Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...
Abstract
הלבלב הוא שאיבר מורכב מורכב רבים לסוגי תאים שונים לעבוד יחד כדי לווסת הומאוסטזיס הגלוקוז הדם והעיכול. סוגי תאים אלה כוללים מפריש אנזימים תאים acinar, מערכת ductal arborized אחראי להובלה של אנזימי התאים האנדוקריניים במעיים, הורמונים.
בטא-תאים אנדוקריני הם סוג התא היחיד בגוף המייצרים אינסולין כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם. סוכרת, מחלה המאופיינת על ידי לאובדן או את תפקוד תאי בטא-מגיע לממדים של מגיפה. לכן חיוני להקים פרוטוקולים כדי לחקור את התפתחות תאי בטא יכול לשמש לסינון למטרות להפיק את התרופה ואת מבוססת תא הרפוי. בעוד חקירה ניסויית של פיתוח העכבר הוא חיוני, אין ויוו מחקרים הם מפרך ולגזול. תאים בתרבית מספקים פלטפורמה נוחה יותר להקרנה; עם זאת, הם אינם מסוגלים לשמור על גיוון הסלולר, ארגון אדריכלי, אינטראקציות סלולרי נמצאו ויוו. לכן חיוני לפתח כלים חדשים לחקור organogenesis הלבלב ופיזיולוגיה.
תאים אפיתל הלבלב לפתח בשיתוף הדוק עם מזנכימה מראשית organogenesis תאים לארגן, להבדיל לתוך האיבר למבוגרים מורכבות, כשיר מבחינה פיזיולוגית. הלבלב מזנכימה מספק אותות חשוב לפיתוח האנדוקרינית, שרבים מהם אינם מובנים היטב, ולכן קשה לסכם במהלך התרבות במבחנה . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול organoids תלת מימדי, תאי עכבר מורכבים תרבות לשמור מזנכימה, הנקרא pancreatoids. ניצן הלבלב מאתר e10.5 גזור, חלופה מועדפת, תרבותי בסביבה נטולת לגרדום. אלו צפים תאים בעצמם עם מזנכימה עוטף את pancreatoid המתפתח ומספר תאי הבטא האנדוקרינית לפתח את acinar, את התאים צינור חזקים. מערכת זו ניתן ללמוד את האינטראקציות תא-תא תא גורל נחישות הארגון מבניים, מורפוגנזה, במהלך organogenesis, או על סמים, מולקולה קטנה, או בדיקה גנטית.
Introduction
המופקע על מנגנוני להתפתחות תקינה של הפיזיולוגיה הוא בעל חשיבות עליונה להבין מחלה אטיולוגיה ולטפח בסופו של דבר שיטות טיפול. בעוד culturing, המבדילים תאי גזע מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ומהירה של פיתוח, הוא מוגבל על ידי הגוף קיים הידע בנושא מנגנוני ויסות גורל, באופן מלאכותי recapitulates פיתוח יחסית מדינה הומוגנית, מימדי1,2. לא רק ויוו פיתוח מושפע השפעות חיצוני, עם סוגי תאים שונים נישה, וחשש מספקת paracrine אותות ותמיכה ארגונית כדי להנחות organogenesis, אלא הפונקציה של תאים אלה מסתמך גם על שלהם הסביבה עבור הדרכה3,4,5. לאור החשיבות של אלה סימנים חיצוניים, המגבלות של בידול פרוטוקולים, מהות מפרך ויוו העכבר מודלים, מערכות חדשות נדרשים לחקור השפעול של תהליכים התפתחותיים בסיסיים ופיזיולוגיה.
הופעתה של פרוטוקולים ליצירת תלת מימדי, מורכבים organoids מספק מערכת קונגרואנטי ונוח ללמוד organogenesis, פיזיולוגיה, יעילות התרופה ו פתוגנזה אפילו. הקמת organoids מאתר עבור מערכות שונות כגון הקיבה6 ו המעי7 הרחיבו את ההבנה שלנו של organogenesis, מתן כלי ללמוד המורכבות התפתחותית עם מגבלות מועטות יותר מאשר ויוו ומודלים במבחנה . עקב ההתפתחויות הללו בתוך תא צורב מאתר היווצרות, כניסתו של אדם pluripotent גזע תאים אנושיים מעיים8, רשתית9, כליות10,11, מוחי12 organoids הופקו, ואת זה רפרטואר מוגבל רק על-ידי הידע הקיים לגבי מנגנוני התפתחות.
עניין מיוחד הוא הדור של הלבלב organoids, כמו מספר עצום של מחלות המכות סוגי התאים בלבלב, כולל תאים acinar וצינורות אי ספיקה הלבלב אקסוקרינית13, acinar תאי לבלב14ו תאי ביתא סוכרת15. רכישת ידע לגבי הפיתוח של סוגי התאים הללו יכול לסייע להבנת הפתולוגיה שלהם, גם, משמשים כפלטפורמה אישית והתרופות הקרנה או השתלת. בעבר, Greggio. ואח פיתח שיטה ליצירת organoids הלבלב מאתר זה מסכם את הדברים ויוו מורפוגנזה ולפתח מבנים מאורגנים, תלת מימדי, מתחם המורכב וכל השברים תא אפיתל הלבלב סוגי16,17. זהו צעד חשוב בשטח הלבלב, במיוחד כמו עשיית תאים במבחנה ניתן לאפשר חקירה הביולוגי של התפתחות תאי בטא. עם זאת, המחסור תאים אנדוקריני שהוקמה ב פרוטוקול זה אלא אם כן organoids היו מושתלים לתוך רקמות, איפה הנישה יכול אינטראקציה ולספק רמזים הדרכה17. מזנכימה מהווה את החלק הגדול ביותר של הגומחה, בכבדות כעוטפת האפיתל מתפתח מן בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי בשלבים מאוחרים יותר, כולל delamination האנדוקרינית ובידול3,4, 18. האינטראקציה של מזנכימה הקל המתפתח עדיין דוגמה נוספת של איתות חיצוני ואת החשיבות של שמירה על ויוו המורכבות הסלולר ללמוד organogenesis.
כאן, אנו נתאר כיצד לייצר organoids הלבלב תלת מימדי, הנקרא pancreatoids, מ e10.5 הפומבית מאתר אבות הלבלב. Pancreatoids אלה שומרים על מזנכימה מקורית, בעצמם בתנאים לתרשים ולהפיק כל סוגי תאי הלבלב העיקריים, כולל מספר חזקים של תאי הבטא האנדוקרינית19. גישה זו היא המתאימה ביותר עבור הניתוח של פיתוח האנדוקרינית, כמו פרוטוקולים הקודמים חוסר בידול האנדוקרינית חזקים. עם זאת, המשתמשים בפרוטוקול עבור organoids הלבלב כפי שתואר על ידי Greggio et al. מתאים יותר לניתוח של הסתעפות אפיתל הלבלב, מורפוגנזה, בתור הסתעפות יותר מוגבל ב- pancreatoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים בשיטה זו אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ביילור לרפואה.
1. הכנת העכבר מתחלקים היום 10.5 אבות הלבלב
הערה: פרוטוקול זה לא צריך להיות בעקבות בתנאים סטריליים עד שלב 2, אולם זה אופטימלי לחטא כלי ניתוח, לרסס עם אתנול 70% לפני השימוש.
- כדי להגדיר עבור ניתוח, למלא דלי קרח ומניחים מכולה של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) בתוך הקרח. נקה שני שקצהו בסדר. מלקחיים ומספריים הקרע עם 70% אתנול. מיכל עם פחות שלושה בורוסיליקט נימי שוכן בסמוך לאזור לנתיחה, צינורות, על פיפטה בפה, מצית, ומסונן 1,000 טיפים פיפטה µL.
- להכין לפחות 1 מ"ל של 1.25 מ"ג/מ"ל dispase קר סטיריליים למהול במים ולשתות, מקום הבאר השנייה של צלחת טוב 12 על קרח. להכניס PBS הראשונה, השלישית, הרביעית בארות 12 טוב צלחת. מקום 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב mL 1.5 צינור על קרח. לחמם של חממה חזק כדי 37 oC.
- המתת חסד e10.5 עכברים בהריון-מתוזמן בהתאם להנחיות IACUC. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור לפני ביצוע בצורת V חתך באזור איברי המין של העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים ולהמשיך אותו עד הסרעפת.
הערה: הופעת פקק בנרתיק בתוך פרוטוקול זה מציינת היום 0.5. באמצעות 5 - 6 בת עכברים, עלייה במשקל של יותר מ 2 g פועלת כאמצעי משני של הספגה מוצלחת.- בזהירות לסלק את הרחם על ידי ביצוע חתך על החלקים לרוחב מעייניו של הרחם, מושך את האיבר כלפי מעלה מן העכבר, ובעקבות החתך עד באזור איבר המין לפני חוזר בצד הנגדי. מקום זה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר.
הערה: זה אפשרי להשיג organoids של תאים e11.5 הפומבית, אולם בניגוד pancreatoids e10.5, organoids אלה עדיין לא מאופיינים ובכך עשויים לא לשמור את היכולת להבדיל לתוך כל שלוש שושלות הלבלב הגדולות.
- בזהירות לסלק את הרחם על ידי ביצוע חתך על החלקים לרוחב מעייניו של הרחם, מושך את האיבר כלפי מעלה מן העכבר, ובעקבות החתך עד באזור איבר המין לפני חוזר בצד הנגדי. מקום זה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר.
- תחת מיקרוסקופ אור לנתיחה, מניחים על צלחת פטרי ופתח בזהירות את רקמת הרחם על ידי הצבת שני מלקחיים בין כל העובר קילוף רקמות מן שק החלמון. העברת העוברים על ידי האוחז שק החלמון בעדינות עם מלקחיים, במקום 10 ס מ פטרי טריים PBS קר. מניחים על צלחת פטרי על קרח.
הערה: חשוב heedfully להסיר את העוברים, רצוי ויתוחזקו שק החלמון, כמו הסרת כוחני יכול למשוך את חבל הטבור, לקרוע טישו של העובר ולחשוף את השלמות. המבנית. - במקום מספר PBS טיפות על מכסה פטרי 10 ס מ. להשתמש אלה טיפות להעביר את העובר במהלך ניתוח כמו רקמות extraembryonic יוסרו כדי להבטיח ניראות. להעביר את העובר טיפה PBS ולהסיר בעדינות שק החלמון באמצעות מלקחיים, בעוד העוברים הנותרים נשאר PBS על קרח (איור 1א'). הסר את הראש לפני העברת העובר טיפה PBS חדש באמצעות מלקחיים להגיש בקלות ראש העובר, לא נזק לרקמת (איור 1B).
הערה: הרקמה ייתכן שתצטרך להעביר בתדירות גבוהה יותר טיפות PBS צח מזו המתוארת כאן, בהתאם לאטימות של הנוזל.- בטיפה PBS חדשים, להסיר בלוטות forelimb באמצעות מלקחיים (איור 1B). להכניס מלקחיים בתוך הפתח שבו האיבר באד היה נוכח ונפרק בעדינות רק הרקמה החיצוני ביותר anteriorly (איור 1B). סיבוב העובר וחזור לכיוון אחורי, ועוצרים ניצן hindlimb. בשלב זה, מערכת העיכול צריך להיות גלוי (איור 1B).
- האזור האחורי של מערכת העיכול יש עיקול קטן (איור 1F). הכנס מלקחיים מאחורי העיקול הזה הפתח בין האזור בעמוד השדרה של קיר הגוף של מערכת העיכול. ניתוק של מערכת העיכול, עובד לאט כלפי מעלה עד האזור הקדמי ביותר איפה אזור הלב מתחבר (איור 1B-E).
אופציונלי: להסיר את הלב הקדמוני ניצנים כבד מהאזורים הגחון של מערכת העיכול, להשאיר רק את הצינור בטן רציף. בפעמים הראשונות פרוטוקול זה מבוצע שיהיה קל יותר לעזוב את הלב והכבד כמו ציוני הגחון עד המורפולוגיה של מערכת העיכול ואת ניצן הלבלב הגבי הם יותר מוכר (איור 1C ו- D ). - העברה של מערכת העיכול ה-droplet PBS טריים.
- לקחת מלקחיים בעדינות לצבוט את הרקמה מתחת באיבו בולטות המעי, להרים מעט את הרקמה החיצונית את (איור 1D-F).
הערה: ניצן הלבלב הגבי ממוקם בין הקיבה והמעי (איור 1C-G). ניצן הלבלב מתחת צריך להיראות כמו מבנה עגול, הכפתוריים (איור 1G). - במקום מלקחיים איפה הניצן מתחבר המעי, קמצוץ כלפי מעלה כדי לשחרר את הניצן (איור 1G). רחץ פעם אחת בתוך בועה PBS חדש לפני העברת הניצן לתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12 ב- PBS קר על קרח. חזור עד ניצנים כל שנאסף עוברי והניח בתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12.
- המקום ה-12 מגישים גם במיקרוסקופ אור לנתיחה. לספור את מספר בלוטות הלבלב בהצלחה גזור מאוחר יותר לחשב את יחס פיצול.
- המקום מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה לתוך פיפטה בפה עם צינור קפילרי מצורף. להבה לעקר את צינור קפילרי וליצור עיקול בצינור כדי להקל על השימוש. להשתמש את נימי כדי להעביר ניצנים הפתרון השני dispase קר טוב המכיל למשך 2 דקות לפני העברת הבאר השלישית תסיים נקי (איור 1G).
הערה: בעת העברת ניצנים dispase PBS, להימנע מלגעת הרקמה עד הקצה של הצינור נימי. אם הרקמה נתקע על קצה הצינור, פיפטה למעלה ולמטה או לנער בפתרון PBS נקי עד השתחררו. - פיפטה ניצנים למעלה ולמטה, ולהעביר אל הבאר הרביעית עם PBS נקי. לבסוף, באמצעות העברת המכשיר נימי ניצנים כדי ברכבת התחתית 1.5 mL עם 0.05% טריפסין. למקם את הצינור שייקר 37 oC מראש ומחוממת ומנערים במהירות של 1,500 סל ד במשך 4 דקות.
- מערבולת במשך כ 10 s ואז מיד למקם את הצינור צנטריפוגה ספין בשביל 5 דקות ב- 200 g. להסיר את הכל אלא כ 50 µL של פתרון בזהירות כדי לא להפריע את התאים centrifuged (איור 1G).
- המקום מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה לתוך פיפטה בפה עם צינור קפילרי מצורף. להבה לעקר את צינור קפילרי וליצור עיקול בצינור כדי להקל על השימוש. להשתמש את נימי כדי להעביר ניצנים הפתרון השני dispase קר טוב המכיל למשך 2 דקות לפני העברת הבאר השלישית תסיים נקי (איור 1G).
2. חלופה מועדפת אבות כדי ליצור Pancreatoids culturing
הערה: הבאות צריכה להתבצע באווירה סטרילית בשכונה תרביות רקמה רגיל, באמצעות הליכים סטנדרטיים סטרילי.
- עבור כל ניצן אסף, להוסיף 400 µL organogenesis מדיה16,17 (טבלה 1) התאים centrifuged. דופק מערבולת שלוש פעמים, µL צלחת 100 לכל טוב של קובץ מצורף נמוך 96 טוב צלחת, פיצול ניצנים ביחס של 1:4 (איור 1G).
- בדוק תחת המיקרוסקופ לדמיין חלופה מועדפת תאים באופן חופשי צף (איור 1H). מקם את המנה תרבות חממה 37 oC עם 5% CO2 על כיסא נדנדה במהירות בינונית.
- עקוב אחר ההתקדמות של pancreatoids מדי יום. להחליף 100 µL של מדיה טריים כל 3 ימים, מדיה pipetting בקפידה תחת בקרה מיקרוסקופית בשכונה כדי להסיר תוך השארת pancreatoid הבאר. לחלופין, טרי 100 µL של התקשורת ניתן להוסיף באר חדשה ו pancreatoid מועברים באמצעות בורוסיליקט קפילר המצורפת פיפטה בפה, 1000 µL מסונן פיפטה עצה.
3. עיבוד Pancreatoids עבור הדמיה Immunofluorescent
- כדי לעבד pancreatoids לתמונות immunofluorescent, יש להכין תחילה 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) פתרון. במקום 50 µL של 4% PFA בבארות של 96 ובכן צלחת.
- באמצעות צינורות קפילר בורוסיליקט פיפטה בפה עם קצה פיפטה המסוננות 1,000 µL, להעביר pancreatoids בינוני תרבות לוקח מדיה קטנה ככל האפשר לתוך הבאר טריים עם 4% מחברים. ממוקם על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- להעביר pancreatoids מ- 4% PFA לבאר עם µL 100 ל- PBS טריים, רוק בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דק חוזר עבור סכום של שלושה שוטף PBS טריים.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן, עם pancreatoids המאוחסן µL 100 ל- PBS ב 4 oC עד לשבוע אחד.
- עבור הדמיה wholemount (מומלץ אם הם מתאימים, חלופית הגישה בסעיף 3.3. ואת מיקרוסקופ ב- 3.4.), להעביר מהערוץ סרום חמור 5% µL 50 ב- PBS 1 x עם חומר ניקוי nonionic 0.1% (PBST) כדי לחסום. סלע בן לילה בבית 4 oC או לחילופין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
- להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים העיקרי מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. הסלע בצורה אופטימלית, 24 שעות בבית 4 oC (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
הערה: נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים נגד Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), Pdx1 (1: 100) מתאימים wholemount מכתימה; נוגדנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. - העברת pancreatoids לבאר, המכיל 100 µL של PBST טריים לשטוף את סלע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף PBST טריים.
- להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים משניים מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. להגן על הבסיס מפני האור ולמקם 4 oC, נדנדה עבור בצורה אופטימלית 24 שעות (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
הערה: כל נוגדנים משניים המופיעים counterstain גרעיני הטבלה של חומרים , דאפי מתאימים wholemount מכתים. - להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה 100 µL 1 x PBST ורוק בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות חוזר עבור סכום של שלושה שוטף 1 x PBST. בכביסה השלישי והאחרון, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
- לבסוף, למקם את µL 100 של PBS ונקייה בחנות 4 oC מוגן מפני אור במשך שבוע לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, למרות התוצאות הטובות ביותר של הדמיה מיד לאחר מכתים. כדי למנוע תנועה של pancreatoids במהלך דימות אך למנוע ייבוש, למקם את כל pancreatoid droplet 20 µL ל- PBS. אם pancreatoids אינם נשארים עדיין, להפחית את נפח PBS.
- להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים העיקרי מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. הסלע בצורה אופטימלית, 24 שעות בבית 4 oC (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
- עבור מקטעים קפוא, להעביר pancreatoids מהערוץ בתוך 30% תמיסת סוכרוז למשך הלילה בבית 4 oC.
- הוסף מדיה ההטבעה בבועה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים תחת בקרה מיקרוסקופית, משרים pancreatoids בדחיפה בעדינות דרך התקשורת ההטבעה מספר פעמים כדי להסיר שאריות סוכרוז לפני העברת גוש רקמה עם מדיה ההטבעה קפוא.
- מניחים את רקמת בלוק על קרח יבש עד קפואים והמקטע על cryostat ב 8 מיקרומטר.
הערה: סעיפים שניתן לאחסן ב-80 oC או immunostained מיד. - מאפשר מקטעים מ-80 oC להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד יבש. לצייר מחסום הידרופובי באמצעות העט pap הידרופובי סביב הרקמה ולחסום את השימוש סרום חמור 5% בדילול 1 x PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להסיר מדיה ולהחליף מיד עם נוגדנים העיקרי מדולל 5% חמור בסרום מדולל ב- x 1 PBST לילה בבית 4 oC.
- הסר את הפתרון העיקרי ולשטוף רקמות שלוש פעמים עם 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בעקבות זאת, הוספת נוגדנים משניים פתרון מדולל בנסיוב חמור 5% בדילול 1 x PBST לשעה בטמפרטורת החדר להגן על שקופיות מפני אור.
- הסר את הפתרון המשני ולשטוף שקופיות שלוש פעמים ב 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בכביסה הסופי, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
- להסיר מדיה ולהוסיף מדיה הרכבה של coverslip. חנות שקופיות מן האור 4 oC עד מוכן תמונה.
4. בידוד של RNA מ Pancreatoids לניתוח התעתיק
- לאסוף את pancreatoids באמצעות נימי בורוסיליקט המצורפת פיפטה בפה עם מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה בשביל בעקרות ומקום לתוך µL 500 של חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון צינור 1.5 מ. ב-80 oC או פנה/י מיד לבידוד RNA.
- לבידוד RNA, להפשיר דוגמאות על קרח במידת הצורך, להוסיף 100 µL של כלורופורם. מערבולת טוב והמקום ב 4 oC במשך 15 דקות מראש מגניב צנטריפוגה כדי 4 oC.
- מניחים צינורות לתוך צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב g 12,000 בבית 4 oC.
- הסר בזהירות את צינורות כדי לא להפריע ההפרדה של שכבות. באמצעות פיפטה 200 µL, לאסוף את הפתרון ברור מימית ולמקם לתוך צינור 1.5 mL החדש, משאיר מאחור כמות קטנה אל מאגר חלבון לבן שכבה, שכבת ה-DNA ורוד. לא לגעת בקצה פיפטה לכל דבר בתהליך זה, אל תיגע דפנות הצינור 1.5 mL.
- להוסיף 500 µL של 100% אלכוהול איזופרופיל הצינור החדש המכילות את שכבה מימית ואת מערבולת. בסדר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עוד על הקרח, או עבור מרבית המשקעים להשאיר למשך הלילה ב-20 oC.
- צנטריפוגה ב 12,000 g למשך 15 דקות בבית 4 oC כדי הצניפה את הרנ א. הסר את אלכוהול איזופרופיל מבלי להפריע בגדר.
הערה: כמו pancreatoids הם קטנים, סביר שבגדר לא יהיו גלויים. - הוסף קר, 75% אתנול, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. מקום בצנטריפוגה, ספין ב 9,000 g x 10 דקות בבית 4 oC. הסר את אתנול וביו -ספין למשך 2 דקות ב 9,000 x g.
- להשתמש על פיפטה 200 µL כדי להסיר כל אתנול שנותרו בצינור, ללא פנייה אל האזור שבגדר שוכן. להשאיר את הכיפה פתוח על המסך למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח אידוי של אתנול שיורית.
- Resuspend צנפה על ידי vortexing ב 20 µL של מים נקיים, ללא נוקלאז.
אופציונלי: חום הרנ א-65 oC למשך 3 דקות ומיד להחזיר הקרח. RNA יכול להיות מאוחסן ב-80 oC או השתמשו מיד שעתוק במהופך, qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח זהיר של העכבר עוברי-e10.5 מן הקרן הרחם אמור להניב העוברים תקינים ב- PBS עבור ניתוח נוסף (איור 1א'). מערכת העיכול ניתן להסיר ביעילות של העובר (איור 1B), המתיר הבחנה של ניצן הלבלב הגבי בצומת של המעי, הקיבה (איור 1C-F). ניצן הלבלב e10.5 בעבר מאפיין; אבות צריך לבטא Pdx1, Sox9, Ptf1a, ו Hes120,21,22,23. בעקבות שלבי עיבוד של רקמות, חלופה מועדפת את הלבלב תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים, ניתן לאבחן על ידי מיקרוסקופ אור (איור 1G-H).
בתקשורת organogenesis, תאים אלה לתרשים, לגרדום ללא בעצמם ולארגן לתוך pancreatoids תלת מימדי לגדול, להימשך לפחות עשרה ימים בתרבות (איור 2א). Pancreatoids יש קווי דמיון מורפולוגי ויוו הלבלב, עם התרחשות מורפוגנזה מסעף. באמצעות העכברים הטרנסגניים, לסוגי תאים שונים או תהליכים ניתן לנטר בזמן אמת. לדוגמה, שימוש Ins1-eGFP24 בעכברים כדי לסמן את היווצרות תאי הבטא האנדוקרינית, pancreatoids יכול לדימות בחיי היומיום כדי להמחיש את התפתחות תאי בטא (איור 2B). עוד יותר, על ידי שינוי תרבות תנאים, הוספת מולקולות קטנות, סמים או מניפולציה הגנום, לא רק יכול להידרש קביעת גורל התא אלא יכול גם שינויים במבנה מורפולוגיה ייחקרו. הנה אנחנו מראים את היישום של חלבון קינאז C activator phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) בריכוזים גבוהים (160 nM), אשר משנה את המורפולוגיה של פיתוח pancreatoids, שמוביל באופן רופף משויכות בתאי אפיתל והגדילה מסעף 19 (איור 2C).
כדי להעריך את השיוך של רקמת הלבלב מזנכימה בתאי אפיתל הלבלב, immunostaining יכול להתבצע עבור סמנים של כל רקמות. Immunostaining של צינור סמן, DBA25,26, עם סמן האנדוקרינית, Chga27גרעינים מסומן על ידי דאפי חושפים-צורה מרובת השושלת pancreatoids (איור 3א). סמן מזנכימה, Vimentin, מוכתם שיתוף סמן קדמון הלבלב (מ e9.0 ל e15.5 כ) Pdx1, מציג מזנכימה עוטפת את pancreatoid (איור 3ב). Immunostaining יכול לשמש גם כדי לבחון מורפולוגיה, עם מבנים מסעף חושפניים Pdx1, כמו גם סמנים שונים של סוגי תאים עניין. איור 3C, עלינו לדמיין את תאי בטא פיתוח על ידי צביעת עבור דה מרקר אפיתל Pdx1 ו- the marker תאי בטא מהווה שימוש qPCR ניתוח, תעתיקים של אבות המבדילים תאים להיות מוערך, כגון גנים קדמון Pdx1 , Hes1, הבדיל סמנים Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, ו- Ins1 (איור 4).
איור 1: חלוקה של דיסקציה, דיסוציאציה, ציפוי של אבות הלבלב e10.5 לדור pancreatoid. (א) התמונה brightfield של העובר e10.5. (B) שתתמודדו נוהל לנתיחה, מתחיל בפינה השמאלית העליונה. האדום, קווים מקווקווים מציינים אזורים כדי לגזור, אמנם האזור הירוק מערכת העיכול. ראשית, אלה. הראש נערף שהופעלו על-ידי הסרת בלוטות forelimb הפתיחה של הצד של האורגניזם. (ג) מערכת העיכול בקפידה מוסר, עם ניצנים הלב והכבד בולטות מן האזור הגחון של דרכי. הבטן הגבי באד הלבלב, המעי, ניתן לאבחן, כפי שמוצג בתמונה brightfield. (ד) הסרה של ניצנים הכבד והלב. מפרטים טכניים נמצא בצד השמאל והוא brightfield התמונה בצד הימין. (ה) Pinching של הרקמה סביב ניצן הלבלב הגבי לחשוף את הניצן עבור ניתוח. מפרטים טכניים נמצא בצד השמאל והוא brightfield התמונה בצד הימין. (F) של מערכת העיכול עם ניצן הלבלב הגבי תחת מיקרוסקופ brightfield. בתמונה משמאל, העיקול במעי הוא גלוי, שבו מלקחיים להנחה בעת ניתוק של מערכת העיכול מן האזור בעמוד השדרה. בצד הימין, התמונה בהגדלה brightfield מציגה שני הגבי ו הגחון הלבלב ניצנים. (G) הסרה של באד הלבלב הגבי, עיבוד של רקמות לפני דיסוציאציה, resuspension בתקשורת organogenesis, ואת ציפוי. (ח) התמונה brightfield מציג חלופה מועדפת תאים מיד לאחר ציפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ניטור pancreatoids לאורך זמן. (א) Brightfield תמונות של pancreatoids-יום ראשון, יום שני ויום 3. גודל ברים = 100 אום. (B) מניפולציה של תרבות תנאים לחקור מורפוגנזה הלבלב. . הנה, התוספת של רמות גבוהות של PMA מוביל התיר מבנה אפיתל מסעף מוגברת, כפי דמיינו ידי מיקרוסקופ brightfield ביום 1 ו- 2. גודל ברים = 100 מיקרומטר. (ג) Ins1-eGFP העכבר pancreatoids-יום ד', יום 5, יום 6, יום 7 והיום 9, עם התפתחות תאי הבטא שצוין על-ידי eGFP בירוק. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Immunostaining של pancreatoids. Pancreatoid Immunostaining (א) ביום 5 כדי לסמן צינוריות מאת DBA תאים אדומים, האנדוקרינית מאת Chga ירוק, גרעין האטום מאת דאפי. בצבע כחול. Pancreatoid Immunostaining (B) -יום 7 כדי לסמן מזנכימה מאת Vimentin באבות אדום ואת הלבלב על ידי Pdx1 בירוק. Pancreatoid Immunostaining (B) -יום 7 כדי לסמן תאי ביתא על ידי אינסולין הלבלב ואדום אבות על-ידי Pdx1 בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ניתוח התמליל. PCR כמותי של יום 7 pancreatoids עבור סמנים של אבות המבדילים תאים. השוואה ויוו רקמת מאתר מוצג Scavuzzo. et al. (2017). תוצאות הם מנורמל ל Gapdh. N = 2, סולם והברים נמצאים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | קיצור | ריכוז סופי |
| פניצילין-סטרפטומיצין | P/S | 1% |
| מדיה FBS ללא תוספת | 10% | |
| בטא-Mercaptoethanol | bME | 0.1 מ מ |
| Phorbol 12-פעילים 13-אצטט... | ובחום | 16 nM |
| מעכבי Y-27632 או רוק | רי | 10. |
| גורם הגדילה באפידרמיס | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| גורם הצמיחה פיברובלסט חומצי, פיברובלסט גורם גידול 1 | aFGF, FGF1 | ug 25/mL |
| הפארין נתרן מלח | הפארין | 2 U/mL |
| פיברובלסט גורם גידול 10 | FGF10 | 100 ננוגרם למ"ל |
| של Dulbecco ששינה נשר בינוני/מזין תערובת F-12 | DMEM/F12 | 5 מ |
טבלה 1. Organogenesis מדיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתקדמות של מודלים התרבות התא חיוני כראוי מודל פיתוח, לייצר סוגי תאים הרלוונטית קלינית, בדיקת תרופות יעילות או אפילו להשתלת לחולים. עם זאת, באופן מלאכותי recapitulating פיתוח בקערה הוא מאתגר כמו שאנחנו עדיין רחוק מלהיות הבנת המנגנונים של organogenesis, פיזיולוגיה ויוו. כך הם במבחנה התאים שנוצר באופן לא יעיל, לא מתפקדת במלואה, מצליח להישמר במשך פרקי זמן ארוכים, או הנמל מומים אחרים מתאי דומה בגוף. זה בגלל סוגי תאים שונים רבים אינטראקציה בזמן מתרחשים שינויים morphogenetic מורכבים כדי להשפיע על התפתחות ופיזיולוגיה. תוך השגת הבנה של במהלכי הפיתוח על ידי שילוב של הנוחות של במבחנה מערכות תוך שמירה על המורכבות של פיתוח ויוו להקנות כלי רב ערך עבור המחקר הביו-רפואי.
הפיתוח של organoids היא שדרה מבטיח לקראת מידול המורכבות של פיתוח. ב פרוטוקול זה, אנחנו המתאר כיצד להפוך organoids הלבלב, הנקרא pancreatoids, אשר שומרים על מזנכימה יליד robustly לייצר תאים אנדוקריני, אף על פי pancreatoids לא להפגין יכולת התגובה של גלוקוז. כלי זה יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים של התפתחות, כמו גם פונקציונליות במערכת התרבות המתחזק את הטרוגניות של רקמות נמצאו vivo. יתר על כן, ניתן להשתמש עבור מסכי גנטי או מסך מולקולות קטנות או סמים. זהו מעניין במיוחד, כמו תרופות ובדיקות במערכות תרבות תא הומוגנית יחסית עשוי לעקוף את ההשפעות של תרכובות אלו על סוגי תאים קרובים אחרים.
ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך פרוטוקול זה. ראשית, הסרת זהיר העוברים מן הרחם הוא חשוב כמו למשוך את העוברים החוצה בכוח יכול לקרוע את אזור הבטן ולהפוך אותו קשה להבחין על מערכת העיכול כדי להשיג את באד הלבלב (שלב 1.3). ניתוח השני, לנקות באד הלבלב מערכת העיכול הוא קריטי, כמו לקיחת רקמות עודף עלול להוביל הבידול של סוגי תאים אחרים (שלב 1.4.4). לשם כך, חשוב לצבוט מתחת באיבו הלבלב ולהרים את הרקמה בשכבת-על לפני לבודד את ניצן הלבלב. לבסוף, כאשר חוזרת ניצנים מ dispase PBS לשטוף, זה הכרחי כדי להשתמש צינור קפילרי בורוסיליקט וכדי לא לתת את הרקמה לגעת בקצה של פתיחת צינור, אחרת, הרקמה תישאר עד הקצה של הצינור (שלב 1.5.1). כדי למנוע זאת, להתחיל פתרון pipetting הפה לפני נע לכיוון הניצן, המאפשר את ניצן ללכת לתוך הצינור, ולא מבחוץ.
שיטה זו מאפשרת היווצרות של תאים pancreatoid תלת-ממד, אולם, ולהתוות אפיתל היא מוגבלת יותר אחרים16,קיימים פרוטוקולים17. עוד יותר, בעוד אנדוקרינית מייצרי אינסולין בתאי טופס, הם לא להפגין גלוקוז תגובתיות. לפיכך, בהמשך בחקירה ההבשלה של תאים אלה תספק מידע רב-ערך גם בדור של pancreatoids פונקציונלי, כמו גם בתחום של תאי בטא דור באופן כללי.
הדור של pancreatoids את זה לפתח קבוצת תאים, וזה, בעתיד, לקבל גלוקוז תגובתיות, יש השלכות אפשריות לטיפול בסוכרת. סוכרת היא מועמדת לטיפול משובי, כמו בתאי בטא בלבלב שאבדו או לקוי, החלפת תאים אלה יכול באופן פוטנציאלי להקל על המחלה סיבוכים. התקדמות נעשתה הבחנה hPSCs לתוך תאי הבטא, עם זאת, סוכרת, יש לעיתים קרובות בתפקוד סוגים אחרים תאים בלבלב יחד עם תאי בטא, לרבות תאי אלפא או תאים acinar28,29, 3031,,32. לפיכך, יצירת רקמת הלבלב חדש עבור השתלת יכול לגמרי להחליף הרקמה החולה. בחקירה נוספת של pancreatoid מאתר בהיווצרותו, מסלול התפתחותי יכול להיות חיקה כדי ליצור אנושי pancreatoids מתוך hPSCs. אלה pancreatoids האנושי יכול לשמש את רפואה אישית למסך על ההיענות לתרופות בהקשר ספציפי לחולה ועל טיפול משובי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Jolanta Chmielowiec לדיון מועיל לגבי פרוטוקול ו כתב היד. אנו מודים גם בנג'מין Arenkiel לגישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (P30-DK079638 ל מ ב) ו- T32HL092332-13 M.A.S. ו מ ב מקנייר רפואי לקרן (מ ב), ליבת קונאפוקלית רוחני BCM, מרכז מחקר התפתחותיות (NIH U54 HD083092 מ יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי של הילד בריאות והתפתחות האדם).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
