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Developmental Biology

पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57599
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3,4, 1,2,3,4,5
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए इंसुलिन व्यक्त 3 डी murine pancreatoids मुक्त-फ़्लोटिंग ई 10.5 असंबद्ध अग्नाशय progenitors और एसोसिएटेड mesenchyme से उत्पंन ।

Abstract

अग्ंयाशय एक जटिल कई विभिंन प्रकार के सेल है कि एक साथ काम करने के लिए रक्त ग्लूकोज homeostasis और पाचन को विनियमित अंग बना है । इन सेल प्रकार एंजाइम स्रावित कोष्ठकी कोशिकाओं, पेट के लिए एंजाइमों की ढुलाई के लिए जिंमेदार एक arborized डक्टर प्रणाली, और हार्मोन का उत्पादन अंत में स्रावी कोशिकाओं शामिल हैं ।

अंत-स्रावी बीटा-कोशिकाओं शरीर में एकमात्र कोशिका प्रकार है कि रक्त शर्करा की मात्रा कम करने के लिए इंसुलिन का उत्पादन कर रहे हैं । मधुमेह, एक नुकसान या बीटा कोशिकाओं की शिथिलता की विशेषता रोग, महामारी अनुपात तक पहुंच रहा है । इस प्रकार, यह आवश्यक है कि बीटा सेल विकास की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए दवा और कोशिका आधारित चिकित्सकीय प्राप्त । हालांकि माउस के विकास की प्रायोगिक जांच जरूरी है, vivo में पढ़ाई श्रमसाध्य और समय लेने वाली है. कल्चरल सेल स्क्रीनिंग के लिए एक अधिक सुविधाजनक मंच प्रदान करते हैं; हालांकि, वे सेलुलर विविधता, वास्तु संगठन और सेलुलर बातचीत को बनाए रखने में असमर्थ है vivo में पाया । इस प्रकार, यह नए उपकरणों के विकास के लिए आवश्यक है अग्नाशय organogenesis और फिजियोलॉजी की जांच ।

अग्नाशय उपकला कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं को संगठित और जटिल, शारीरिक रूप से सक्षम वयस्क अंग में अंतर organogenesis की शुरुआत से mesenchyme के साथ निकट सहयोग में विकसित. अग्नाशय mesenchyme अंत में स्रावी विकास के लिए महत्वपूर्ण संकेत प्रदान करता है, जिनमें से कई अच्छी तरह से अभी तक समझ में नहीं हैं, इस प्रकार के दौरान दोहराऊंगा करने के लिए मुश्किल इन विट्रो संस्कृति. यहां, हम संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन तीन आयामी, सेलुलर जटिल माउस organoids कि mesenchyme बनाए रखने, pancreatoids । ई 10.5 murine अग्नाशय कली, असंबद्ध, और एक पाड़ मुक्त वातावरण में संस्कृति विदारक है । इन अस्थायी कोशिकाओं mesenchyme विकासशील pancreatoid और अंत में कोष्ठकी और वाहिनी कोशिकाओं के साथ विकासशील-स्रावी बीटा कोशिकाओं की एक मजबूत संख्या को घेर के साथ इकट्ठा स्व. इस प्रणाली के लिए सेल भाग्य निर्धारण, संरचनात्मक संगठन, और morphogenesis, सेल सेल बातचीत organogenesis के दौरान, या दवा, छोटे अणु, या आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

Delineating सामांय विकास और शरीर विज्ञान के तंत्र को रोग एटियलजि समझ सर्वोपरि है और अंततः उपचार विधियों की खेती । जबकि संवर्धन और अंतर स्टेम कोशिकाओं के विकास के त्वरित और उच्च प्रवाह विश्लेषण में सक्षम बनाता है, यह ज्ञान के मौजूदा शरीर सेल भाग्य विनियमन और कृत्रिम रूप से एक अपेक्षाकृत में recapitulates विकास तंत्र के बारे में द्वारा सीमित है समरूप, दो आयामी स्थिति1,2। न केवल vivo बाह्य प्रभाव से प्रभावित विकास में है, आला और organogenesis गाइड करने के लिए paracrine संकेतों और संगठनात्मक समर्थन प्रदान वातावरण में विभिंन प्रकार के सेल के साथ, लेकिन इन कोशिकाओं के समारोह में भी उनके पर निर्भर करता है मार्गदर्शन के लिए परिवेश3,4,5। इन बाहरी संकेतों के महत्व को देखते हुए, विभेदक प्रोटोकॉल की सीमाओं, और vivo माउस मॉडल में की श्रमसाध्य प्रकृति, नई प्रणालियों के लिए प्रयोगात्मक विकास प्रक्रियाओं और फिजियोलॉजी की जांच करने के लिए आवश्यक हैं ।

प्रोटोकॉल के उद्भव के लिए तीन उत्पंन आयामी, जटिल organoids एक सुविधाजनक और अनुकूल प्रणाली का अध्ययन करने के लिए organogenesis, फिजियोलॉजी, दवा प्रभावकारिता प्रदान करता है, और यहां तक कि रोगजनन। विभिंन प्रणालियों के लिए murine organoids की स्थापना जैसे पेट6 और आंत7 organogenesis की हमारी समझ का विस्तार किया है, vivo में से कम प्रतिबंधों के साथ विकासात्मक जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान और इन विट्रो मॉडल । murine organoid गठन और मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के आगमन में इन अग्रिमों के कारण, मानव आंत्र8, रेटिना9, गुर्दे10,11, और सेरेब्रल12 organoids का उत्पादन किया गया है, और इस प्रदर्शनों की अध्यक्षता केवल मौजूदा विकास के तंत्र के बारे में ज्ञान द्वारा सीमित है ।

