mage (figur 1C-F). E10.5 bukspyttkjertelen bud har tidligere vært preget; progenitors bør uttrykke Pdx1, Sox9, Ptf1a, og Hes120,21,22,23. Etter vev behandlingstrinnene, dissosiert bukspyttkjertelen enkeltceller eller små grupper av celler kan visualiseres * lys (figur 1G-H).

I organogenesen medier, disse frittflytende, stillas-fri cellene selv samle og organisere i tredimensjonale pancreatoids som vokser og opprettholde i minst ti dager i kultur (figur 2A). Pancreatoids har morfologiske likheter i vivo bukspyttkjertelen, med branching morphogenesis oppstår. Bruker transgene mus, kan ulike celletyper eller prosesser overvåkes i sanntid. For eksempel kan bruker Ins1-eGFP24 mus merke dannelsen av endokrine beta celler, pancreatoids avbildes i daglig å visualisere beta-celle utvikling (figur 2B). Videre ved å endre oppdrettsforholdene, legge små molekyler, narkotika eller manipulere genomet, ikke bare kan vurderes celle skjebne bestemmelse men endringer i strukturen og morfologi kan også undersøkes. Her viser vi anvendelsen av protein kinase C aktivator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) på høye konsentrasjoner (160 nM), som endrer morfologi av utvikle pancreatoids, fører til løst tilknyttet epitelceller og økt forgrening 19 (figur 2C).

For å vurdere tilknytningen av bukspyttkjertelen mesenchyme vev bukspyttkjertelen epitelceller, kan immunostaining utføres for markører for hvert vev. Immunostaining av rør markør, DBA25,26, med en endokrine indikator, Chga27og kjerner preget av DAPI avsløre flere avstamning formasjon i pancreatoids (Figur 3A). En mesenchyme markør, Vimentin, co beiset med merketråd bukspyttkjertelen stamfar (fra e9.0 til ca e15.5) Pdx1, viser at mesenchyme omslutter pancreatoid (Figur 3B). Immunostaining kan også brukes til å undersøke morfologi, med Pdx1 avslørende forgrening strukturer, samt ulike markører celletyper rundt. I Figur 3Cvi visualisere beta-celle utvikling av flekker for epithelial markøren Pdx1 og beta-celle markøren Ins. Bruk qPCR analyse, utskrifter av progenitors og skille celler en vurderes, for eksempel stamfar gener Pdx1 og Hes1, og differensiert markører Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, og Ins1 (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over disseksjon, dissosiasjon, og plating av e10.5 bukspyttkjertelen progenitors for pancreatoid generasjon. (A) brightfield bildet av e10.5 fosteret. (B) skjematisk av disseksjon fremgangsmåten, fra øverst til venstre. De stiplede linjer angir områdene å kutte, mens grønne regionen er gastrointestinaltraktus. Først fjernes hodet etterfulgt av fjerning av forlemen knopper og åpning av siden av organismen. (C) fordøyelsessystemet nøye fjernes, med hjerte og lever knoppene stikker fra ventrale regionen i tarmkanalen. Mage, rygg bukspyttkjertelen bud, og tarmen kan visualiseres, som vist i brightfield bildet. (D) fjerning av hjerte og lever knopper. Skjematisk er på venstre og brightfield bildet til høyre. (E) Pinching til vevet rundt dorsal bukspyttkjertelen bud å avsløre bud for disseksjon. Skjematisk er på venstre og brightfield bildet til høyre. (F) fordøyelsessystemet med dorsal bukspyttkjertelen knopp under brightfield mikroskopi. I bildet til venstre er svingen i tarmen synlig, der tang kan plasseres når demontering gastrointestinalkanalen fra spinal regionen. Til høyre viser forstørring brightfield bildet både rygg- og ventrale bukspyttkjertelen knopper. (G) fjerning av dorsal bukspyttkjertelen bud og behandling av vev før dissosiasjon, rørets i organogenesen medier, og plating. (H) brightfield bildet viser avstand celler umiddelbart etter plating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Overvåking pancreatoids over tid. (A) Brightfield bilder av pancreatoids på dag 1, dag 2 og dag 3. Skalere barer = 100 um. (B) manipulering av oppdrettsforholdene undersøke bukspyttkjertelen morphogenesis. Her, fører tillegg av høye nivåer av PMA til løsnet epithelial struktur og økt forgrening, som visualisert ved brightfield mikroskopi på dag 1 og 2. Skalere barer = 100 µm. (C) Ins1-eGFP mus pancreatoids på dag 4, dag 5, dag 6, dag 7 og dag 9, med utviklingen av beta-cellene angitt av eGFP i grønt. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Immunostaining av pancreatoids. (A) immunostai-pancreatoid på dag 5 merke kanaler av DBA i rødt, endokrine celler av Chga i grønt og kjerner preget av DAPI i blått. (B) immunostai-pancreatoid på dag 7 merke mesenchyme av Vimentin i rød og bukspyttkjertelen progenitors av Pdx1 i grønt. (B) immunostai-pancreatoid på dag 7 merke cellene av Insulin i rødt og bukspyttkjertelen progenitors av Pdx1 i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Transkripsjon analyse. Kvantitativ PCR av dag 7 pancreatoids for markører progenitors og unike celler. Sammenligning i vivo murine vev vises i Scavuzzo et al. (2017). resultatene blir normalisert til Gapdh. N = 2, skala barer er SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Komponent Forkortelse Siste konsentrasjon
Penicillin-Streptomycin P/S 1%
FBS-frie medier supplement 10%
Beta-Mercaptoethanol bME 0,1 mM
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate PMA 16 nM
Y-27632 eller ROCK hemmer RI 10 uM
Epidermal vekstfaktor EGF 25 ng/mL
R-Spondin1 - 500 ng/mL
Sure Fibroblast vekstfaktor, Fibroblast vekst faktor 1 aFGF, FGF1 25 ug/mL
Heparin natrium salt Heparin 2 U/mL
Fibroblast vekstfaktor 10 FGF10 100 ng/mL
Dulbeccos endret Eagle Medium/næringsstoff blanding F-12 DMEM/F12 til 5 mL