विशेष रुचि के अग्नाशय organoids की पीढ़ी है, रोगों के असंख्य के रूप में कोष्ठकी कोशिकाओं और नलिकाओं exocrine में अग्नाशय कमी13, अग्नाशयशोथ में कोष्ठकी कोशिकाओं सहित अलग अग्नाशय कोशिका प्रकार, प्लेग14, और डायबिटीज में बीटा कोशिकाएं15. इन विभिंन प्रकार के सेल के विकास के बारे में ज्ञान प्राप्त उनकी विकृति को समझने में सहायता कर सकता है और कर सकते हैं, भी, व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग या प्रत्यारोपण के लिए एक मंच के रूप में कार्य । इससे पहले, Greggio एट अल. murine अग्नाशय organoids बनाने के लिए एक विधि विकसित की है कि vivo morphogenesis में दोहराऊंगा और संगठित, तीन आयामी, जटिल संरचनाओं सभी प्रमुख अग्नाशय उपकला कोशिका से बना विकसित 16,17प्रकार । यह अग्नाशय के क्षेत्र में एक प्रमुख कदम आगे है, विशेष रूप से इन विट्रो में कोशिकाओं बनाने बीटा सेल विकास की जैविक जांच सक्षम कर सकते हैं । हालांकि, अंत में इस प्रोटोकॉल में गठित कोशिकाओं की कमी जब तक organoids ऊतक में प्रत्यारोपित किया गया, जहां आला बातचीत और अनुदेशात्मक cues17प्रदान कर सकता है । mesenchyme आला के सबसे बड़े हिस्से का गठन किया, भारी organogenesis के प्रारंभिक दौर से विकासशील उपकला ढंकना अंत में स्रावी फाड़ना और भेदभाव3सहित बाद के चरणों के लिए,4, 18. विकासशील अग्ंयाशय के साथ mesenchyme की बातचीत अभी तक बाह्य संकेतन और organogenesis का अध्ययन करने के लिए vivo सेलुलर जटिलता में बनाए रखने के महत्व का एक और उदाहरण है ।

यहां, हम का वर्णन कैसे तीन उत्पंन करने के लिए आयामी अग्नाशय organoids, pancreatoids, असंबद्ध e 10.5 murine अग्नाशय progenitors से, शब्द । इन pancreatoids को बनाए रखने के मूल mesenchyme, स्व-मुक्त अस्थायी स्थितियों में इकट्ठा, और अंत: स्रावी बीटा कोशिकाओं की एक मजबूत संख्या सहित सभी प्रमुख अग्नाशय कोशिका प्रकार, उत्पन्न19. यह दृष्टिकोण सबसे अच्छा अंत में स्रावी विकास के विश्लेषण के लिए अनुकूल है, पिछले प्रोटोकॉल के रूप में मजबूत अंत में अंतर विभेदक कमी. हालांकि, Greggio एट अल द्वारा वर्णित के रूप में अग्नाशय organoids के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग कर. बेहतर अग्नाशय उपकला शाखाओं और morphogenesis के विश्लेषण के लिए अनुकूल है, के रूप में शाखाओं में अधिक pancreatoids में सीमित है ।

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Protocol

इस पद्धति में वर्णित सभी पशु प्रयोगों को Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन की संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने अनुमोदित किया था ।

1. माउस भ्रूण दिवस की तैयारी १०.५ अग्नाशय Progenitors

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए कदम 2 जब तक बाँझ शर्तों के तहत पीछा किया जा की जरूरत नहीं है, लेकिन यह विच्छेदन उपकरण और ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे से पहले का उपयोग करने के लिए बंध्याकरण इष्टतम है ।

  1. विच्छेदन के लिए स्थापित करने के लिए, एक बर्फ बाल्टी भरने और बर्फ में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के एक कंटेनर जगह है । साफ दो ठीक इत्तला दे दी संदंश और ७०% इथेनॉल के साथ विच्छेदन कैंची । विच्छेदन क्षेत्र के पास सेट करें, एक कंटेनर के साथ कम तीन borosilicate केशिका ट्यूबों, एक मुंह पिपेट, एक हल्का, और फ़िल्टर्ड १,००० µ l पिपेट युक्तियाँ.
    1. १.२५ मिलीग्राम/एमएल ठंड dispase के कम से 1 मिलीलीटर तैयार निष्फल पानी और बर्फ पर एक 12 अच्छी तरह से थाली के दूसरे कुआं में जगह में पतला । 12 खैर प्लेट के पहले, तीसरे और चौथे कुएं में पंजाबियों रखो । बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ०.०५% Trypsin की 1 मिलीलीटर प्लेस । पूर्व गर्म एक मिलाते हुए मशीन के लिए ३७ ओसी ।
  2. Euthanize e 10.5 समय-IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार गर्भवती चूहों । ७०% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे कैंची और संदंश का उपयोग कर माउस के जननांग क्षेत्र में एक वी के आकार का चीरा बनाने से पहले इस क्षेत्र को साफ करने और यह डायाफ्राम तक जारी है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में एक योनि प्लग की उपस्थिति दिन ०.५ इंगित करता है । 5-6 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग करना, 2 से अधिक जी का वजन सफल गर्भवती के एक द्वितीयक उपाय के रूप में कार्य करता है ।
    1. ध्यान से गर्भाशय के ऊपरवाला पार्श्व भागों में एक चीरा बनाने, अंग ऊपर की ओर खींच माउस से दूर, और विपरीत पक्ष पर दोहराने से पहले जननांग क्षेत्र के लिए नीचे इस चीरा पीछा करने के लिए उत्पाद । इसे ठंडे पंजाबियों के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में लगाएं ।
      नोट: यह e 11.5 असंबद्ध कोशिकाओं से organoids प्राप्त करने के लिए संभव है, लेकिन ई 10.5 pancreatoids के विपरीत, इन organoids अभी तक विशेषता नहीं कर रहे है और इस तरह के सभी तीन प्रमुख अग्नाशय वंश में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने नहीं हो सकता है ।
  3. एक प्रकाश विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, पेट्री पकवान जगह और ध्यान से प्रत्येक भ्रूण के बीच दो संदंश रखकर और ऊतक छील दूर की जर्दी थैली से गर्भाशय के ऊतकों को खोलने । संदंश और ताजा, ठंडे पंजाबियों के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश में जगह के साथ धीरे से जर्दी थैली लोभी द्वारा भ्रूण स्थानांतरण । पेट्री डिश को बर्फ पर लगाएं ।
    नोट: यह heedfully निकालने के लिए महत्वपूर्ण है, अधिमानतः जर्दी थैली के भीतर बनाए रखा, जबरदस्ती हटाने के रूप में गर्भनाल खींच सकते हैं, भ्रूण के ऊतक तेजस्वी और संरचनात्मक अखंडता समझौता ।
  4. जगह एक 10 सेमी पेट्री डिश ढक्कन पर कई पंजाबियों बूंदें । extraembryonic ऊतकों दृश्यता सुनिश्चित करने के लिए हटा रहे हैं के रूप में विच्छेदन के दौरान भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए इन बूंदों का प्रयोग करें एक पंजाब छोड़ करने के लिए एक भ्रूण हस्तांतरण और धीरे संदंश का उपयोग करके जर्दी थैली से हटाने के लिए, जबकि शेष भ्रूण बर्फ पर पंजाब में रहने (चित्रा 1) । एक नया पंजाबियों संदंश का उपयोग कर ड्रॉप करने के लिए भ्रूण को हल्के से भ्रूण स्कूप को ले जाने से पहले सिर हटा दें, ऊतक नुकसान नहीं (चित्रा 1बी) ।
    नोट: ऊतक ताजा पंजाबियों के लिए अधिक बार हस्तांतरित की जरूरत हो सकती से यहां वर्णित, तरल की अस्पष्टता पर निर्भर करता है ।
    1. एक नया पंजाब छोड़ में, संदंश (चित्रा 1बी) का उपयोग कर forelimb कलियों को हटा दें । जहां अंग कली मौजूद थी और धीरे केवल सबसे बाह्य ऊतक पूर्वकाल (चित्रा 1बी) आंसू खोलने में संदंश प्लेस । घुमाएं भ्रूण और पीछे की दिशा में दोहराने, hindlimb कली पर रोक । इस बिंदु पर, जठरांत्र संबंधी मार्ग (चित्रा 1बी) दिखाई जानी चाहिए ।
    2. जठरांत्र संबंधी मार्ग के पीछे क्षेत्र में एक मामूली मोड़ (चित्रा 1F) है । जठरांत्र संबंधी मार्ग और शरीर की दीवार के रीढ़ की हड्डी क्षेत्र के बीच खोलने में इस मोड़ के पीछे संदंश डालें । जठरांत्र संबंधी मार्ग अलग-धीरे ऊपर की ओर काम जब तक सबसे पूर्वकाल क्षेत्र तक पहुंच जाता है जहां कार्डियक क्षेत्र (चित्रा 1बी-ई) जोड़ता है ।
      वैकल्पिक: मौलिक दिल और जठरांत्र संबंधी मार्ग के ventral क्षेत्रों से जिगर कलियों को दूर, केवल सतत आंत ट्यूब छोड़ने. पहले कुछ समय इस प्रोटोकॉल यह आसान हो सकता है ventral स्थलों के रूप में दिल और जिगर को छोड़ जठरांत्र संबंधी मार्ग और पृष्ठीय अग्नाशय कली की आकृति विज्ञान और अधिक परिचित है (चित्रा 1सी और डी ).
    3. ताजा पंजाबी छोटी बूंद को जठरांत्र संबंधी मार्ग हस्तांतरण ।
    4. संदंश ले लो और धीरे से फैला हुआ कली और आंत के नीचे ऊतक चुटकी और थोड़ा बाहरी ऊतक (चित्रा 1डी एफ) से उठा ।
      नोट: पृष्ठीय अग्नाशय कली पेट और आंत के बीच स्थित है (चित्रा 1सी-जी) । अग्नाशय की कली के नीचे एक गोल, खुरदरा संरचना (चित्रा 1जी) की तरह दिखना चाहिए ।
    5. संदंश जहां कली आंत को जोड़ता है और ऊपर की ओर चुटकी कली (चित्रा 1जी) ढीला करने के लिए जगह है । बर्फ पर ठंडे पंजाब में 12 अच्छी तरह से थाली के पहले कुआं में कली स्थानांतरित करने से पहले एक नया पंजाब बुलबुले में एक बार धो लो । दोहराएँ जब तक सभी कलियों भ्रूण से एकत्र कर रहे हैं और 12 अच्छी तरह से थाली के पहले अच्छी तरह से रखा.
  5. प्रकाश विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 12 अच्छी तरह से पकवान रखें । बाद में विभाजित अनुपात की गणना करने के लिए सफलतापूर्वक विच्छेदित अग्नाशय कलियों की संख्या की गणना ।
    1. मुंह पिपेट में एक फ़िल्टर १,००० µ एल पिपेट टिप एक केशिका ट्यूब संलग्न के साथ प्लेस । लौ केशिका ट्यूब निष्फल और उपयोग में आसानी के लिए ट्यूब में एक मोड़ बनाने के लिए । दूसरी अच्छी तरह से स्वच्छ पंजाबियों (चित्रा 1जी) के साथ तीसरे को स्थानांतरित करने से पहले 2 मिनट के लिए ठंड dispase समाधान युक्त के लिए कलियों हस्तांतरण केशिका का प्रयोग करें ।
      नोट: dispase से पंजाब के लिए कलियों स्थानांतरित करते हुए, केशिका ट्यूब की नोक करने के लिए ऊतक को छूने से बचें । यदि ऊतक ट्यूब की नोक पर अटक जाता है, पिपेट ऊपर और नीचे या साफ पंजाबियों समाधान में हिला जब तक ढीला ।
    2. पिपेट कलियों ऊपर और नीचे, और साफ पंजाबियों के साथ चौथी अच्छी तरह से हस्तांतरण । अंत में, ०.०५% Trypsin के साथ १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए केशिका डिवाइस स्थानांतरण कलियों का उपयोग करना । पूर्व में ट्यूब प्लेस गरम ३७ ओसी शेखर और 4 मिनट के लिए १,५०० rpm पर हिला ।
    3. लगभग 10 एस के लिए भंवर तो तुरंत एक केंद्रापसारक में ट्यूब प्लेस और 5 मिनट के लिए स्पिन २०० g. सभी लेकिन लगभग ५० समाधान के µ एल हटाने के रूप में सावधानी से केंद्रापसारक कोशिकाओं को परेशान नहीं (चित्रा 1जी) ।

2. संवर्धन असंबद्ध Progenitors को फार्म Pancreatoids

नोट: निम्नलिखित एक मानक ऊतक संस्कृति हुड में एक बाँझ वातावरण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, मानक बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग.

  1. हर कली एकत्र के लिए, जोड़ें ४०० µ l organogenesis मीडिया16,17 (तालिका 1) के लिए केंद्रापसारक कोशिकाओं. पल्स भंवर तीन बार और प्लेट १०० µ एल के प्रति अच्छी तरह से एक कम लगाव ९६ खैर प्लेट, बंटवारे कलियों पर एक 1:4 अनुपात (चित्रा 1जी).
  2. असंबद्ध कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से तैरते (चित्रा 1एच) कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत जाँच करें । मध्यम गति से एक झूली कुरसी पर 5% CO2 के साथ एक ३७ ओसी मशीन में संस्कृति पकवान प्लेस ।
  3. दैनिक pancreatoids की प्रगति पर नजर रखें । ताजा मीडिया के १०० µ एल के साथ बदलें हर 3 दिन, ध्यान से डाकू में सूक्ष्म नियंत्रण के तहत मीडिया pipetting को हटाने के लिए, जबकि अच्छी तरह से pancreatoid छोड़ने । वैकल्पिक रूप से, ताजा १०० µ एल मीडिया के एक नए अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है और pancreatoid मुंह पिपेट और १००० µ l फ़िल्टर पिपेट टिप से जुड़ी borosilicate केशिका ट्यूब का उपयोग कर हस्तांतरित ।

3. Immunofluorescent इमेजिंग के लिए प्रोसेसिंग Pancreatoids

  1. immunofluorescent छवियों के लिए pancreatoids प्रक्रिया करने के लिए, पहले 4% paraformaldehyde/पंजाब, पीएच 7.4 (पीएफए) समाधान तैयार करें । प्लेस ५० एक ९६ अच्छी तरह से थाली के कुओं में 4% पीएफए के µ एल ।
    1. १,००० µ एल पिपेट टिप के साथ borosilicate केशिका ट्यूबों और मुंह पिपेट का उपयोग करना, संस्कृति माध्यम से pancreatoids स्थानांतरण के रूप में संभव के रूप में छोटे मीडिया के साथ अच्छी तरह से 4% पीएफए में ले । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर झूली कुरसी पर सेट करें ।
    2. pancreatoids 4% पीएफए से एक अच्छी तरह से ताजा पंजाबियों के १०० µ एल के साथ स्थानांतरण, 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक । तीन ताजा पंजाबियों की कुल के लिए दोहराएं बहाकर ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है, pancreatoids के साथ 4 ओसी पर पंजाब के १०० µ एल में संग्रहीत करने के लिए एक सप्ताह के लिए ।
  2. wholemount इमेजिंग के लिए (अनुशंसित अगर एंटीबॉडी उपयुक्त हैं, धारा ३.३ में वैकल्पिक दृष्टिकोण. और ३.४ में माइक्रोस्कोप.), पंजाब से ५० µ एल में हस्तांतरण 5% गधा को ब्लॉक करने के लिए ०.१% ईओण डिटर्जेंट (PBST) के साथ 1x पंजाब में सीरम । 4 पर रात भर रॉक ओसी या वैकल्पिक रूप से कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए ।
    1. एक नया अच्छी तरह से प्राथमिक pancreatoids में 5% गधा सीरम के ५० µ l में पतला युक्त एंटीबॉडी के लिए स्थानांतरण 1x PBST में । इष्टतम, 24 के लिए रॉक 4 ओसी में (कम से कम 12 ज लेकिन ३६ ज तक) ।
      नोट: Chga (1:100), DBA (1:400), विम (1:400), और Pdx1 (1:100) के खिलाफ सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध एंटीबॉडी wholemount धुंधला के लिए उपयुक्त हैं; अंय एंटीबॉडी अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. एक अच्छी तरह से युक्त करने के लिए pancreatoids स्थानांतरण ताजा PBST के १०० µ एल धोने और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए रॉक । कुल तीन ताजा PBST बहाकर के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
    3. pancreatoids एक नया अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी ५० µ एल में 5% गधा सीरम का 1x PBST में पतला से युक्त स्थानांतरण । 4 ओसी में प्रकाश और जगह से प्लेट की रक्षा, बेहतर 24 घंटे के लिए कमाल (कम से 12 घंटे लेकिन ३६ ज तक) ।
      नोट: सभी माध्यमिक सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध एंटीबॉडी और DAPI परमाणु counterstain wholemount धुंधला के लिए उपयुक्त हैं ।
    4. एक नया अच्छी तरह से १०० µ एल के लिए कमरे के तापमान पर 1x PBST और रॉक के 30 min. 1x PBST में तीन बहाकर की कुल के लिए दोहराने के लिए pancreatoids स्थानांतरण । तीसरे और अंतिम वॉश में, ३०० एनएम DAPI जोड़ें ।
    5. अंत में, साफ पंजाब के १०० µ एल में जगह और 4 ओसी पर दुकान के लिए प्रकाश से संरक्षित फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा इमेजिंग से पहले एक सप्ताह के लिए, हालांकि सबसे अच्छा परिणाम धुंधला के बाद तुरंत इमेजिंग से आते हैं । इमेजिंग के दौरान pancreatoids के आंदोलन को रोकने के लिए, लेकिन बाहर सुखाने को रोकने के लिए, एक 20 µ एल छोटी बूंद में पंजाबियों की जगह प्रत्येक pancreatoid । अगर pancreatoids अब भी नहीं रहते हैं, तो पंजाब की मात्रा कम करें ।
  3. जमे हुए वर्गों के लिए, पंजाब से 30% सुक्रोज समाधान में रात भर 4 ओसी पर स्थानांतरण pancreatoids ।
    1. किसी विच्छेदन माइक्रोस्कोप के अंतर्गत किसी बबल में एंबेडिंग मीडिया जोड़ें । सूक्ष्म नियंत्रण के तहत संदंश का प्रयोग, धीरे embedding मीडिया के माध्यम से कई बार जमे हुए एंबेडिंग मीडिया के साथ एक ऊतक ब्लॉक करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले अवशिष्ट सुक्रोज को दूर धक्का द्वारा pancreatoids सोख ।
    2. सूखी बर्फ पर जमे हुए है और 8 µm पर cryostat पर अनुभाग तक ऊतक ब्लॉक प्लेस ।
      नोट: अनुभागों पर संग्रहित किया जा सकता-८० oC या immunostained तुरंत ।
    3. से अनुभागों की अनुमति दें-८० oC के लिए कमरे के तापमान पर लगभग 5 मिनट के लिए सूखी जब तक गल । ऊतक के आसपास hydrophobic पीएपी कलम का उपयोग कर एक hydrophobic बाधा ड्रा और 5% गधा कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1x PBST में पतला सीरम का उपयोग कर ब्लॉक ।
    4. मीडिया निकालें और प्राथमिक 5% गधा में पतला एंटीबॉडी के साथ तुरंत बदलने की जगह 4 ओसी पर रात में 1x PBST में पतला ।
    5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBST के साथ प्राथमिक समाधान और धोने के ऊतकों को तीन बार निकालें । इसके बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें 5% गधा सीरम में पतला 1 ज के लिए 1x PBST में कमरे के तापमान पर पतला और प्रकाश से स्लाइड की रक्षा ।
    6. माध्यमिक समाधान निकालें और 10 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBST में तीन बार धो स्लाइड । अंतिम धोने में, ३०० एनएम DAPI जोड़ें ।
    7. मीडिया निकालें और बढ़ते मीडिया और एक coverslip जोड़ें । स्लाइड को प्रकाश से दूर 4 oC में जब तक तैयार छवि को स्टोर ।

4. प्रतिलेखनी विश्लेषण के लिए Pancreatoids से आरएनए का अलगाव

  1. borosilicate केशिका pancreatoids एक फ़िल्टर १,००० µ एल पिपेट टिप के साथ एक मुंह पिपेट से जुड़ी का उपयोग कर लीजिए, बांझपन के लिए और जगह में ५०० µ एल के एसिड guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म समाधान एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । पर स्टोर-८० ओसी या आरएनए अलगाव के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
  2. शाही सेना अलगाव के लिए, बर्फ पर गल नमूने यदि आवश्यक हो और क्लोरोफॉर्म के १०० µ एल जोड़ें । भंवर अच्छी तरह से और 4 ओसी में जगह 15 मिनट के लिए पूर्व शांत एक केंद्रापसारक 4 ओसी ।
    1. में जगह ट्यूबों केंद्रापसारक और 20 मिनट के लिए स्पिन १२,००० g पर 4 oC ।
    2. ध्यान से परतों की जुदाई परेशान नहीं करने के लिए ट्यूबों को दूर । एक २०० µ एल पिपेट का प्रयोग, एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्पष्ट जलीय समाधान और जगह ले लीजिए, एक छोटी राशि के पीछे छोड़ने के लिए सफेद प्रोटीन परत और गुलाबी डीएनए परत से बफर । इस प्रक्रिया में कुछ भी करने के लिए पिपेट के टिप स्पर्श नहीं है और १.५ मिलीलीटर ट्यूब की दीवारों को छूने नहीं है ।
    3. जोड़ें १००% isopropanol के ५०० µ जलीय परत और भंवर युक्त नई ट्यूब के लिए एल । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं, अब बर्फ पर, या अधिकतम तेज़ी के लिए रात भर छोड़-20 ओसी ।
    4. 15 मिनट के लिए 4 ओसी पर १२,००० जी को आरएनए गोली पर केंद्रापसारक । गोली परेशान बिना isopropanol निकालें ।
      नोट: के रूप में pancreatoids छोटे हैं, यह संभावना गोली दिखाई नहीं होगा ।
    5. ठंड जोड़ें, ७५% इथेनॉल और कई बार ट्यूब पलटना । केंद्रापसारक में प्लेस और ९,००० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी स्पिन 4 oC. इथेनॉल को दूर करने और 2 मिनट के लिए स्पिन ९,००० x g पर ।
    6. का प्रयोग करें एक २०० µ l पिपेट ट्यूब में किसी भी शेष इथेनॉल को हटाने के लिए, इस क्षेत्र से संपर्क के बिना गोली अंदर रहता है छोड़ टोपी कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए ट्यूब पर खुला अवशिष्ट इथेनॉल के वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए ।
    7. साफ, nuclease मुक्त पानी की 20 µ एल में भंवर द्वारा में गोली reसस्पेंड ।
      वैकल्पिक: 3 मिनट के लिए ६५ ओसी पर आरएनए गर्मी और तुरंत बर्फ के लिए वापस । आरएनए-८० ओसी पर संग्रहित किया जा सकता है या रिवर्स प्रतिलेखन और qPCR के लिए तुरंत इस्तेमाल किया ।

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Representative Results

सावधान माउस भ्रूण के गर्भाशय के हॉर्न से 10.5 ई में विच्छेदन आगे विच्छेदन के लिए पंजाब में नुकसान हुआ भ्रूण उपज (चित्रा 1ए) चाहिए । जठरांत्र संबंधी मार्ग कुशलतापूर्वक भ्रूण से हटाया जा सकता है (चित्रा 1बी), आंत और पेट के जंक्शन पर पृष्ठीय अग्नाशय कली के प्रभेद की अनुमति (चित्रा 1सी-एफ) । ई 10.5 अग्नाशय कली पहले की विशेषता हो गया है; progenitors को Pdx1, Sox9, Ptf1a, और Hes120,21,22,23को व्यक्त करना चाहिए । निंनलिखित ऊतक प्रसंस्करण कदम, असंबद्ध अग्नाशय एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के छोटे समूहों प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1जी-एच) द्वारा visualized किया जा सकता है ।

organogenesis मीडिया में, इन मुक्त फ्लोटिंग, पाड़ मुक्त कोशिकाओं को स्वयं इकट्ठा और तीन आयामी pancreatoids है कि बढ़ने और संस्कृति (चित्रा 2ए) में कम से दस दिनों के लिए जारी रहती है में व्यवस्थित । pancreatoids morphogenesis होने वाली शाखाओं के साथ, vivo में अग्ंयाशय के लिए रूपात्मक समानताएं हैं । ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करना, विभिन्न प्रकार के सेल या प्रक्रियाओं वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है. उदाहरण के लिए, Ins1-eGFP24 चूहों का उपयोग करते हुए अंत में बीटा कोशिकाओं के गठन को चिह्नित करने के लिए, pancreatoids बीटा सेल विकास (चित्रा 2बी) कल्पना करने के लिए दैनिक में imaged किया जा सकता है । इसके अलावा, संस्कृति की स्थिति में फेरबदल करके, छोटे अणुओं, दवाओं, या जीनोम जोड़ तोड़, न केवल सेल भाग्य निर्धारण कर सकते है मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन संरचना और आकृति विज्ञान में परिवर्तन भी जांच की जा सकती है । यहां हम प्रोटीन कळेनासे सी उत्प्रेरक phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) उच्च सांद्रता (१६० एनएम) है, जो pancreatoids के विकास की आकृति विज्ञान में परिवर्तन के आवेदन दिखाने के लिए, ढीले जुड़े उपकला कोशिकाओं को अग्रणी और बढ़ बंटी १९ (चित्रा २सी).

अग्नाशय उपकला कोशिकाओं के साथ अग्नाशय mesenchyme ऊतक के संघ का आकलन करने के लिए, immunostaining प्रत्येक ऊतक के मार्कर के लिए किया जा सकता है. वाहिनी मार्करके Immunostaining, DBA25,26, एक अंत-स्रावी मार्कर के साथ, Chga27, और नाभिक DAPI में बहु वंशावली गठन से पता चलता है pancreatoids (चित्रा 3) । एक mesenchyme मार्कर, Vimentin, एक अग्नाशय जनक मार्कर के साथ सह दाग (ई 9.0 से लगभग ई 15.5 के लिए) Pdx1, पता चलता है कि mesenchyme pancreatoid (चित्रा 3बी) ढंक लेती है । Immunostaining भी की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आकृति विज्ञान, Pdx1 खुलासा शाखाओं के साथ, के रूप में अच्छी तरह से रुचि के सेल प्रकार के विभिंन मार्करों । चित्रा 3मेंसी, हम उपकला मार्कर Pdx1 और बीटा सेल मार्कर आईएनएस के लिए दाग द्वारा बीटा सेल विकास की कल्पना. qPCR विश्लेषण का उपयोग करना, progenitors के टेप और कोशिकाओं अंतर जनक जीन के रूप में एक आकलन किया जा, Pdx1 और Hes1, और विभेदित मार्करों Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, और Ins1 (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: pancreatoid पीढ़ी के लिए विच्छेदन, पृथक्करण, और ई 10.5 अग्नाशय progenitors के चढ़ाना की रूपरेखा। (क) ई 10.5 भ्रूण की brightfield छवि । (ख) विच्छेदन प्रक्रिया की योजनाबद्ध, शीर्ष बाएं से शुरू । हरे क्षेत्र जठरांत्र संबंधी मार्ग है, जबकि लाल, धराशायी लाइनों क्षेत्रों में कटौती करने के लिए संकेत मिलता है । सबसे पहले, सिर forelimb कलियों को हटाने और जीव के पक्ष के उद्घाटन के बाद हटा दिया जाता है । (ग) जठरांत्र संबंधी मार्ग ध्यान से हटा दिया है, दिल और जिगर पथ के ventral क्षेत्र से फैला कलियों के साथ । पेट, पृष्ठीय अग्नाशय कली, और आंत visualized किया जा सकता है, के रूप में brightfield छवि में दिखाया गया है । (घ) दिल और जिगर की कलियों को हटाना । योजनाबद्ध बाईं ओर है और brightfield छवि दाईं ओर है । (ङ) पृष्ठीय अग्नाशय कली के चारों ओर ऊतक की चुटकी के लिए विच्छेदन के लिए कली बेनकाब । योजनाबद्ध बाईं ओर है और brightfield छवि दाईं ओर है । (च) brightfield माइक्रोस्कोपी के तहत पृष्ठीय अग्नाशय कली के साथ जठरांत्र संबंधी मार्ग । बाईं तरफ की छवि में, आंत में मोड़ दिखाई देता है, जहां संदंश जब रीढ़ की हड्डी क्षेत्र से जठरांत्र संबंधी मार्ग अलग रखा जा सकता है । सही पर, उच्च आवर्धन brightfield छवि दोनों पृष्ठीय और ventral अग्नाशय कलियों से पता चलता है । (छ) पृष्ठीय अग्नाशय कली और पृथक्करण से पहले ऊतक के प्रसंस्करण के हटाने, organogenesis मीडिया में resuspension, और चढ़ाना । (ज) brightfield छवि असंबद्ध कोशिकाओं को तुरंत चढ़ाना के बाद दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : समय के साथ pancreatoids निगरानी । (क) 1 दिन, दिन 2, और 3 दिन में pancreatoids के Brightfield छवियां । स्केल बार्स = 100 um । (ख) अग्नाशय morphogenesis की जांच करने के लिए संस्कृति की स्थिति में हेरफेर । यहाँ, पमा के उच्च स्तरों के अतिरिक्त, 1 और 2 दिन में brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा विज़ुअलाइज़ की गई उपकला संरचना को ढीला कर दिया जाता है और बंटी बढ़ जाती है । स्केल पट्टियां = १०० µm. (C) Ins1-eGFP माउस pancreatoids 4, दिन 5, दिन 6, दिन 7, और 9 दिन, बीटा कोशिकाओं के विकास के साथ हरे रंग में eGFP द्वारा दर्शाया गया है । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : Immunostaining of pancreatoids. (क) Immunostaining pancreatoid 5 दिन में DBA लाल, अंत में Chga द्वारा कोशिकाओं को हरे रंग में नलिकाओं को चिह्नित करने के लिए, और नाभिक नीले रंग में DAPI द्वारा चिह्नित । (ख) Immunostaining 7 दिन में pancreatoid को लाल और अग्नाशय progenitors में Vimentin द्वारा mesenchyme को हरे रंग में Pdx1 करके मार्क करने के लिए । (ख) Immunostaining pancreatoid में इंसुलिन द्वारा बीटा कोशिकाओं को मार्क करने के लिए लाल और अग्नाशय progenitors में Pdx1 द्वारा हरे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रतिलिपि विश्लेषण । मात्रात्मक पीसीआर दिन के 7 progenitors और अंतर कोशिकाओं के मार्कर के लिए pancreatoids । vivo murine टिशू में तुलना Scavuzzo एट अल में दिखाया गया है । (२०१७). परिणाम Gapdhको सामान्यीकृत कर रहे हैं । N = 2, स्केल बार्स SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

घटक संक्षिप्तिकरण अंतिम एकाग्रता
पेनिसिलिन-Streptomycin पी एस/ 1
FBS-नि: शुल्क मीडिया अनुपूरक 10
बीटा-Mercaptoethanol bME ०.१ एमएम
Phorbol 12-Myristate 13-एसीटेट Pma 16 एनएम
Y-२७६३२ या रॉक अवरोधक आरआई 10 uM
एपिडर्मल वृद्धि कारक Egf 25 एनजी एमएल/
आर-Spondin1 - ५०० एनजी/
अम्लीय Fibroblast वृद्धि कारक, Fibroblast वृद्धि कारक 1 aFGF, FGF1 25 यूजी/एमएल
हेपरिन सोडियम साल्ट हेपरिन 2 यू एमएल/
Fibroblast ग्रोथ फैक्टर 10 FGF10 १०० एनजी/
Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/ DMEM/F12 से 5 मिलीलीटर

तालिका 1. Organogenesis मीडिया ।

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Discussion

सेल संस्कृति मॉडल की प्रगति ठीक से मॉडल विकास के लिए महत्वपूर्ण है, चिकित्सकीय प्रासंगिक सेल प्रकार, परीक्षण दवा प्रभावकारिता, या यहां तक कि रोगियों के लिए प्रत्यारोपण का उत्पादन । हालांकि, कृत्रिम रूप से एक डिश में recapitulating विकास चुनौतीपूर्ण है के रूप में हम अभी भी vivo में organogenesis और फिजियोलॉजी के तंत्र को समझने से दूर कर रहे हैं । इस प्रकार इन विट्रो में कोशिकाओं को अकुशल रूप से उत्पन्न कर रहे हैं, पूरी तरह कार्यात्मक नहीं, समय की लंबी अवधि के लिए बनाए रखा जा करने में असमर्थ, या शरीर में तुलनीय कोशिकाओं से बंदरगाह अन्य असामान्यताओं. ऐसा इसलिए है क्योंकि जटिल morphogenetic परिवर्तन विकास और फिजियोलॉजी को प्रभावित करने के लिए होते हैं, जबकि कई विभिन्न प्रकार के सेल बातचीत । इन विट्रो प्रणालियों में की सुविधा के संयोजन के द्वारा विकास कैसे आय की समझ प्राप्त करते हुए vivo विकास में की जटिलता को बनाए रखने जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करेगा.

organoids के विकास के विकास की जटिलताओं मॉडलिंग की दिशा में एक आशाजनक एवेंयू है । इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे अग्नाशय organoids बनाने के लिए रूपरेखा, pancreatoids, जो देशी mesenchyme को बनाए रखने और मजबूती से अंत में स्रावी कोशिकाओं उत्पन्न, हालांकि pancreatoids ग्लूकोज जवाबदेही प्रदर्शित नहीं करते. इस उपकरण के विकास के तंत्र की जांच के साथ ही एक संस्कृति प्रणाली है कि vivo मेंपाया ऊतक के विविधता बनाए रखने में कार्यशीलता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, यह आनुवंशिक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या छोटे अणुओं या दवाओं स्क्रीन । यह विशेष रूप से दिलचस्प है, के रूप में अपेक्षाकृत समरूप सेल संस्कृति प्रणालियों में उंमीदवार परीक्षण इन यौगिकों के अंय निकट संबंधित कोशिका प्रकार पर प्रभाव दरकिनार कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल के दौरान कई महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, गर्भाशय से भ्रूण के सावधान हटाने जबरदस्ती पेट क्षेत्र चीर कर सकते है और यह मुश्किल करने के लिए जठरांत्र संबंधी मार्ग विचार करने के लिए अग्नाशय की कली (१.३ कदम) प्राप्त करने के रूप में महत्वपूर्ण है । दूसरा, जठरांत्र संबंधी मार्ग से अग्नाशय कली की साफ विच्छेदन महत्वपूर्ण है, के रूप में अतिरिक्त ऊतक लेने के अंय कोशिका प्रकार (step 1.4.4) के भेदभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ऐसा करने के लिए, यह अग्नाशय कली नीचे चुटकी करने के लिए महत्वपूर्ण है और ओवरले ऊतक उठा अग्नाशय कली को अलग करने से पहले. अंत में, जब dispase से वापस पंजाबियों को धोने के लिए कलियों चलती, यह एक borosilicate केशिका ट्यूब का उपयोग करने के लिए और ऊतक ट्यूब खोलने के किनारे को छूने नहीं करने के लिए आवश्यक है, अन्यथा, ऊतक ट्यूब के टिप करने के लिए छड़ी जाएगा (step 1.5.1). इस से बचने के लिए, बड की ओर जाने से पहले मुंह pipetting समाधान शुरू, कली ट्यूब में जाने के बजाय बाहर पर की अनुमति ।

इस विधि एक 3 डी pancreatoid में अंत में स्रावित कोशिकाओं के गठन की अनुमति देता है, हालांकि, उपकला शाखाओं में अन्य मौजूदा प्रोटोकॉल16,17से अधिक सीमित है. इसके अलावा, जबकि इंसुलिन का उत्पादन अंत में स्रावी कोशिकाओं के रूप में, वे ग्लूकोज जवाबदेही प्रदर्शित नहीं करते. इस प्रकार, इन कोशिकाओं की परिपक्वता में आगे की जांच दोनों कार्यात्मक pancreatoids की पीढ़ी में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा और साथ ही सामांय में बीटा सेल पीढ़ी के क्षेत्र में ।

pancreatoids की पीढ़ी है कि अंत में स्रावी कोशिकाओं का विकास, और, भविष्य में, कि ग्लूकोज जवाबदेही प्राप्त, मधुमेह के उपचार के लिए संभावित प्रभाव है. मधुमेह अपक्षयी चिकित्सा के लिए एक प्रधान उंमीदवार है, के रूप में अग्नाशय के बीटा कोशिकाओं खो रहे है या बेकार और इन कोशिकाओं की जगह संभावित रोग जटिलताओं को कम कर सकते हैं । प्रगति बीटा कोशिकाओं में hPSCs अंतर में किया गया है, तथापि, मधुमेह में, वहाँ अक्सर बीटा कोशिकाओं के साथ अग्न्याशय में अन्य कोशिका प्रकार के लिए रोग हैं, अल्फा कोशिकाओं या कोष्ठकी कोशिकाओं सहित28,29, 30,31,३२. इस प्रकार, प्रत्यारोपण के लिए नई अग्नाशय के ऊतकों का उत्पादन पूरी तरह से पीड़ित ऊतक की जगह कर सकते हैं । murine pancreatoid गठन और कामकाज की अतिरिक्त जांच के साथ, विकासात्मक पथ hPSCs से बाहर मानव pancreatoids उत्पंन करने के लिए नकल उतारा जा सकता है । इन मानव pancreatoids व्यक्तिगत दवा के लिए एक रोगी विशेष संदर्भ में दवाओं के लिए जवाबदेही के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अपक्षयी चिकित्सा के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सहायक प्रोटोकॉल और पांडुलिपि के बारे में चर्चा के लिए Jolanta Chmielowiec धंयवाद । हम भी फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग के लिए बिंयामीन Arenkiel धंयवाद । इस कार्य को NIH (P30-DK079638 को M.B. और T32HL092332-13 को M.A.S. और M.B.), McNair मेडिकल फाउंडेशन (M.B. को), और फोकल कोर को बीसीएम बौद्धिक और विकासात्मक विकलांग अनुसंधान केंद्र (NIH U54 HD083092 से Eunice) द्वारा समर्थित किया गया कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

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विकास जीवविज्ञान अंक १३६ अग्ंयाशय Organoids बीटा कोशिकाओं विकास Mesenchyme भेदभाव मधुमेह 3 डी संस्कृति Pancreatoids
पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors <em>इन विट्रो में</em> की पीढ़ी
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Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

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