Tabell 1. Organogenesen medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utviklingen av celle kultur modeller er avgjørende for riktig modell utvikling, produsere klinisk relevante celletyper, test narkotika effekt eller selv transplantasjon pasienter. Men kunstig recapitulating utvikling i en rett er utfordrende som vi er fortsatt langt fra forstå mekanismene av organogenesen og fysiologi i vivo. Dermed er i vitro celler ineffektivt generert, ikke fullt funksjonell, kan ikke opprettholdes i lange perioder eller havn andre avvik fra sammenlignbare cellene i kroppen. Dette er fordi mange forskjellige celletyper samhandle mens komplekse Morfogenetiske gjerdet for å påvirke utviklingen og fysiologi. Få en forståelse av hvordan utviklingen fortsetter ved å kombinere fordelene av in vitro ville systemer samtidig beholde kompleksiteten i vivo utvikling formidle et verdifullt verktøy for biomedisinsk forskning.

Utviklingen av organoids er en lovende avenue mot modellering kompleksiteten i utvikling. I denne protokollen skissere vi hvordan lage bukspyttkjertelen organoids, kalt pancreatoids, som beholder opprinnelig mesenchyme og robust generere endokrine celler, men pancreatoids ikke viser glukose respons. Dette verktøyet kan brukes til å undersøke mekanismer for utviklingen samt funksjonalitet i en kultur som opprettholder heterogenitet av vev i vivo. Videre, dette kan brukes for genetisk skjermer eller skjermen små molekyler eller narkotika. Dette er spesielt interessant, som testing kandidat narkotika i relativt homogene celle kultur systemer kan omgå effekten av disse forbindelsene på andre nært beslektede celletyper.

Det er flere viktige trinn under denne protokollen. Først forsiktig fjerning av embryoer fra livmoren er viktig som trekke embryoene ut kraftig kan rippe mageregionen og gjøre det vanskelig å skjelne fordøyelsessystemet for å få bukspyttkjertelen bud (trinn 1.3). Andre, ren Disseksjon av bukspyttkjertelen bud fra fordøyelsessystemet er kritisk, som tar overflødig vev kan føre til differensiering av andre celletyper (trinn 1.4.4). Dette er det viktig å knipe under bukspyttkjertelen bud og løfte overliggende vevet før isolere bukspyttkjertelen bud. Til slutt, når du flytter knopper fra dispase tilbake i PBS å vaske, er det viktig å bruke en borosilicate kapillær rør og ikke la vevet touch kanten av rør åpningen, ellers vevet vil holde seg til spissen av røret (trinn 1.5.1). For å unngå dette, kan du begynne munnen pipettering løsning før går mot bud, slik at bud å gå inn i røret ikke på utsiden.

Denne metoden tillater dannelse av endokrine celler i en 3D pancreatoid, men den epithelial forgrening er mer begrenset enn andre eksisterende protokoller16,17. Videre, mens insulin-produserende endokrine celler form, de ikke viser glukose respons. Derfor vil videre etterforskning modning av disse cellene gi verdifull informasjon både i generasjon av funksjonelle pancreatoids samt innen beta generasjon generelt.

Generering av pancreatoids utvikler endokrine celler, og i fremtiden, som få glukose respons, har potensielle konsekvenser for behandling av diabetes. Diabetes er en førsteklasses kandidat for regenerativ therapy, bukspyttkjertelen beta-cellene er tapt eller dysfunksjonelle og erstatte disse cellene kan potensielt lindre sykdom komplikasjoner. Fremgang har blitt gjort i skille hPSCs i beta celler, men i diabetes, er det ofte dysfunksjoner til andre celletyper i bukspyttkjertelen sammen med beta-cellene, inkludert alfa celler eller acinar celler28,29, 30,31,32. Dermed kan generere nye bukspyttkjertelen vev for transplantasjon fullt ut erstatte rammet vevet. Med ekstra etterforskningen av murine pancreatoid formasjon og fungerer, kan utviklingsmessige banen bli etterlignet for å generere menneskelige pancreatoids av hPSCs. Disse menneskelige pancreatoids kan brukes for personlig medisin til skjermen for respons til narkotika i pasient-spesifikke sammenheng og regenerativ therapy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jolanta Chmielowiec for nyttig diskusjon om protokollen og manuskriptet. Vi takker også Benjamin Arenkiel for tilgang til AC confocal mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH (P30-DK079638 til MB) og T32HL092332-13 M.O.H. og MB McNair medisinsk grunnlaget (for MB) og AC confocal kjernen BCM intellektuelle og utviklingsmål funksjonshemminger Research Center (NIH U54 HD083092 fra Eunice Kennedy Shriver nasjonale Institutt for Child Health and Human Development).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi problemet 136 bukspyttkjertelen Organoids Beta-cellene utvikling Mesenchyme differensiering Diabetes 3D kultur Pancreatoids
Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., More

Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter